Virus thực vật là gì? Tác hại của chúng tới cây trồng ra sao? Tại sao lại phải phòng chống bệnh virus thực vật? Làm thế nào để tạo được cây sạch bệnh virus? Virus thực vật là những loại virus gây bệnh trên thực vật. Virus là một bệnh không chữa được và có thể lây truyền qua nhiều thế hệ. Có khoảng 600 loài virus thực vật đã biết, trong đó có ít nhất 80 loại có thể truyền qua hạt giống. Các virus, khuẩn và nấm gần như luôn được lây truyền qua sinh sản vô tính. Virus có thể làm giảm năng suất, chất lượng và sức sinh trưởng của cây trồng: + Virus gây bệnh cuốn lá khoai tây (PRLV) có thể làm giảm 95% năng suất. + Năng suất khoai lang có thể giảm từ 40%65% khi bị nhiễm virus chân chim . + virus X (PVX) làm giảm năng xuất từ 575% tùy thuộc vào dòng virus và mức độ nhiễm bệnh. => Do đó, việc tạo ra các cây giống sạch bệnh là vô cùng cần thiết và là biện pháp bắt buộc cho tất cả các cây nhân giống vô tính và cũng là một biện pháp để phục tráng giống cho các giống đã bị thoái hóa do nhiễm virus.
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
Chuyên đề: Kỹ thuật nuôi cấy meristem và tạo cây sạch
bệnh virus.
GVHD: PGS TS Nguyễn Thị Lý Anh
SVTH : Nhóm 2
Nội dung
I Đặt vấn đề.
Trang 2II Nuôi cấy meristem tạo cây sạch bệnh virus.
virus in vitro.
meristem.
Trang 3I. Đặt vấn đề.
Virus thực vật là gì? Tác hại của chúng tới cây
trồng ra sao?
Tại sao lại phải phòng chống bệnh virus thực vật? Làm thế nào để tạo được cây sạch bệnh virus?
Virus thực vật là những loại virus gây bệnh trên thực vật
- Virus là một bệnh không chữa được và có thể lây truyền qua nhiều thế hệ
- Có khoảng 600 loài virus thực vật đã biết, trong đó có ít nhất 80 loại có thể truyền qua hạt giống
- Các virus, khuẩn và nấm gần như luôn được lây truyền qua sinh sản vô tính
- Virus có thể làm giảm năng suất, chất lượng và sức sinh trưởng của cây trồng:
+ Virus gây bệnh cuốn lá khoai tây (PRLV) có thể làm giảm 95% năng suất
+ Năng suất khoai lang có thể giảm từ 40%-65% khi bị nhiễm virus chân chim
+ virus X (PVX) làm giảm năng xuất từ 5-75% tùy thuộc vào dòng virus
và mức độ nhiễm bệnh
=> Do đó, việc tạo ra các cây giống sạch bệnh là vô cùng cần thiết và là biện pháp bắt buộc cho tất cả các cây nhân giống vô tính và cũng là một biện pháp để phục tráng giống cho các giống đã bị thoái hóa do nhiễm virus
II. Nuôi cấy meristem tạo cây sạch bệnh virus.
1. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật
- Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng
- Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ hữu hiệu để tạo ra các cây trồng sạch bệnh Để tạo cây sạch bệnh người ta có thể dùng các phương pháp sau:
Trang 4+ Dùng các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus để thanh lọc các mẫu nhiễm bệnh trước khi đưa vào nuôi cấy, sử dụng biện pháp nhân nhanh in vitro để nhân nhanh mẫu sạch
+ Làm sạch virus ở mẫu đã bị nhiễm, sau khi đã tạo mẫu sạch thì tiếp tục
sử dụng biện pháp nhân nhanh in vitro để nhân mẫu sạch
2. Kỹ thuật nuôi cấy meristem
- Qua nghiên cứu của các nhà khoa học White (1934), Limasset và Cornuet (1950), Morel và Martin (1952): Nồng độ virus trong các cây bị bệnh phụ thuộc vào tốc độ phân chia của các tế bào và khả năng sinh trưởng của tế bào Tế bào phân chia càng mạnh thì nồng độ virus càng thấp, nghĩa là những tế bào càng gần đỉnh sinh trưởng thì càng chứa ít virus hơn
=> Từ đây các ông đã đưa ra một kỹ thuật: kỹ thuật nuôi cấy meristem
(mô phân sinh đỉnh) để tạo ra cây hoàn toàn sạch virus từ cây đã nhiễm bệnh
Trang 5- Kỹ thuật nuôi cấy meristem là phương pháp sử dụng phần mô phân sinh ngọn với 3 - 4 tiền phát khởi lá, tức lá đỉnh, có kích thước 0,1-0,5 mm tính từ chóp đỉnh sinh trưởng (Hình dưới)
3. Tại sao nuôi cấy meristem lại tạo ra cây sạch bệnh
- Virus di chuyển chủ yếu trong cây nhờ hệ thống mô dẫn, hệ thống này không có ở mô phân sinh đỉnh
- Trong quá trình phân chia, các tế bào mô phân sinh đỉnh không cho phép sao chép thông tin di truyền của virus
- Nồng độ auxin, cytokinin cao ở đỉnh sinh trưởng có thể ngăn quá trình sao chép thông tin di truyền của virus
- Hệ thống vô hiệu hóa ở vùng meristem mạnh hơn các vùng khác trong cây
III. Các cách nuôi cấy meristem tạo cây sạch bệnh virus
in vitro.
Có 4 phương pháp tạo cây sạch bệnh virus:
- Nuôi cấy meristem
- Nuôi cấy meristem kết hợp xử lý nhiệt
- Nuôi cấy mô kết hợp xử lý hóa chất
- Vi ghép
1. Nuôi cấy meristem
- Tách chính xác meristem có kích thước <0,3mm
Trang 6- Nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tái sinh thành cây hoàn chỉnh
- Kiểm tra độ sạch của các cây tái sinh bằng các biện pháp khác nhau để
thu được cây sạch bệnh
2. Nuôi cấy meristem kết hợp xử lý nhiệt
- Ở nhiệt độ cao từ 36°C - 37°C thì một số loại virus không có khả năng nhân lên Lợi dụng đặc tính này có thể kết hợp phương pháp nuôi cấy meristem với xử lí nhiệt độ để tẩy sạch virus khuôn mẫu
- Biện pháp này cho phép có thế tách meristem ở kích thước lớn hơn (0.5 - 1mm) giúp cho việc tách và tái sinh cây thuận lơi hơn so với phương pháp tách ở kích thước 0.1 - 0.2mm
- Cụ thể:
+ Có thể xử lý ở nhiệt độ cao 36-370 C trong một thời gian dài khoảng từ 4-6 tuần cho cây mẹ, sau đó tách meristem có kích thước 0,5-1,0mm để nuôi cấy in vitro
+ Đưa meristem đã tách vào nuôi cấy in vitro, sau đó xử lý ở nhiệt độ 39-400 C Ở nhiệt độ này, thường các RNA thông tin của virus sẽ bị phân giải và cây tái sinh sẽ có độ sạch virus cao
3. Nuôi cấy meristem kết hợp xử lý hóa chất
- Có thế nuôi cấy meristem với kích thước lớn (0.5 - 1mm) kết hợp với việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất kháng virus để tạo cây sạch bệnh
- Các chất kháng virus như: 2-thiouracil, ribavirin, vidarabin làm tăng khả năng đề kháng của tế bào, mô thực vật và ức chế sự nhân bản của virus
Trang 7- Phương pháp này đã được áp dụng trong việc tạo cây sạch virus ở thuốc
lá, khoai tây, hoa loa kèn và đã thành công
4. Vi ghép
Lá kĩ thuật ghép mô phân sinh đỉnh lên cây gốc sạch và kháng bệnh trong điều kiện in vitro Thường được áp dụng trên những cây thân gỗ đặc biệt là
họ cam, chanh vì meristem của chúng không thể sinh trưởng và tái sinh chồi khi nuôi cấy trực tiếp trên môi trương nhân tạo
Cách tiến hành:
- Từ cây mẹ bị nhiễm bệnh ta vặt lá chăm sóc bình thường khoảng 2 tuần cho cây mọc chồi mới
- Đồng thời ta tiến hành gieo hạt trong ống nghiệm đợi cây phát triển hoàn chỉnh
- Tiến hành ghép chồi mới của cây bị bệnh với cây nuôi trong ống nghiệm
- Tiếp tục cho phát triển bình thường ta sẽ được cây mới có tỉ lệ sạch bệnh virus khá cao
- Phương pháp này đã được áp dụng thành công trên cây có múi như: cam, chanh,…
IV. Các cách kiểm tra đánh giá bệnh virus.
- Phương pháp chẩn đoán bằng mắt
- Phương pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị
- Phương pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi
- Phương pháp huyết thanh
- Phương pháp phân tích DNA
- Phương pháp ELISA
Trang 81. Phương pháp chuẩn đoán bằng mắt.
Là phương pháp chẩn đoán dựa trên việc quan sát, nhận biết các triệu chứng bệnh của cây
- Ưu điểm: đơn giản; ít tốn kém; dễ thực hiện
- Nhược điểm: phải có kinh nghiệm; khó áp dụng khi cây nhiễm tổ hợp virus; phụ thuộc ngoại cảnh, tuổi cây, đặc điểm giống
2. Phương pháp chuẩn đoán bằng chỉ thị
Dùng dịch ép của thực vật cần được xét nghiệm để lây nhiễm trên 1 cây chỉ thị thích hợp hoặc dùng phương pháp ghép có thể xác định bệnh virus Cây chỉ thị khi bị nhiễm virus sẽ biểu hiện nhiều triệu chứng đặc trưng
- Ưu điểm: nhạy, chính xác; có thể phát hiện ở nồng độ virus thấp
- Nhược điểm: Thời gian chuẩn đoán dài, cần thời gian ủ bệnh; phụ thuộc vào điều kiện thí nghiệm; phương pháp lây nhiễm phức tạp; tốn công chăm sóc cây chỉ thị, môi giới truyền bệnh; một số bệnh virus không tiến hành được (bệnh cuốn lá)
3. Phương pháp chuẩn đoán bằng kính hiển vi
Kính hiển vi mang lại những kết quả đáng tin cậy đối với những xét nghiệm hàng loạt
- Ưu điểm: chính xác; tin cậy
- Chi phí cao;số lượng mẫu hạn chế; phương pháp lấy mẫu, xử lý mấu phức tạp; không áp dụng với một số bệnh virus
4. Phương pháp huyết thanh
Phương pháp này dựa trên sự trộn lẫn huyết thanh đặc hiệu cho mỗi loại virus với dịch cây cần chẩn đoán bệnh
Có nhiều phương pháp huyết thanh khác nhau như phương pháp kết tủa giọt, phương pháp xét nghiệm miễn dịch hướng tâm…
- Ưu điểm: nhạy, đặc hiệu (kết quả thu được trong 48h), chi phí thấp; không cần có nhà cách ly nuôi cấy chỉ thị
- Nhược điểm: Có thể lẫn với một số dạng kết tủa khác; phản ứng khó xảy
ra với nồng độ dịch cây bệnh thấp
5. Phương pháp phân tích DNA
- Xác định trực tiếp sự có mặt của ARN lõi của virus
- Chính xác, đắt tiền
Trang 9- Sơ đồ nguyên lý:
ARN virus => cDNA virus => phản ứng lai với ARN virus => nhận biết khi cDNA gắn phản xạ hoặc enzyme
6. Phương pháp ELISA
Nguyên lý chung: Dựa vào phản ứng kháng nguyên – kháng thể nhưng ở đây kháng thể được liên kết với một enzyme (enzyme linked) Phức kháng nguyên – kháng thể - enzyme dễ dàng nhận biết qua phản ứng mầu do chính emzym đó xúc tác
- Enzyme thông dụng là photphataza kiềm
- Cơ chất phản ứng là 4 nitrophenylphosphat khi bị tách phosphate sẽ thành α-nitro phenol sẽ có màu vàng
- Mỗi enzyme xúc tác cho hàng ngàn phân tử cơ chất nên tín hiệu được khuếch đại khá rõ
- Có thể định tính, định lượng
Phân loại: 2 loại
+ ELISA thông thường
+ ELISA bắt kháng nguyên
a. Phương pháp ELISA thông thường
Bước 1: Gắn kháng nguyên vào bản nhựa
Bước 2: Che chắn phần trống bằng protein
Bước 3: Bổ xung kháng thể đặc hiệu
Bước 4: Bổ xung cộng hợp enzyme
Bước 5: Bổ xung cơ chất
Bước 6: Phản ứng chuyển màu của cơ chất được xúc tác bởi enzyme
b. Phương pháp ELISA bắt kháng nguyên
Trang 10Bước 1: Cho kháng thể vào các lỗ của bản thử ủ ở 370C trong 2-4h, sau
đó rửa
Bước 2: Cho dịch mẫu thử vào các lỗ của bản thử ủ ở 40C trong 12h, rồi đem rửa lại
Bước 3: Bổ xung kháng thể gắn với enzyme ủ ở 370C trong 1 h
Bước 4: Bổ xung cơ chất phản ứng chờ một vài giờ
Bước 5: Đọc trên máy so màu và đánh giá được kết quả
7. Các phương pháp ngăn chặn quá trình tái lây nhiễm virus trên đồng ruộng:
- Nên trồng cây trong nhà cách ly (nhà màn, nhà kính) không chứa nguồn bệnh và các vetor truyền bệnh (rệp) hay ở nơi không có các mang virus
- Cần loại trừ thường xuyên các nguồn lây nhiễm, cần phòng trừ các vật mang bệnh (côn trùng và tuyến trùng…), dọn cỏ thường xuyên
- Phòng tránh sự lây nhiễm cơ giới trong quá trình chăm sóc cây trồng
- Thường xuyên chọn lọc, có thể bằng mắt hoặc qua các phân tích chuẩn đoán
- Để hoàn toàn chắc chắn, nên duy trì vật liệu sạch bệnh in vitro
V. Quy trình tạo cây tỏi ta sạch bệnh từ nuôi cấy
meristem.
1. Chuẩn bị mẫu
- Chọn các lá tỏi có đỉnh sinh trưởng dài 10 - 15cm
- Rửa sạch dưới vòi nước chảy
- Dùng cồn lau nhẹ, ngâm trong xà phòng loãng khoảng 10 phút, rửa cho sạch xà phòng dưới vòi nước chảy
2. Khử trùng mẫu
Trang 11- Trong tủ cấy, mẫu tỏi được xử lý với Ethanol 70% trong 1 phút.
- Tiếp theo, mẫu được xử lý với NaDCC (sodium dichloroisocyanurate) nồng độ 5g/l trong 5 phút trước khi tách Meristem
- Rửa mẫu: dùng kẹp vô trùng kẹp các mẫu ra sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng
3. Tách meristem
- Sử dụng kim mũi nhọn vô trùng tách điỉnh chồi khoảng 0,3mm
- Cấy chồi vào ống nghiệm có chứa môi trường đã được chuẩn bị và vô trùng
- Ghi rõ các thông tin giống, ngày cấy…
- Đặt vào trong phòng nuôi để theo dõi
Trang 124. Chú ý:
Môi trường nuôi cấy tái sinh meristem tốt nhất là MS+30g saccarose + 1mgBA/l Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng để làm sạch virus cho giống tỏi nghiên cứu cần tách meristem ở kích thước nhỏ hơn 0,3mm, hoặc trong trường hợp tách meristem ở kích thước nhỏ hơn 1mm thì mẫu cấy cần được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung ribavirin ở nồng độ20mg/l Chồi tỏi sạch virus tái sinh được nhân lên trong môi trường MS + 30g saccarose + 0,5mg αNAA/l + 2,0mg BA/l, cho hệ số nhân chồi cao nhất (4,08 lần), chồi sinh trưởng tốt nhất (chiều cao chồi đạt 7,55cm) Chồi cũng có thể được tái sinh từ callus trên môi trường MS + 15g saccarose/l + 10g glucose/l + 5g manitol/l + 2,0mg BA/l cho
số chồi tái sinh trên mẫu là 11,67 chồi/mẫu Môi trường tạo rễ in vitrocho cây tỏi
là MS + 30g saccarose + 0,5g than hoạt tính/l + 0,5mg αNAA/l, cho tỷ lệ cây ra
rễ đạt 100%, số rễ trung bình đạt 5,19 rễ/cây và cây sinh trưởng phát triển tốt
Trang 13VI. Kết luận.
- Phương Kỹ thuật nuôi cây meristem có vai trò vô cùng quan trọng trong việc nhân nhanh tạo các cây trồng sạch bệnh, tạo các cây trồng
có chất lượng tốt.
- Phương Kỹ thuật nuôi cây meristem có vai trò vô cùng quan trọng trong việc nhân nhanh tạo các cây trồng sạch bệnh, tạo các cây trồng
có chất lượng tốt.
VII. Tài liệu tham khảo.
1 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh: Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thưc vật.
2 Sách kỷ thuật trồng rau ăn lá/ rau ăn quả / rau gia vị NXBNN Hà Nội, 2004.
3 Tạ Thu Cúc: + Giáo trình trồng rau NXBNN, 1996.
+ Bài giảng về cây rau (1986- 1997).
4 Triệu Mân, Lê Lương Tề : Giáo trình bệnh cây nông nghiệp NXBNN, 1998.
5 Lý Nhạc, Dương Hữu Tuyền: Canh tác học NXBNN, 1987.
6 Dương Văn Thiều, Nguyễn Văn Thắng: Sổ tay người trồng rau
NXBN,1995.
7 Đỗ Tất Lợi: Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam
8 Theo sách :"Cây thuốc, bài thuốc và dược" - Nhà xuất bản Y học
9 www.springerlink.com/index/M154V3W2M5678821.pdf
10 www.uni-graz.at/~katzer/engl/Alli_sat.html - 49k
11.www.moh.gov.vn/homebyt/vn/portal/InfoDetail.jsp?
area=58&cat=1459&ID=1053 - 68k -