Kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần

I, Protoplast là gì? Thế nào là lai tế bào soma? II, So sánh đặc điểm nuôi cấy tế bào trần với nuôi cấy tế bào vẫn còn thành. III, Các kỹ thuật cụ thể 1, Kỹ thuật tách tế bào trần 2, Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần 3, Kỹ thuật dung hợp tế bào trần IV, Triển vọng ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần và lai tế bào soma 1. Triển vọng của phương pháp nuôi cấy và dung hợp tế bào trần là rất lớn 2. Một số ứng dụng khác V, Tồn tại của kỹ thuật protoplast VI, Quy trình cụ thể minh họa việc nuôi cấy và dung hợp tế bào trần

Tiểu luận: KỸ THUẬT NUÔI CẤY VÀ DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN Nhóm 12 MỤC LỤC A, ĐẶT VẤN ĐỀ B, NỘI DUNG I, Protoplast gì? Thế lai tế bào soma? II, So sánh đặc điểm nuôi cấy tế bào trần với nuôi cấy tế bào thành III, Các kỹ thuật cụ thể 1, Kỹ thuật tách tế bào trần 2, Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần 3, Kỹ thuật dung hợp tế bào trần IV, Triển vọng ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần lai tế bào soma Triển vọng phương pháp nuôi cấy dung hợp tế bào trần lớn Một số ứng dụng khác V, Tồn kỹ thuật protoplast VI, Quy trình cụ thể minh họa việc nuôi cấy dung hợp tế bào trần C, KẾT LUẬN A ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với công nghệ gene, công nghệ nuôi cấy mô tế bào ngày phát triển sử dụng rộng rãi sản xuất nông nghiệp Công nghệ nuôi cấy mô có vai trò quan trọng việc tạo giống trồng không bị nhiễm bệnh, tạo nguồn nguyên liệu di truyền phong phú hay sản phẩm chuyển gen mang đặc tính mong muốn, cho phép mở rộng nguồn gen loài thực vật, tạo dòng tế bào sản xuất mang đặc tính di truyền ưu việt bố mẹ Một kỹ thuật để chứng minh điều “kỹ thuật nuôi cấy dung hợp tế bào trần” Kỹ thuật nuôi cấy dung hợp tế bào trần bắt đầu ứng dụng rộng rãi để tạo trồng có sản lượng chất lượng cao hơn, có thêm khả kháng bệnh Tế bào trần sử dụng rộng rãi nhiều lình vực thí nghiệm từ nghiên cứu tính chất vật lý màng sinh chất đến nghiên cứu nhập bào hấp thu phần tử, bào quan vi sinh vật Sau tìm hiểu kỹ vấn đề B NỘI DUNG I, Protoplast gì? Thế lai tế bào soma?  protoplast Tế bào trần (protoplast) tế bào thực vật bị tách bỏ thành tế bào, màng sinh chất bao bọc khối tế bào chất nhân tế bào Tế bào trần tách từ mô quan khác lá, rễ, mô sẹo nuôi cấy in vitro Tế bào trần tạo bằng nhiều cách: từ dịch huyền phù tế bào, tế bào mô sẹo từ mô tươi nguyên trạng qua tác động enzyme: Pectinase phân hủy pectin, celluloase phân hủy cellulose, hemicellulase phân hủy hemicellulose Đặc điểm tế bào trần để môi trường dinh dưỡng sau 5- 10 ngày sẽ tạo vách tế bào phân chia  Lai tế bào soma Khi hai hay nhiều tế bào trần dung hợp với sẽ tạo thành tế bào, gọi tượng dung hợp tế bào trần Nếu tế bào trần có nguồn gốc từ tế bào soma (tế bào sinh dưỡng) thuộc giống, loài chi khác dung hợp với gọi tượng dung hợp tế bào soma hay lai soma II, So sánh đặc điểm nuôi cấy tế bào trần với nuôi cấy tế bào thành So với quy trình nuôi cấy mô tế bào bình thường nuôi cấy tế bào trần thường yêu cầu số thay đổi, chất tế bào trần Các thay đổi thường liên quan đến điều chỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào hợp chất hữu cơ, vitamin, đường để đảm bảo khả thẩm thấu chất điều tiết sinh trưởng để kích thích phân chia tế bào Nuôi cấy tế bào trần có nhiều ưu so với nuôi cấy tế bào thành tế bào:  Ưu kĩ thuật nuôi cấy tách tế bào trần tế bào màng cứng, trạng thái đơn bào, mật độ tế bào thu đơn vị thể tích  môi trường cao (đạt 106 tế bàon/1ml môi trường) Tế bào trần có khả tái sinh mạnh,ví dụ tế bào mô thịt thuốc lá, cải dầu… Bằng thao tác di truyền tế bào trần tạo tế bào biến đổi gen Tế bào với kiểu gen biến đổi sẽ bảo tồn tái sinh tế bào thành hoàn chỉnh Điều khó thực tế bào thàh  tế bào Nuôi cấy tế bào trần cho phép khả biến nạp gen thuận lợi vào tế  bào thực vật mà trước thường bị vỏ tế bào ngăn cản Nuôi cấy tế bào trần cho phép khả dung hợp tế bào - gắn hai tế bào trần lại thành tế bào với hai thông tin di truyền hai tế bào, tạo nên thể lai vô tính mà không cần hiểu biết xác liên hệ gen, tốn kém, nhanh, trực tiếp áp dụng kĩ thuật chuyển gen ( bơm ADN, hóa thấm, điện thấm…) giúp loại trừ tính bất thụ hữu tính, tạp lai hữu thụ Giúp chuyển đặc tính có lợi vào trồng, đòi hỏi phương tiện  phức tạp Tế bào lai thu đực từ dung hợp hai tế bào trần, tái sinh phát triển thành lai Quá trình thực tế bào nên gọi lai tế bào thông qua tế bào soma nên gọi lai soma hay lai vô tính tế bào Từ phương pháp để phát sinh phương pháp lai xa loài điều thực bằng phương pháp lai hữu tính thông thường Tuy nhiên trình nuôi cấy protoplast tồn số trở ngại, là:   Quá trình cô lập nuôi cấy phải hoàn thiện Chưa có phương pháp hiệu để tuyển chọn sản phẩm phù hợp III, Các kỹ thuật cụ thể  Kỹ thuật tách tế bào trần Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần (2 giai đoạn: tế bào trần tái sinh  thành tế bào, hình thành phát sinh quan)  Kỹ thuật dung hợp tế bào trần Kỹ thuật tách tế bào trần: Có mức độ thành công phụ thuộc vào chất nguyên liệu ban đầu Phương pháp tách ảnh hưởng lớn đến sức sống tế bào trần liên quan đến trình nuôi cấy sau a- Nguyên tắc: Enzyme xenlulolaza, pectinaza hemixenluloza để phân giải thành tế bào giải phóng tế bào trần Sau thành tế bào tách ra, tế bào trần phải phóng thích vào môi trường có áp suất thẩm thấu cao để tránh nước xâm nhập vào không bào,gây vỡ tế bào chất, bằng việc bổ sung chất tạo áp suất thẩm thấu saccrose, manitol…Nồng độ chất tạo áp suất thẩm thấu thời gian lưu giữ tối đa thay đổi cho thích hợp với đối tượng trồng Enzyme Xenllulolaza Enzyme pectinaza b- Các bước tiến hành: i Chọn nguyên liệu: nguyên liệu sử dụng cho nuôi cấy tế bào trần phải thu từ có trạng thái sinh lý tốt • Nếu nguyên liệu có nguồn gốc ex vitro phải từ không bị xử lý thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ Mô non thu cần phải khử trùng • In vitro: lá, mô sẹo, tế bào huyền phù Những tạo nuôi cấy in vitro vật liệu ban đầu lý tưởng cung cấp môt lượng lớn tế bào trần khỏe mạnh ii Xử lý gây co nguyên sinh chất: Trước thành tế bào bị loại bỏ, tế bào cần ngâm dung dịch với mục đích gây co nguyên sinh chất Các dung dịch thường sử dụng như: manitol sorbitol 12 - 14% (W/v), đường saccarozo 0.2 M, polyvinyl pyrrolydon 2%(W/v) Không nên dùng dung dịch có nồng độ thấp dẫn đến tế bào trân đa nhân dung hợp tự phát hai hay nhiều tế bào trần trình tách chiết Việc xử dụng nguồn mẫu in vitro sẽ thuận lợi tế bào nuôi môi trường tương tự nuôi cấy tế bào trầntrước xử lý với enzyme, giúp đảm bảo cân bằng áp suất thẩm thấu môi trường ion trình tách chiết iii Các tế bào trần tách phương pháp học phương pháp enzyme • Phương pháp học, mẫu cắt nghiền nhỏ đưa vào dung dịch gây co nguyên sinh chất, làm cho phần co nguyên sinh chất nhỏ lại Sự phản co nguyên sinh chất sẽ làm giãn nở đẩy phần nguyên sinh chất khỏi tế bào qua khe hở Phương pháp học nhìn chung phức tạp số lượng tế bào trần tồn độc lập • Phương pháp dùng enzyme: thực từ đầu năm 1960 Bằng xử lý enzyme thu số lượng lớn tế bào trần Thường phải dùng ba loại enzyme: Xellulolaza, hemixelluloza, pectinaza Có hai phương pháp xử lý enzyme: - Enzyme hỗn hợp dùng xellulolaza, hemixelluloza, pectinaza - Enzyme mẫu thực vật xử lý với pectinaza để làm nới lỏng thành tế bào, cắt bằng enzyme xellulolaza, hemixelluloza Cả hai phương pháp có số ưu điểm nhược điểm phương pháp enzyme hỗn hợp sử dụng nhiều iv Tách làm protoplast: lọc, ly tâm v Xác định chất lượng tế bào trần: quan sát kính hiển vi, tế bào có dạng hình cầu, điều cho thấy thành tế bào bị loại bỏ phân cắt enzyme Tuy nhiên mảnh thành tế bào sót lại làm ảnh hưởng đến kết nghiên cứu sau Để phát thành tế bào cách tốt dùng calcofluor Calcofluor sẽ bám vào phần tử xellulozơ Cho ml dung dịch calcofluor( dung dihj 1% pha nước cất) vào 20 ml môi trường chứa tế bào trần Calcoflour sẽ bám vào phân tử xellulozơ gây phát ánh sáng huỳnh quang với màu xanh rực rỡ soi tia cực tím Nếu tế bào trần bị loại cellulose hiển vi trường có màu tối thẫm, tế bào trần sẽ không nhìn thấy ngoại trừ tự phát ánh sáng huỳnh quang đỏ lạp thể Để xác định khả sống sót tế bào trần quan sát trực tiếp huyền phù tế bào trần kính hiển vi vật kính 20x 40x Tế bào chất tế bào xuất dạng dòng chảy chuyển đông tròn, trông hạt nhỏ nguyên sinh chất tế bào sống Ngoài số phương pháp khác để kiểm tra sức sống tế bào dựa vào đặc tính lý học sinh lý học liên quan đến tế bào sống Phần lớn phương pháp dựa hoạt tính enzyme tính thấm màng sinh chất hóa chất thị chất màu thuốc nhuộm Một phương pháp sử dụng: fluorescein diacetat (FDA) để kiểm tra tỷ lệ phần trăm tế bào trần sống sau tách chiết FDA dùng thể tích 0.8 ml dung dịch( dung dịch 0.05%) với 20 ml môi trường chứa tế bào trần Khi soi ánh sáng tử ngoại, tế bào trần sống sẽ phát ánh sáng huỳnh quang màu xanh, tế bào trần có màng sinh chất bị phá hủy sẽ có màu xẫm màu tối Quan sát 50 tế bào trần xác định tỷ lệ % tế bào trần sống sau tách từ mẫu thực vật Một phương pháp khác kết hợp kính hiển vi huỳnh quang kết hợp với nhuộm xanh Evan để xác định sức sống tế bào trần Trộn 2ml dung dịch thuốc nhuộm 1% với 10ml môi trường tách tế bào trần Lấy 0.25 ml huyền phù tế bào trần đưa vào 1ml hỗn hợp dịch nhuộm trên, để 15 phút sau đos quan sát kính hiển vi huỳnh quang Những tế bào nguyên vẹn sẽ ngăn không cho thuốc nhuộm xâm nhập vào nguyên sinh chất, ngược lại tế bào có màng sinh chất bị chức sẽ bắt màu xanh chúng sinh trưởng Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần: Thường chia làm hai giai đoạn: Giai đoạn 1: nuôi cấy để tế bào trần tái sinh thành tế bào phân chia tạo cụm nhỏ tế bào: nuôi cấy tối hay điều kiện sáng yếu, môi trường lỏng có lắc hay môi trường bán lỏng Môi trường cần giàu dinh dưỡng chất phù hợp Nhiều trường hợp cần dùng lớp nuôi trợ dưỡng Giai đoạn 2: Nuôi cấy tạo mô sẹo tái sinh hoàn chỉnh: nuôi cấy điều kiện chiếu sáng với quang chu kì phù hợp, môi trường đặc Cần ý hàm lượng tỷ lệ auxin xytokinin để tái sinh từ callus Kỹ thuật dung hợp tế bào trần Sơ đồ nguyên tắc dung hợp tế bào trần Có hai loại dung hợp: • Dung hợp đối xứng (sysmetric): dung hợp tế bào trần có nhân mức bội thể Ví dụ: khoai tây (2X) + khoai tây (2X) • khoai tây (4X) Dung hợp không đối xứng (asyametric): tạo thể lai tế bào chất hay gọi Cybrid Ở chủ yếu trộn tế bào chất để chuyển nạp vật chất di truyền tế bào chất( AND ty thể lạp thể) Một hai tế bào trần sẽ bị diệt nhân trước dung hợp Kết tạo thể heteroplastid a- Phương pháp dùng hóa chất: có nhiều hóa chất sử dụng để kích thích dung hợp tế bào trần thực vật bao gồm: NaCl, KCl, NaNO3, dextran sunfat, polyvinyl alcohol…  Xử lý với NaNO3: phương pháp đời sớm từ năm 1970, hai tác giả Cummins Cocking dung hợp thành công tế bào trần tách từ đầu rễ ngô yến mạch 10 Để cảm ứng dung hợp, tế bào trần xử lý với hỗn hợp dung dịch có 5,5% NaNO3 10% saccarozơ, 30 phút,ở nhiệt độ 350C Tần số dung hợp theo phương pháp thấp, đặc biệt tế bào trần bị không hóa mạnh  Xử lý với nồng độ Ca2+ cao pH cao: Hỗn hợp tế bào trần tách từ thịt ủ môi trường kiềm mạnh có 0,05M CaCl2, 0,4M 9%(W/w) manitol, pH cao(810) ly tâm nhẹ 50g phút, đem ủ nước nhiệt độ 370C 45 phút Bằng phương pháp này, Keller Melchers(1973) dung hợp thành công tế bào trần tách từ mô dậu dòng thuốc Tuy nhiên giá trị pH cao gây độc cho tế bào trần số loài thực vật( Kao Wetter, 1977)  Xử lý với poliethylen glycol (PEG): PEG polymer, khối lượng phân tử phụ thuộc vào điều kiện phản ứng trùng hợp: PEG 1540 (MW 1300 -1600), PEG 4000 (MW 3000 - 5000), PEG 6000 (MW 6000 - 8000) Thường dùng dung dịch PEG 6000 có nồng độ 20 - 30% (W/v) để xử lý tế bào trần 10 - 30 phút Theo Wallin cộng (1974), PEG ứng dụng rộng rãi dung hợp tế bào trần thực vật có đôc tính thấp , đồng thời có tác dụng với hầu hết kiểu tế bào 11 Kao Michayuk (1974) tác giả dùng PEG để dung hợp tế bào trần đỗ tương thuốc lá, đỗ tương ngô, tần số dung hợp thấp Khi sử dụng PEG với nồng độ ion Ca2+ cao (0,05M CaCl2.2H2O) giá trị pH cao sẽ cho kết tốt dùng PEG riêng rẽ, đạt tới 10-15% Phương pháp kết hợp phương pháp dùng PEG nguyên thủy Kao Michayluk (1974) với phương pháp sử dụng ion Ca2+ pH cao Keller Melcher(1973) Theo nhiêu tác giả, phương pháp kết hợp cho hiệu dung hợp tế bào trần thực vật (Melcher cộng 1978, Hoffman: 1978, 1979) Dung hợp tế bào PEG b- Phương pháp xung điện: Zimmerman (1982) người đề xướng phương pháp dung hợp tế bào trần nhờ xung điện Trong phương pháp dung hợp xảy tế bào 12 trần đưa vào điện trường có điện cao (500 - 1000V/cm) thời gian phát xung cực ngắn (5 - 6/1000giây) Nguyên tắc: Các protoplast tích điện nên dịch chuyển điện trường tạo chuỗi hai điện cực, dùng xung điện để làm thủng màng hai protoplast sát cạnh khiến chúng hòa trộn vào Thiết bị: Máy tạo xung điện, kính hiển vi đảo pha, buồng dung hợp Tạo điện trường: Đặt buồng dung hợp điện cực platin có khoảng cách 0,2-1mm nối với nguồn điện có hiệu điện 200V/cm Tạo xung: U 500 - 1000V/cm ,thời gian cực ngắn 1- 200 miligiây Hiệu dung hợp cao nhiên đầu tư thiết bị lớn Sự dung hợp tế bào trần nhờ xung điện cao áp IV Triển vọng ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần lai tế bào soma 13 Triển vọng phương pháp nuôi cấy dung hợp tế bào trần lớn  Sau loại bỏ thành tế bào nuôi cấy môi trường thích hợp, tế bào trần tái tạo nhanh chóng thành tế bào trình phát triển đưa hệ thống lý tưởng cho nghiên cứu sinh tổng hợp thành tế bào (Willison Cocking, Grout 1973)  Các tế bào trần có khả tiếp nhận vật liệu từ bên đưa vào tế bào Do đó, tế bào trần đối tượng thích hợp cho nghiên cứu đưa nhân lạp thể, ti thể, DNA, Plasmit vào tế bào (Dodds Bengochea 1985)  Quần thể tế bào trần xem hệ thống tế bào đơn Do thao tác tương tự vi sinh vật qua lựa chọn dòng đột biến tách dòng quần thể tế bào thực vật (Evans Cocking 1977) Một số ứng dụng khác:   Sản xuất dòng bố mẹ phục vụ sản xuất hạt lai Sản xuất hợp chất thứ cấp qua nhân sinh khối tế bào môi trường lỏng(nuôi lắc, nuôi bioreactor)  Công nghệ nuôi cấy tế bào trần ứng dụng cho có giá trị kinh tế cao, khó nhân giống bằng phương pháp thông thường  Nhờ kỹ thuật dung hợp người ta lai tạo hai loài thực vật khác nhau, chí loài thuộc chi khác  Nuôi dòng tế bào sinh dưỡng khác loài môi trường, có kết dính ngẫu nhiên hai hay số tế bào khác loài tế bào lai chứa NST hai tế bào gốc Phương pháp tạo thể có nguồn gen khác xa mà lai hữu tính không thực 14  Kỹ thuật dung hợp tế bào trần cho phép mở rộng nguồn gen loài thực vật, tạo dòng tế bào sản xuất mang đặc tính di truyền ưu việt bố mẹ  Nhiều lai tạo bằng phương pháp dung hợp tế bào có lực chống cỏ dại chống nấm bệnh  Tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu sinh lí tế bào: tính thấm màng, vận chuyển chất hòa tan, ion, chế hoạt động hoocmon thực vật…  Một ứng dụng đầy triển vọng khác nuôi cấy tế bào trần vi nhân giống thực vật Sau phân chia protoplast, thành tế bào tái sinh để tăng phát triển callus hoàn chỉnh nhờ thực vật nhân lên nhiều lần  Nghiên cứu xâm nhiễm virus thực vật Bằng kỹ thuật tách tế bào trần, tương lai, tạo thể lai có nguồn gen khác xa mà lai hữu tính thực được, tạo thể khảm mang đặc tính loài khác nhau, chí thực vật với động vật V, Tồn kỹ thuật protoplast Kỹ thuật protoplast thu thành công loài thuộc họ cà (Solanaceae) số họ khác, thành công họ hòa thảo (Poaceae) họ trồng ngũ cốc hạn chế Potrykus (1980) thảo luận kỹ vấn đề Theo Potrykus có tiêu sau liên quan đến kết nuôi cấy tái sinh từ protoplast tiềm lực in vitro: Phân lập 15  Cơ sở di truyền tế bào (khả tiềm tàng tế bào nuôi cấy in vitro)  Tương tác tế bào  Cơ chế phân hóa trình phát triển thể  Nguồn gốc quan hoàn chỉnh  Trạng thái sinh lý tế bào  Tác động trình phân lập  Tác động trạng thái phân lập Điều kiện nuôi cấy  Nhu cầu dinh dưỡng  Nhu cầu phytohormone  Điều kiện vật lý nuôi cấy  Các yếu tố ức chế xuất  Tác động mật độ quần thể tế bào Sự phân bào  Sinh tổng hợp thành tế bào  Điều khiển sinh tổng hợp thành tế bào  Chức thành tế bào phân bào  Điều khiển phản phân bào  Điều khiển phân chia nhân  Điều khiển phân bào Sự phân hoá  Điều khiển phân hóa tế bào  Tương tác tế bào nuôi cấy  Điều khiển chế tạo kiểu mô Điều khiển trình tạo quan, phôi 16 VI, Quy trình cụ thể minh họa việc nuôi cấy dung hợp tế bào trần  quy trình nuôi cấy protolast từ thuốc Nguyên liệu thực vật: Lá nguồn nguyên liệu thông dụng truyền thống cho kĩ thuật protoplast thực vật, cho phép phân lập số lớn tế bào tương đối đồng Phương pháp để tách protoplast từ cây: i ii iii iv v vi vii Khử trùng mẫu Ngâm mẫu dung dịch thẩm thấu để tế bào co nguyên sinh chất Tách lớp mặt Ngâm mẫu hỗn hợp enzyme Tinh tế bào trần Nuôi cấy tế bào trần môi trường thích hợp dung hợp hay chuyển nạp gene Lá thuốc in vitro sử dụng làm nguyên liệu tách protoplast Sử dụng tách ngày Các bước phân lập protoplast từ a, Chuẩn bị môi trường Dung dịch enzyme tách protoplast: + Onozuka cellulose R10 0,5% + Onozuka macerozyme R10 0,1% + Mannitol 13,0% + pH môi trường ̴ 5,8 Dung dịch khử trùng bằng màng lọc Milipore loại có đường kính lỗ lọc 0,2 – 0,25 µm b Tiến hành Ngày thứ nhất: 17 + Các mẫu thuốc in vitro lọai bỏ hết gân đặt đĩa petri thủy tinh vô trùng Dùng dao cấy băm nhỏ mảnh + Cho mảnh băm nhỏ vào cốc đong vô trùng loại 50 ml bổ sung 10 ml dung dịch enzyme tách protopast Bọc cóc đong bằng giấy parafilm, ghi nhãn đặt tối qua đêm máy lắc tốc độ thấp (khoảng 40 vòng/phút) Ngày thứ hai: + Dùng micropipette chuyển dịch protoplast lên lưới lọc vô trùng ( Ø = 65µm) đặt cốc loại 50ml + Bổ sung thêm 3ml dung dịch rửa (Pl + 10% mannitol) vào cốc chứa mảnh vụn, lắc mạnh, lọc tiếp lưới lọc l Chuyển hỗn hợp protoplast - enzyme (tổng cộng 15ml) vào tube ly tâm loại 15ml ly tâm 50×g 10 phút + Loại bỏ phần dịch phía trên, tái huyền phù tiểu thể bằng 10ml dung dịch tách (Pl + 20% sucrose), them 1ml dung dịch rửa lên bề mặt dung dịch tách protoplast cho không làm hòa lẫn hai dung dịch, tốt tạo thành hai pha (nhỏ từ từ dung dịch rửa lên thành tube tránh bắn tung tóe lên dịch rửa bên dưới), ly tâm 50×g 10 phút Các protoplast sống sót sẽ nằm bề mặt dung dịch + Dùng micropipette hút lớp protoplast màu xanh lục tube ly tâm chuyển sang tube ly tâm sạch, them 10 ml dung dịch rửa ly tâm lại Protoplast sẽ lắng xuống đáy tube có dạng viên + Rửa protoplast them lần 10 ml dung dịch rửa Loại bỏ phần mặt tái huyền phù protoplast khoảng chừng 1ml môi trường nuôi cấy protoplast (PC) + Đặt giọt protoplast lên buồng đếm hồng cầu ước lượng mật độ protoplast (số lượng tế bào/số ô đếm × 10.000) Nuôi cấy protoplast bằng cách pha loãng 50.000 tế bào/ml môi trường nuôi cấy protoplast chuyển sang đĩa petri vô trùng Bọc lại, ghi nhãn nuôi cấy qua đêm tối 28˚C Ngày thứ ba:Chuyển sang nuôi cấy ánh sang yếu ( 10 - 20µmol.sec/m2) bọc lớp vải thưa đèn huỳnh quang ánh sang trắng, với chu kì chiếu sang 16 giờ, nuôi hai ngày 18 Ngày thứ năm:Chuyển sang nuôi cấy cường độ ánh sang cao (50 – 75 µmol/sec/m2) ngày bằng cách bỏ lớp vải thưa Ngày thứ bảy: Ta có kết việc nuôi cấy protoplast, số tế bào phân chia từ tổng số tế bào ban đầu, mẫu có 100-200 protoplast nuôi cấy Có dấu hiệu nhiễm không C, KẾT LUẬN Tóm lại kỹ thuật nuôi cấy dung hợp tế bào trần có vai trò quan trọng có triển vọng lớn Đặc biệt kỹ thuật dung hợp lai tạo hai loài thực vật khác nhau, chí loài thuộc chi khác nhau, tạo phong phú nguồn gen thực vật Vì vậy, cần phát huy mạnh kỹ thuật ứng dụng chọn tạo giống trồng nhiều lĩnh vực khác 19 ...  tế bào Nuôi cấy tế bào trần cho phép khả biến nạp gen thuận lợi vào tế  bào thực vật mà trước thường bị vỏ tế bào ngăn cản Nuôi cấy tế bào trần cho phép khả dung hợp tế bào - gắn hai tế bào. .. thực vật, tạo dòng tế bào sản xuất mang đặc tính di truyền ưu việt bố mẹ Một kỹ thuật để chứng minh điều kỹ thuật nuôi cấy dung hợp tế bào trần Kỹ thuật nuôi cấy dung hợp tế bào trần bắt đầu ứng... xytokinin để tái sinh từ callus Kỹ thuật dung hợp tế bào trần Sơ đồ nguyên tắc dung hợp tế bào trần Có hai loại dung hợp: • Dung hợp đối xứng (sysmetric): dung hợp tế bào trần có nhân mức bội thể Ví