V, Quy trình cụ thể minh họa việc nuôi cấy và dung hợp tế bào trần
Các bước phân lập protoplast từ lá cây
a) Chuẩn bị môi trường
Dung dịch enzyme tách protoplast: + Onozuka cellulose R10 0,5% + Onozuka macerozyme R10 0,1% + Mannitol 13,0%
+ pH môi trường ̴ 5,8
Tiến hành
Ngày thứ nhất:
Các mẫu lá được lọai bỏ hết gân lá và đặt trên đĩa petri thủy tinh vô trùng. Dùng dao cấy băm nhỏ các mảnh lá.
Các mảnh lá đã băm nhỏ vào cốc đong vô trùng loại 50 ml bổ sung 10 ml dung
dịch enzyme tách protopast. Bọc cóc đong bằng giấy parafilm, ghi nhãn và đặt trong tối qua đêm trên máy lắc ở tốc độ thấp (khoảng 40 vòng/phút).
Ngày thứ hai
Chuyển dịch protoplast lên lưới lọc vô trùng ( Ø = 65µm) đặt trong cốc loại 50ml
Bổ sung thêm 3ml dung dịch rửa vào cốc chứa các mảnh lá vụn, lắc mạnh, và lọc
tiếp trên lưới lọc l. Chuyển hỗn hợp protoplast - enzyme vào tube ly tâm loại 15ml và ly tâm 50g trong 10 phút.
Loại bỏ phần dịch nổi phía trên, thêm 1ml dung dịch rửa lên trên bề mặt dung
dịch tách và protoplast sao cho không làm hòa lẫn hai dung dịch, tốt nhất là tạo thành hai pha, ly tâm 50×g trong 10 phút. Các protoplast sống sót sẽ nằm ở trên bề mặt dung dịch.
Hút lớp protoplast màu xanh lục nổi trên tube ly tâm và chuyển nó sang một tube ly tâm sạch, thêm 10 ml dung dịch rửa và ly tâm lại. Protoplast sẽ lắng xuống đáy tube và có dạng viên.
Rửa protoplast them một lần nữa trong 10 ml dung dịch rửa.
Đặt một giọt protoplast lên buồng đếm hồng cầu và ước lượng mật độ protoplast.
Nuôi cấy protoplast bằng cách pha loãng 50.000 tế bào/ml môi trường nuôi cấy protoplast và chuyển sang một đĩa petri vô trùng. Bọc lại, ghi nhãn và nuôi cấy qua đêm trong tối ở 28˚C.
Ngày thứ ba:Chuyển sang nuôi cấy ở ánh sang yếu hoặc bọc một lớp vải thưa dưới đèn huỳnh quang ánh sang trắng, với chu kì chiếu sang 16 giờ, nuôi trong hai ngày.
Ngày thứ năm:Chuyển sang nuôi cấy ở cường độ ánh sang cao hơn trong 2 ngày
Ngày thứ bảy: Ta có được kết quả của việc nuôi cấy protoplast, số tế bào phân
chia từ tổng số tế bào ban đầu, trong một mẫu có 100-200 protoplast nuôi cấy. Có dấu hiệu của sự nhiễm bản không.
Kết luận
Tóm lại kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần có vai trò rất quan trọng và có
triển vọng rất lớn. Đặc biệt kỹ thuật dung hợp có thể lai tạo giữa hai loài thực vật khác nhau, thậm chí cả những loài thuộc chi khác nhau, tạo ra sự phong phú về nguồn gen thực vật.
Vì vậy, chúng ta cần phát huy những thế mạnh của kỹ thuật này trong ứng dụng