nuoi cay huyen phu te bao

Định lượng alkaloid vinblastin và vincristin có trong lá cây không qua nuôi cấy in vitro và trong dịch huyền phù tế bào. Kết luận:[r]

Nhóm 7:Ni cấy huyền phù tế bào

• Bản thân tế bào thực vật đơn vị độc lập, chứa đựng tất thông tin di truyền đặc trưng thể từ sinh Cho nên tế bào xây dựng lại tồn thể nhờ tính tồn Thực vật bậc cao ng̀n cung cấp các hợp chất hóa học dược liệu quan trọng Tuy nhiên năm gần sản lượng các thực vật khó đảm bảo ở mức ổn định hậu sớ yếu tớ như:

• - Điều kiện tự nhiên khơng thuận lợi • - Chi phí lao động ngày tăng

• - Khó khăn kỹ thuật kinh tế trồng trọt

NỘI DUNG

I. Khái niệm nuôi cấy huyền phù tế bào II. Lịch sử nghiên cứu

III. Các phương pháp nuôi cấy

I KHÁI NIỆM

 Nuôi cấy huyền phu tế bào (cell suspension

cultures): Phương thức nuôi tế bào đơn (single cell) hay cụm nhiều tế bào (cell aggregate) ở trạng thái lơ lửng môi trường lỏng

 Các tế bào tách khỏi mô sẹo phân tán môi trường lỏng

 Sau thời gian, dịch huyền phù hỗn hợp các tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh lại mẫu cấy các tế bào chết

 1949: Caplin Steward nuôi cấy tế bào thực vật môi trường lỏng có khuấy

 Muis (1954) Nickell (1956) cho thấy các tế bào thực vật sinh trưởng được các thể vi sinh vật

 1959, Melches Beckman tách nuôi cấy thành công tế bào đơn huyền phù tế bào

III CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

 Tùy điều kiện mục đích mà có các phương

3.1 Nuôi cấy dịch thể động

3.1.1 Ni cấy chìm liên tục

 Các tế bào được tiếp xúc với môi trường dinh

dưỡng chúng được ngâm hẳn vào dung dịch môi trường

 Sự thơng khí được thực hiện nhờ máy lắc chạy ở

tốc độ 100 - 150 vịng/phút Khí đưa vào phải đảm

III CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

 Theo Thomas Davey

(1975), nuôi cấy huyền phù tế bào có dung tích 25 ml, tớc độ phù hợp máy lắc 100 – 120 vòng/phút

 Thể tích mơi trường

lỏng phải phù hợp với kích thước bình ni cấy, thường chiếm 20% thể tích

 Các nuôi cấy quy mô nhỏ thời gian ngắn, sử dụng máy khuấy từ ở tớc độ 250 vịng/phút thời gian cho quá trình nuôi cấy thường từ 10 – 15 ngày

 Sau đó, các mẫu ni cấy phải được cấy chuyển sang môi trường để đảm bảo sinh trưởng

3.1.2 Ni cấy chìm tuần hồn

 Các tế bào được nhúng chìm vào môi trường dịch thể, xen kẽ với khoảng thời gian được đưa ngồi mơi trường

 Quá trình được thực hiện nhờ chuyển động “bập bênh” các bình ni cấy

III CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY  Khi chuyển động:

 Khối tế bào ở đầu được đưa vào môi trường

 Khối tế bào ở đầu tiếp xúc với không khí

III CÁC PHƯƠNG PHÁP NI CẤY

3.2 Nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào Bioreactor:

♣ Hệ thống nuôi cấy được thơng khí được trao đởi khí

♣ Mơi trường ni cấy dễ dàng thay theo thời kỳ

♣ Tế bào thực vật nhạy cảm với stress vi khuẩn nên hệ thống bioreactor cho nuôi cấy tế bào thực vật yêu cầu thường xun cải thiện hệ thớng thơng khí hệ thống trộn môi trường

♣ Takayama Miasawa người đầu tiên sử dụng bioreactor vào nhân giống trồng: nhân củ siêu nhỏ khoai tây, củ giống hoa ly, hoa lan hồ điệp

♣ Công nghệ cho phép nhân nhanh vô hạn các giống trồng nhờ thiết bị bioreactor hồn tồn tự động hóa VD: bioreactor vibro-mixer trang bị với các ớng silicone có khả sản xuất 100.000 phơi vơ tính trạng ngun 1lit dịch huyền phù dung dịch được đặt 1tấm giấy lọc phát triển tuần

 Bioreactor sử dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật được cải tiến từ các loại bioreactor nuôi cấy tế bào vi sinh

 Thuận lợi:

 Thể tích ni cấy tăng giúp

sản xuất nhiều mà không cần kĩ thuật cao cấp

 Hầu hết các bình bioreactor

được thiết kế với chế khuấy học hay thởi khí để trì ni cấy gần đờng dạng

III CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

 Khi thao tác nuôi cấy liên tục, mơi trường ni cấy mơi trường vật lí được kiểm soát thích hợp cho sinh trưởng Điều thực hiện với hệ thống nuôi cấy bình tam giác

 Nhược điểm: địi hỏi thiết bị hiện đại đắt tiền, vận hành phức tạp đặc biệt khâu chống nhiễm cho huyền phù nuôi cấy

 Nuôi cấy huyền phù tế bào cần lượng mô sẹo khá lớn, xấp xỉ – g/100ml dung dịch môi trường (Helgeson, 1979)

 Sau thời gian, dịch huyền phù hỗn hợp các tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh lại mẫu cấy các tế bào chết

 Mức độ tách rời các tế bào phụ thuộc vào đặc tính các khới tế bào xớp được điều chỉnh bởi thành phần môi trường

VD: nhiều trường hợp, tăng tỷ lệ Auxin/Cytokinin sản sinh nhiều khối tế bào xốp  Theo King Street (1977), khơng có quy trình

chuẩn cho ni cấy huyền phù tế bào

 Sinh trưởng phát triển tế bào nuôi cấy:

 Pha lag: bắt đầu đưa mô sẹo vào môi trường, kéo

dài lần phân bào đầu tiên

 Pha tăng tốc: các tế bào bắt đầu phân chia số lượng

tế bào tăng dần

 Pha hàm số mũ: số lượng tế bào tăng theo hàm số mũ.  Pha ổn định: số lượng tế bào đạt cực đại không đổi

IV ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ

Thời gian Số

lượng tế bào

Pha lag Pha tăng tốc

Pha hàm số mũ Pha ổn

 Để trì quá trình ni cấy, các tế bào cần được cấy truyền vào giai đoạn sớm pha ổn định

 Thời điểm cấy truyền cụ thể dựa vào kinh nghiệm, nói chung nên bắt đầu mật độ tế bào cực đại  Mật độ tế bào cực đại khoảng 18 – 25 ngày,

với huyền phù sinh trưởng mạnh ngắn hơn,

 Ở lần cấy truyền đầu tiên, dịch nuôi cần được lọc nhằm loại bỏ cụm tế bào lớn, các mảnh từ mẫu cấy ban đầu, sau dùng pipet để lấy dịch cấy truyền  Lượng tế bào đem cấy truyền phải đủ lớn để đảm

bảo mật độ tế bào, thấp quá các tế bào khơng sinh trưởng được

VD: đối với tế bào sung dâu (Acer pseudoplatanus) mật độ thích hợp – 15.103 tb/ml

IV ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ

 Theo King (1980), tế bào trải qua quá trình ni cấy, sinh trưởng trao đởi chất dịch huyền phù gọi dòng tế bào Đặc điểm dòng tế bào:

 Khả tách tế bào cao.  Hình thái tế bào đờng nhất.

IV ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ

 Tương đới các yếu

tớ mạch

 Có khả nhân

đơi 24 – 72h

 Mất tính tồn năng.  Quen với chất sinh

trưởng

5.1 Số lượng tế bào

 Trước đếm, xử lý cụm tế bào qua acid chromic, đun nóng 700C – 10 phút, sau

làm nguội lắc mạnh vài phút

 Pha lỗng dịch, nhuộm đếm b̀ng đếm hồng cầu

 Kết quả: số lượng tế bào/ml dung dịch nuôi cấy.

5.2 Thể tích tế bào

 Lấy ngẫu nhiên thể tích dịch ni cấy, đem ly tâm ở tớc độ 2000 vòng/phút thời gian phút  Thu tế bào đem xác định thể tích.

 Kết quả:

 Sớ ml tế bào/thể tích môi trường nuôi cấy.  Tỷ lệ %.

5.3 Khối lượng tươi khối lượng khô tế bào

 Khối lượng tươi:

 Thu thập tế bào thể tích dịch xác định.  Rửa nước cất vô trùng

 Làm khô chân không.  Cân để xác định khối lượng.  Khối lượng khô:

 Lấy thể tích mẫu xác định.

5.4 Xác định thành phần Protein

 Thu thập tế bào, chuyển lên lọc qua giấy Whatman.  Rửa tế bào ethanol 70% sôi.

 Làm khô với Aceton rồi chuyển vào dung dịch NaOH 1M

 Đun nóng đến 850C 1.5h

 Lọc xác định Protein thủy phân dịch theo phương pháp Lowry cs (1951)

5.5 Xác định số nguyên phân

 Huyền phù tế bào được cố định hỗn hợp

Aceto-orcein : Acid Acetic (3:1) sau chuyển sang lam kính

 Nhỏ giọt Aceto-orcein lên mẫu, hơ ngọn lửa đèn cồn,

để nguội phút

 Đậy mẫu Lamel, làm khơ mẫu, quan sát kính hiển

vi quang học ở vật kính 100

 Xác định các kỳ khoảng 1000 tế bào.

6.1 Sản xuất sinh khối tế bào các hợp chất thứ cấp

 Sản phẩm nuôi cấy huyền phù tế bào thường đặc trưng chất có giá trị cao cần ở lượng nhỏ  Có thể chia thành các nhóm dựa theo công dụng:

 Hợp chất thứ cấp y học.

 Hợp chất thứ cấp hóa mỹ phẩm.  Hợp chất thứ cấp công nghiệp.

 Tại phải nuôi cấy huyền phù tế bào thu sinh khối?

 Tàn phá mơi trường xói mịn di truyền.

 Sự cung cấp nguồn nguyên liệu không đặn, không vững chắc, chất lượng không ổn định

 Nhiễm bẩn thuốc trừ sâu, bệnh hại, chất phóng xạ hay kim loại nặng …

VI ỨNG DỤNG

Ngoài ra, ni cấy huyền phù tế bào cịn có sớ ưu điểm sau:

 Sản xuất cách có định hướng, theo quy mô công

nghiệp, khối lượng sản phẩm lớn, không phụ thuộc vào mùa vụ

 Tỷ lệ % khối lượng khô các hợp chất thứ cấp cao so

với nguyên liệu thực vật thu hái tự nhiên

 Khơng tớn nhiều diện tích gieo trờng

 Một số hợp chất thứ cấp sản xuất từ nuôi cấy

huyền phù tế bào thực vật:

 Diosgenin: Tác dụng chống viêm; chữa sốt, đái buốt, đái vàng,

thấp khớp, đau lưng, đau dây thần kinh

- Việc nuôi cấy Dioscorea deltoidea Wall ex Griseb (cây Củ nâu) bioreactor thu được suất diosgenin cao so với hiệu suất có được từ nguyên liệu tự nhiên

- Trong nuôi cấy tế bào, diosgenin chiếm 7.8 % khối lượng khô, chiếm % với nguyên liệu thực vật thu hái

VI ỨNG DỤNG

 Codein: Giảm đau giảm

ho

- Papaver somniferum nguồn hợp chất quan trọng y học morphine codein

VI ỨNG DỤNG  Steviol:

- Chất tạo vị ngọt được biết đến rộng rãi, thu nhận từ Stevia rebaudiana

VI ỨNG DỤNG  Taxol:

- Là nhóm chất hóa trị liệu ung thư, điều trị ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư phởi, khới u ác tính, các dạng u bướu khác

VI ỨNG DỤNG

 Scopolamine hyoscyamine:

- Là loại tropane alkaloid được sử dụng để trị co thắt gây mê

- Có nhiều các thuộc họ Solanaceae

- Nuôi cấy huyền phù tế bào

VI ỨNG DỤNG

 Saponin sapogenin:

- Là dược phẩm quý giá, có nhiều rễ nhân sâm (Panax ginseng), có tác dụng chữa bệnh rới loạn tiêu hóa, chớng suy nhược thể, tăng cường sinh lực

- Nuôi cấy huyền phù tế bào

P ginseng đang tiến hanh quy mô công nghiệp

VI ỨNG DỤNG

 Betalaine:

- Là nhóm các chất nhuộm màu thực phẩm

- Bao gồm betaxanthine (màu vàng) betacyane (màu đỏ) - Thành tựu nuôi cấy quan

6.2 Trong công tác chọn giống trồng:

 Sử dụng để chọn lọc các dịng tế bào mong ḿn qua các test lọc

 Sau tái sinh các tế bào chọn lọc thành hoàn chỉnh

 Cây hoàn chỉnh trở thành vật liệu khởi đầu quan trọng cơng tác giớng

 Ngồi ra, tách protoplast nguồn để sản xuất các phơi vơ tính

 Nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo dịch huyền phù Bắt ruồi Drosera indica L cho mục tiêu thu nhận Plumbagin (Quách Diễm Phương)

 Nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo dịch huyền phù Bèo đất Drosera burmalni Vahl cho mục tiêu thu nhận hợp chất Anthraquinone Quách Diễm Phương (đề tài NCCB ĐH Quốc gia TP HCM)

 Nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo dịch huyền phù Mãn Đình Hờng Althaea rosea L nhằm thu nhận Rutin điều trị tim mạch (Quách Diễm Phương)

 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào họ Drosera.sp để thu nhận các hợp chất Quinone

 Thành cơng quy trình tạo sinh khới tế bào rễ sâm Ngọc Linh ứng dụng công nghệ Biomass – Học viện Quân Y

 Các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học (Viện khoa học Cơng nghệ Việt nam) hồn chỉnh quy trình nhân nhanh sinh khới mơ Hồng Liên gai (Berberis Wallichiarna DC) công nghệ tế bào thực vật để làm nguồn dược liệu sản xuất thuốc becberin

ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ

ĐƯỜNG SACCHAROSE LÊN DỊCH NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO DỪA CẠN CATHARANTHUS ROSEUS

Tác giả:

Bùi Văn Lệ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Nguyễn Ngọc Hồng, Trường Đại học Bán công Tôn Đức Thắng

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

 Dừa cạn Catharanthus roseus.G.Don thuộc họ Trúc đào

Apocynaceae dược liệu chứa nhiều alkaloid

 Từ dừa cạn người ta chiết được chất chữa ung thư

vinblastin chữa cao huyết áp ajmalicin, serpentin

 Tuy nhiên hàm lượng chất có

rất thấp Việc nuôi cấy tế bào dừa cạn để nâng cao hàm lượng alkaloid mong muốn được nhiều nước

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

 Mô sẹo màu xanh được nuôi điều kiện chiếu sáng

từ lá dừa cạn in vitro 4 tháng tuổi được chuyển vào 100 ml môi trường cảm ứng erlen 250 ml

 Môi trường cảm ứng gồm môi trường MS + Vitamin

Morel + Hormon tăng trưởng thực vật (NAA 2,4-D Kin BAP) + 30g/l đường sucrose

 Sau đặt vào máy lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ 25±

2oC điều kiện chiếu sáng liên tục 16 giờ/ngày

 Xác định sinh khối phương pháp cân.

 Chiết tách alkaloid toàn phần từ sinh khối tế bào Dừa

cạn theo phương pháp Kutney cộng (1983)

 Xác định alkaloid toàn phần phương pháp acid-baz

- khan theo dược điển Việt Nam dược điển Anh

VII CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU Cây dừa cạn tự

nhiên

Khử trùng ni cấy

điều kiện thích hợp Cây dừa cạn

in-vitro

Mô sẹo

Nuôi cấy mô sẹo đk chiếu sáng 1000 lux

Dịch huyền phù tế bào

Chuyển mô sẹo sang môi trường

lỏng để nuôi cấy dịch huyền phù

Sinh khới

Định lượng alkaloid tồn

phần

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát ảnh hưởng thay đổi nồng độ cytokinin đến tạo sinh khối

Kết luận:

 Ở bảng cho thấy môi trường bở sung NAA có

tạo sinh khối thấp so với môi trường bổ sung NAA kết hợp với Kin

 Môi trường K4 (MS + NAA (1mg/l) + Kin (0.5 mg/l) K8

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.2 Ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng đến việc tạo sinh khối

Kết luận:

 Mơi trường có bở sung 2,4-D tạo sinh khới tươi nhiều

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.2 Ảnh hưởng các chất điều hịa sinh trưởng đến việc tạo sinh khới

Kết luận:

 2,4-D kích thích phân chia tế bào nhanh lại

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.3 Ảnh hưởng đường sucrose đến việc tạo sinh khối

Kết luận:

 Nồng độ đường tăng dần từ 20 - 60 gam/l sinh khối tươi khô thu được môi trường tăng dần theo Môi trường tối ưu cho thí nghiệm ảnh hưởng nờng độ đường lên tạo sinh khối môi trường Đ5

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.4 Định lượng alkaloid vinblastin vincristin có lá không qua nuôi cấy in vitro dịch huyền phù tế bào

Kết luận:

 phương pháp ni cấy dịch huyền phù có bở sung

4 KẾT LUẬN:

 Tìm được nồng độ hormon phù hợp: Ở nồng độ mgl-1 

-naphthaleneacetic acid (NAA) 0,5 mgl-1 kinetin (Kin) thu nhận được sinh khới alkaloid tồn phần cao ở môi trường thay NAA 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) ở nồng độ thu được sinh khới alkaloid tồn phần thấp

 Nồng độ đường tối ưu cho việc nuôi dịch huyền phù tế

VIII KẾT LUẬN

 Với nhiều ưu điểm vượt trội mình, phương pháp ni cấy huyền phù tế bào được áp dụng rộng rãi nghiên cứu thực tiễn sản xuất

• Tuy nhiên, sở vật chất cho phịng thí nghiệm ni cấy huyền phù tế bào cịn cao nên ở Việt Nam, hướng ni cấy huyền phù tế bào dừng lại ở mức nghiên cứu

• Trong năm gần đây, Việt Nam thành cơng quy trình áp dụng các phương

Tài liệu tham khảo

1 Công nghệ sinh học Tập 2: Công nghệ tế bào NXB Giáo dục