Kỹ thuật nuôi cấy meristem và tạo cây sạch bệnh virus

Virus thực vật là gì? Tác hại của chúng tới cây trồng ra sao? Tại sao lại phải phòng chống bệnh virus thực vật? Làm thế nào để tạo được cây sạch bệnh virus? Virus thực vật là những loại virus gây bệnh trên thực vật. Virus là một bệnh không chữa được và có thể lây truyền qua nhiều thế hệ. Có khoảng 600 loài virus thực vật đã biết, trong đó có ít nhất 80 loại có thể truyền qua hạt giống. Các virus, khuẩn và nấm gần như luôn được lây truyền qua sinh sản vô tính. Virus có thể làm giảm năng suất, chất lượng và sức sinh trưởng của cây trồng: + Virus gây bệnh cuốn lá khoai tây (PRLV) có thể làm giảm 95% năng suất. + Năng suất khoai lang có thể giảm từ 40%65% khi bị nhiễm virus chân chim . + virus X (PVX) làm giảm năng xuất từ 575% tùy thuộc vào dòng virus và mức độ nhiễm bệnh. => Do đó, việc tạo ra các cây giống sạch bệnh là vô cùng cần thiết và là biện pháp bắt buộc cho tất cả các cây nhân giống vô tính và cũng là một biện pháp để phục tráng giống cho các giống đã bị thoái hóa do nhiễm virus.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Chuyên đề: Kỹ thuật nuôi cấy meristem tạo bệnh virus GVHD: PGS TS Nguyễn Thị Lý Anh SVTH : Nhóm Họ tên Mã sinh viên Đặng Thị Thanh Bình 560778 Nguyễn Quang Hải 550339 Trần Thị Viết Hằng 560801 Mông Mạnh Linh 560821 Lê Thị Nhung 563854 Nguyễn Văn Tuấn 560886 Phạm Anh Vân 560891 Nguyễn Thị Vượng 570850 Nội dung I Đặt vấn đề II Nuôi cấy meristem tạo bệnh virus III IV V VI VII Các cách nuôi cấy meristem tạo bệnh virus in vitro Các cách kiểm tra đánh giá bệnh virus Quy trình tạo tỏi ta bệnh từ nuôi cấy meristem Kết luận Tài liệu tham khảo Đặt vấn đề Virus thực vật gì? Tác hại chúng tới trồng sao? Tại lại phải phòng chống bệnh virus thực vật? Làm để tạo bệnh virus? I Virus thực vật loại virus gây bệnh thực vật - Virus bệnh không chữa lây truyền qua nhiều hệ - Có khoảng 600 loài virus thực vật biết, có 80 loại truyền qua hạt giống - Các virus, khuẩn nấm gần lây truyền qua sinh sản vô tính - Virus làm giảm suất, chất lượng sức sinh trưởng trồng: + Virus gây bệnh khoai tây (PRLV) làm giảm 95% suất + Năng suất khoai lang giảm từ 40%-65% bị nhiễm virus chân chim + virus X (PVX) làm giảm xuất từ 5-75% tùy thuộc vào dòng virus mức độ nhiễm bệnh => Do đó, việc tạo giống bệnh vô cần thiết biện pháp bắt buộc cho tất nhân giống vô tính biện pháp để phục tráng giống cho giống bị thoái hóa nhiễm virus Nuôi cấy meristem tạo bệnh virus II Khái quát nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nuôi cấy mô tế bào thực vật phạm trù khái niệm chung cho tất loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn vi sinh vật, môi trường dinh dưỡng nhân tạo, điều kiện vô trùng - Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật công cụ hữu hiệu để tạo trồng bệnh Để tạo bệnh người ta dùng phương pháp sau: + Dùng phương pháp chuẩn đoán bệnh virus để lọc mẫu nhiễm bệnh trước đưa vào nuôi cấy, sử dụng biện pháp nhân nhanh in vitro để nhân nhanh mẫu + Làm virus mẫu bị nhiễm, sau tạo mẫu tiếp tục sử dụng biện pháp nhân nhanh in vitro để nhân mẫu Kỹ thuật nuôi cấy meristem - Qua nghiên cứu nhà khoa học White (1934), Limasset Cornuet (1950), Morel Martin (1952): Nồng độ virus bị bệnh phụ thuộc vào tốc độ phân chia tế bào khả sinh trưởng tế bào Tế bào phân chia mạnh nồng độ virus thấp, nghĩa tế bào gần đỉnh sinh trưởng chứa virus => Từ ông đưa kỹ thuật: kỹ thuật nuôi cấy meristem (mô phân sinh đỉnh) để tạo hoàn toàn virus từ nhiễm bệnh - Kỹ thuật nuôi cấy meristem phương pháp sử dụng phần mô phân sinh với - tiền phát khởi lá, tức đỉnh, có kích thước 0,1-0,5 mm tính từ chóp đỉnh sinh trưởng (Hình dưới) Tại nuôi cấy meristem lại tạo bệnh - Virus di chuyển chủ yếu nhờ hệ thống mô dẫn, hệ thống mô phân sinh đỉnh - Trong trình phân chia, tế bào mô phân sinh đỉnh không cho phép chép thông tin di truyền virus - Nồng độ auxin, cytokinin cao đỉnh sinh trưởng ngăn trình chép thông tin di truyền virus - Hệ thống vô hiệu hóa vùng meristem mạnh vùng khác Các cách nuôi cấy meristem tạo bệnh virus in vitro III Có phương pháp tạo bệnh virus: - Nuôi cấy meristem - Nuôi cấy meristem kết hợp xử lý nhiệt - Nuôi cấy mô kết hợp xử lý hóa chất - Vi ghép Nuôi cấy meristem - Tách xác meristem có kích thước cDNA virus => phản ứng lai với ARN virus => nhận biết cDNA gắn phản xạ enzyme Phương pháp ELISA Nguyên lý chung: Dựa vào phản ứng kháng nguyên – kháng thể kháng thể liên kết với enzyme (enzyme linked) Phức kháng nguyên – kháng thể - enzyme dễ dàng nhận biết qua phản ứng mầu emzym xúc tác - Enzyme thông dụng photphataza kiềm - Cơ chất phản ứng nitrophenylphosphat bị tách phosphate thành α-nitro phenol có màu vàng - Mỗi enzyme xúc tác cho hàng ngàn phân tử chất nên tín hiệu khuếch đại rõ - Có thể định tính, định lượng Phân loại: loại + ELISA thông thường + ELISA bắt kháng nguyên a Phương pháp ELISA thông thường Bước 1: Gắn kháng nguyên vào nhựa Bước 2: Che chắn phần trống protein Bước 3: Bổ xung kháng thể đặc hiệu - Bước 4: Bổ xung cộng hợp enzyme Bước 5: Bổ xung chất Bước 6: Phản ứng chuyển màu chất xúc tác enzyme b Phương pháp ELISA bắt kháng nguyên Bước 1: Cho kháng thể vào lỗ thử ủ 370C 2-4h, sau rửa Bước 2: Cho dịch mẫu thử vào lỗ thử ủ 40C 12h, đem rửa lại Bước 3: Bổ xung kháng thể gắn với enzyme ủ 370C h Bước 4: Bổ xung chất phản ứng chờ vài Bước 5: Đọc máy so màu đánh giá kết Các phương pháp ngăn chặn trình tái lây nhiễm virus đồng ruộng: - Nên trồng nhà cách ly (nhà màn, nhà kính) không chứa nguồn bệnh vetor truyền bệnh (rệp) hay nơi mang virus - Cần loại trừ thường xuyên nguồn lây nhiễm, cần phòng trừ vật mang bệnh (côn trùng tuyến trùng…), dọn cỏ thường xuyên - Phòng tránh lây nhiễm giới trình chăm sóc trồng - Thường xuyên chọn lọc, mắt qua phân tích chuẩn đoán - Để hoàn toàn chắn, nên trì vật liệu bệnh in vitro Quy trình tạo tỏi ta bệnh từ nuôi cấy meristem V Chuẩn bị mẫu - Chọn tỏi có đỉnh sinh trưởng dài 10 - 15cm - Rửa vòi nước chảy - Dùng cồn lau nhẹ, ngâm xà phòng loãng khoảng 10 phút, rửa cho xà phòng vòi nước chảy Khử trùng mẫu - Trong tủ cấy, mẫu tỏi xử lý với Ethanol 70% phút Tiếp theo, mẫu xử lý với NaDCC (sodium dichloroisocyanurate) nồng độ 5g/l phút trước tách Meristem Rửa mẫu: dùng kẹp vô trùng kẹp mẫu sau rửa nước cất vô trùng Tách meristem - Sử dụng kim mũi nhọn vô trùng tách điỉnh chồi khoảng 0,3mm - Cấy chồi vào ống nghiệm có chứa môi trường chuẩn bị vô trùng - Ghi rõ thông tin giống, ngày cấy… - Đặt vào phòng nuôi để theo dõi 4 Chú ý: Môi trường nuôi cấy tái sinh meristem tốt MS+30g saccarose + 1mgBA/l Kết nghiên cứu để làm virus cho giống tỏi nghiên cứu cần tách meristem kích thước nhỏ 0,3mm, trường hợp tách meristem kích thước nhỏ 1mm mẫu cấy cần nuôi cấy môi trường có bổ sung ribavirin nồng độ20mg/l Chồi tỏi virus tái sinh nhân lên môi trường MS + 30g saccarose + 0,5mg αNAA/l + 2,0mg BA/l, cho hệ số nhân chồi cao (4,08 lần), chồi sinh trưởng tốt (chiều cao chồi đạt 7,55cm) Chồi tái sinh từ callus môi trường MS + 15g saccarose/l + 10g glucose/l + 5g manitol/l + 2,0mg BA/l cho số chồi tái sinh mẫu 11,67 chồi/mẫu Môi trường tạo rễ in vitrocho tỏi MS + 30g saccarose + 0,5g than hoạt tính/l + 0,5mg αNAA/l, cho tỷ lệ rễ đạt 100%, số rễ trung bình đạt 5,19 rễ/cây sinh trưởng phát triển tốt VI Kết luận - - VII Phương Kỹ thuật nuôi meristem có vai trò vô quan trọng việc nhân nhanh tạo trồng bệnh, tạo trồng có chất lượng tốt Phương Kỹ thuật nuôi meristem có vai trò vô quan trọng việc nhân nhanh tạo trồng bệnh, tạo trồng có chất lượng tốt Tài liệu tham khảo Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh: Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thưc vật Sách kỷ thuật trồng rau ăn lá/ rau ăn / rau gia vị NXBNN Hà Nội, 2004 Tạ Thu Cúc: + Giáo trình trồng rau NXBNN, 1996 + Bài giảng rau (1986- 1997) Triệu Mân, Lê Lương Tề : Giáo trình bệnh nông nghiệp NXBNN, 1998 Lý Nhạc, Dương Hữu Tuyền: Canh tác học NXBNN, 1987 Dương Văn Thiều, Nguyễn Văn Thắng: Sổ tay người trồng rau NXBN,1995 Đỗ Tất Lợi: Những thuốc vị thuốc Việt Nam Theo sách :"Cây thuốc, thuốc dược" - Nhà xuất Y học www.springerlink.com/index/M154V3W2M5678821.pdf 10 www.uni-graz.at/~katzer/engl/Alli_sat.html - 49k 11.www.moh.gov.vn/homebyt/vn/portal/InfoDetail.jsp? area=58&cat=1459&ID=1053 - 68k - ...II Nuôi cấy meristem tạo bệnh virus III IV V VI VII Các cách nuôi cấy meristem tạo bệnh virus in vitro Các cách kiểm tra đánh giá bệnh virus Quy trình tạo tỏi ta bệnh từ nuôi cấy meristem. .. độ virus thấp, nghĩa tế bào gần đỉnh sinh trưởng chứa virus => Từ ông đưa kỹ thuật: kỹ thuật nuôi cấy meristem (mô phân sinh đỉnh) để tạo hoàn toàn virus từ nhiễm bệnh - Kỹ thuật nuôi cấy meristem. .. III Có phương pháp tạo bệnh virus: - Nuôi cấy meristem - Nuôi cấy meristem kết hợp xử lý nhiệt - Nuôi cấy mô kết hợp xử lý hóa chất - Vi ghép Nuôi cấy meristem - Tách xác meristem có kích thước