Nuôi cấy huyền phù tế bào

Nuôi cấy huyền phù tế bào (cell suspension cultures) là phương thức nuôi tế bào đơn (single cell) hay cụm nhiều tế bào (cell aggregate) ở trạng thái lơ lửng trong môi trường lỏng Các tế bào tách ra khỏi mô sẹo và phân tán trong môi trường lỏng Sinh trưởng, phân chia và có thể hình thành những cụm tế bào kết tập. Dung dịch nuôi cấy tế bào chuyển thành huyền phù tế bào Nuôi cấy huyền phù tế bào cần một lượng mô sẹo khá lớn. Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết.Mức độ tách rời của các tế bào phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể được đều chỉnh bởi thành phần môi trường. Để duy trì quá trình nuôi cấy, các tế bào cần được cấy truyền vào giai đoạn đầu của pha ổn định và ở thời điểm khi sự kết tập của tế bào là lớn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chủ đề: NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO GVHD : PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh SV thực : Nhóm Nguyễn Thị Duyên Nguyễn Thị Anh Đào Phạm Thị Huệ Lê Ngọc Mai Phùng Tiến Quang Phạm Thị Thảo Đào Trần Trung An Thị Yến 570960 560785 560808 560827 560853 560866 550413 560895 A.ĐẶT VẤN ĐỀ Giới thiệu chung Kĩ thuật sử dụng nuôi cấy huyền phù tế bào ƯD NC huyền phù TB nhân giống vô tính ƯD NC huyền phù TB sản suất sinh khối tế bào hợp chất có giá trị cao Nuôi cấy Nhân sâm Panax ginseng bằng Bioreacter KẾT LUẬN I GIỚI THIỆU CHUNG Khái niệm, Đặc trưng  Nuôi cấy huyền phù tế bào (cell suspension cultures) phương thức nuôi tế bào đơn (single cell) hay cụm nhiều tế bào (cell aggregate) ở trạng thái lơ lửng môi trường lỏng  Các tế bào tách khỏi mô sẹo phân tán môi trường lỏng Sinh trưởng, phân chia hình thành cụm tế bào kết tập Dung dịch nuôi cấy tế bào chuyển thành huyền phù tế bào • Nuôi cấy huyền phù tế bào cần lượng mô sẹo lớn • Sau thời gian, dịch huyền phù hỗn hợp tế bào đơn, cụm tế bào, mảnh lại mẫu cấy tế bào chết.Mức độ tách rời tế bào phụ thuộc vào đặc tính khối tế bào xốp đều chỉnh bởi thành phần môi trường • Để trì trình nuôi cấy, tế bào cần cấy truyền vào giai đoạn đầu pha ổn định ở thời điểm kết tập tế bào lớn MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY tb huyền phù có chất tb callus mt nuôi cấy calus sử dụng để khởi đầu việc nuôi cấy huyền phù tế bào cải tiến hàm lượng tỉ lệ auxin/cytokinin cho phù hợp để có tế bào phân tán tốt môi trường lỏng lắc Các tiêu sinh trưởng • Số lượng tế bào: Trước đếm, xử lý cụm tế bào qua acid chromic, đun nóng 700C – 10 phút, sau làm nguội lắc mạnh vài phút Pha loãng dịch, nhuộm đếm buồng đếm hồng cầu Kết quả: số lượng tế bào/ml dung dịch nuôi cấy • Thể tích tế bào: Lấy ngẫu nhiên thể tích dịch nuôi cấy, đem ly tâm tốc độ 2000 vòng/phút thời gian phút Thu tế bào đem xác định thể tích Kết quả: Số ml tế bào/thể tích môi trường nuôi cấy •Khối lượng tươi: Thu thập tế bào thể tích dịch xác định Rửa nước cất vô trùng Làm khô chân không Cân để xác định khối lượng •Khối lượng khô: Lấy thể tích mẫu xác định Loại bỏ phần nổi, rửa phần tế bào giấy lọc Whatman Sấy khô 12h 800C đến khối lượng không đổi •Xác định số nguyên phân (chỉ số phân bào): Huyền phù tế bào cố định hỗn hợp Aceto-orcein : Acid Acetic (3:1) sau chuyển sang lam kính Nhỏ giọt Aceto-orcein lên mẫu, hơ lửa đèn cồn, để nguội phút Đậy mẫu Lamel, làm khô mẫu, quan sát kính hiển vi quang học vật kính 100 Xác định kỳ khoảng 1000 tế bào Tổng số tế bào phân bào x 100 Chỉ số phân bào(%) = Tổng số tế bào kiểm tra  HỆ THỐNG NUÔI CẤY NGẬP CHÌM TẠM THỜI (TIS) • Pha 1: mô không ngập môi trường • Pha 2: tượng ngập hoạt hóa, van mở cho khí qua màng lọc đẩy môi trường lỏng lên ngập mô cấy • Pha 3: trao đổi khí hệ thống RITA • Pha 4: chu kỳ kết thúc, van đóng lại môi trường lỏng rút xuống ngăn bên Hệ thống RITA ẢNH HƯỞNG CỦA HỆ THỐNG NGẬP CHÌM TẠM THỜI LÊN CHẤT LƯỢNG NUÔI CẤY • Lá nhỏ môi trường nuôi cấy lỏng • Các cụm chồi phát triển thường có hình cầu • Chồi có xu hướng phát triển tỏa tròn xung quanh tâm số chồi có kích thước không lớn Chồi có thân dài nhiều so với nuôi cấy môi trường thạch Những ảnh hưởng có lợi từ hệ thống ngập chìm tạm thời lên phát triển chồi kết việc sử dụng bình chứa dung tích lớn Ưu điểm • • • • • • • Ứng dụng nhiều đối tượng trồng, không bị biến dị với tần số cao • sinh trưởng hệ số nhân cao Cây tái sinh phôi soma thu có chất lượng tốt Hạn chế tượng thủy tinh thể • Tiết kiệm công lao động không gian nuôi cấy, giảm chi phí sản suất Giảm hoạt tính chất độc Nhược điểm Chưa khảo sát mật độ nuôi cấy rất đắt, chưa tự chế tạo nước Các thông số kĩ thuật cần khảo sát kỹ lưỡng tối ưu hóa giai đoạn nuôi cấy loại III ỨNG DỤNG CỦA NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO TRONG NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH Các bước  Nuôi cấy callus: tiến hành cấy chuyển nhiều lần môi trường thạch mềm  Nuôi cấy dịch huyền phù: • Callus cấy chuyển sang môi trường lỏng chuyển động • Các tế bào tách khỏi mẫu chuyển động xoáy môi trường tế bào đơn, cụm tế bào với kích thước khác nhau, mẫu nuôi cấy thừa chưa phát triển tế bào chết Sự phát sinh soma  sử dụng môi trường kích thích có chứa auxin, nước dừa, dùng nhiều xytokinin, myo-inosiol giảm lượng nitrogen  phôi soma có kích thước tương đối nhỏ đồng kích cỡ nên chúng cắt thành mảnh nhỏ tách rời nuôi cấy môi trường tăng sinh Sự nhân chồi Hệ thống ngập chìm có tác dụng thúc đẩy việc nhân chồi:  chồi sinh trưởng tốt hơn, chất lượng tốt dài so với chồi môi trường rắn  chồi tăng trưởng liên tục cho phép thu hoạch chồi sau tháng mà không cần cấy chuyền  Sau thu hoạch, chuyển nuôi môi trường tự nhiên bình thường IV ỨNG DỤNG TRONG SẢN SUẤT SINH KHỐI TẾ BÀO THỰC VẬT VÀ CÁC HỢP CHẤT CÓ GIÁ TRỊ CAO NHÂN SINH NHÂN SINH KHỐI CALLUS KHỐI RỄ  Hiệu suất mang lại cao  Một số sản phẩm: • Alkaloid:morphina • Các hợp chất kháng ung thư: taxol, saponin Tốc độ tăng trưởng cao Nđ: • Nguồn cung cấp Oxy ko đến đc với sinh khối Bioreactor mô bị lão hóa • Khả nuôi cấy rễ thành công phụ thuộc vào việc thiết kế hệ thống Bioreactor phù hợp SỐ HỢP CHẤP THỨ CẤP Diosgenin: chống viêm; chữa sốt, thấp khớp, đau lưng Cây củ nâu Codein : giảm đau giảm ho Cây Anh túc Taxol hóa trị liệu ung thư Cây thông đỏ Saponin sapogenin: chữa rối loạn tiêu hóa, chống suy nhược thể, tăng cường sinh lực Cây nhân sâm V ỨNG DỤNG TRONG NUÔI CẤY THÔNG ĐỎ ĐÊ THU NHẬN TAXOL •Nguồn dược liệu quý y học: •Năm 1994 công bố: “từ thông đỏ tìm thấy hoạt chất để chữa trị bệnh ung thư cụ thể Taxol chiết suất từ vỏ loài: T brevifolia, T cuspidata, T.yunnanensis, T baccata T wallichiana,… •Chữa ung thư buồng trứng ung thư vú, chống khối u ác tính, ung thư phổi số Thông Đỏ Quy trình nuôi cấy     I.Mẫu nuôi cấy: lấy phần ngọn, lá,…mẫu dùng để nuôi cấy phải có tính chất sau: •Mẫu tế bào phải lấy từ biết chắn có khả sinh tổng hợp chất cần thiết có khả tổng hợp hay chuyển hoá cao •Mẫu phải bệnh giai đoạn phát triển mạnh •Khi mẫu cấy tạo thành mô sẹo, cấy mô sẹo vào môi trường lỏng dùng để nuôi cấy tế bào đơn, môi trường nuôi cấy là: •Khoáng MS (Murashige-Skoog) •Ngoài bổ sung thêm: nước dừa; 2,4-D loại Đầu tiên mô sẹo nuôi cấy bình tam giác thể tích 200ml có chứa 20ml môi trường đặt máy lắc có tốc độ 90-100 vòng/phút, nhiệt độ 2830oC, với ánh sáng 3000 lux, khoảng 2-3 ngày lấy mẫu kiểm tra cách đếm đưới kính hiển vi, xây dựng đường cong tăng trưởng tế bào Sau 1-2 tuần bình nuôi cấy tạo huyền phù tế bào : • Tế bào có khả sinh phôi • Tế bào khả sinh phôi Sau ngày: Thu sinh khối, chuyển toàn sinh khối sang trình nuôi kế tiếp, dung tích lần nuôi sau nhiều lần nuôi trước khoảng 10-15 lần, nhân giống đủ lượng giống cho sản xuất lớn, tỷ lệ giống sản xuất lớn khoảng 1-5% Hiện thiết kế thiết bị nuôi cấy tế bào đơn với dung tích hàng chục m3 thiết bị lên men tương tự công nghệ vi sinh vật Đối với thiết bị nuôi cấy tế bào đơn hệ thống cung cấp oxygen mà có cách khuấy cần phải có hệ thống chiếu sáng đảm bảo cho trình tự dưỡng tế bào xảy KẾT LUẬN  Nuôi cấy huyền phù tế bào mở nhiều định hướng phát triển cho tương lai  Trong năm gần đây, Việt Nam thành công quy trình áp dụng phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào để sản xuất chế phẩm sinh học, y học  sở vật chất cho phòng thí nghiệm nuôi cấy huyền phù tb đắt nên việc áp dụng sản xuất hạn hẹp T h a n k f r o s w a t c h i n g ... cụm tế bào kết tập Dung dịch nuôi cấy tế bào chuyển thành huyền phù tế bào • Nuôi cấy huyền phù tế bào cần lượng mô sẹo lớn • Sau thời gian, dịch huyền phù hỗn hợp tế bào đơn, cụm tế bào, ... TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO Nuôi cấy dịch thể động Nuôi cấy chìm liên tục Nuôi cấy chìm tuần hoàn Nuôi cấy Bioreactor Bioreacter cánh khuấy Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (TIS) NUÔI CẤY... kết tập tế bào lớn MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY tb huyền phù có chất tb callus mt nuôi cấy calus sử dụng để khởi đầu việc nuôi cấy huyền phù tế bào cải tiến hàm lượng tỉ lệ auxin/cytokinin cho phù hợp