nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích kháng lên sự tích lũy eurycomanone trong nuôi cấy huyền phù tế bào cây bách bệnh (eurycoma longifolia jack) TT

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN HỮU NHÂN NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT KÍCH KHÁNG LÊN SỰ TÍCH LŨY EURYCOMANONE TRONG NI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO CÂY BÁCH BỆNH (Eurycoma longifolia Jack) Ngành: SINH LÝ HỌC THỰC VẬT Mã sớ: 9420112 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS NGUYỄN HỒNG LỘC HUẾ - 2021 Cơng trình hoàn thành tại: Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Hoàng Lộc Phản biện 1: PGS.TS Trần Thanh Hương Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG TP Hồ Chí Minh Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Thị Tâm Trường Đại học Sư Phạm, Đại học Thái Nguyên Phản biện 3: PGS.TS Trần Thị Lệ Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Huế Thành phố Huế Vào hồi ……………giờ ……….ngày …… tháng …… năm……… Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Cây bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack) thuộc chi Eurycoma, họ Simaroubaceae loài thảo dược nhiệt đới phổ biến, có nguồn gốc nước Đông Nam Á Malaysia, Indonesia Việt Nam Dịch chiết này, đặc biệt từ rễ, sử dụng để tăng cường testosterone nam giới Dịch chiết sử dụng phương thuốc dân gian người địa để kháng khuẩn, hạ sốt, chống viêm, gây độc tế bào kích thích tính dục Eurycomanone chất đặc trưng bách bệnh, có hoạt tính tăng cường sinh lý nam giới, cảm ứng trình apoptosis tế bào ung thư,… Gần đây, nhu cầu loại thảo dược tăng nhanh, vậy, việc trồng quy mơ lớn loại dược liệu đáp ứng nhu cầu lớn Tuy nhiên, bách bệnh sinh trưởng chậm, trưởng thành cần tới năm thu hoạch Do đó, ni cấy in vitro bách bệnh để sản xuất hợp chất thứ cấp thay cho nguồn nguyên liệu tự nhiên cần thiết Chất kích kháng chất hóa học dùng để tác động vào đường chuyển hóa thứ cấp nhằm tăng cường sinh tổng hợp chất có giá trị dược phẩm ni cấy tế bào thực vật Theo Abraham cs (2011), dịch chiết nấm men ứng dụng nuôi cấy in vitro thực vật khả kích thích chế bảo vệ, tăng sản sinh chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học Salicylic acid xem tín hiệu quan trọng phản ứng tự vệ sử dụng rộng rãi sản xuất chất chuyển hóa từ ni cấy tế bào thực vật Methyl jasmonate chứng minh chất đóng vai trị quan trọng việc truyền tín hiệu điều chỉnh khả phịng vệ thực vật kích thích sản sinh chất chuyển hóa thứ cấp ni cấy tế bào Do đó, việc sử dụng chất kích kháng thực vật sản xuất eurycomanone từ bách bệnh thông qua nuôi cấy huyền phù tế bào hứa hẹn mang lại hiệu cao Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy tế bào bách bệnh để thu lượng sinh khối lớn, có khả tích luỹ cao hợp chất có hoạt tính sinh học nhằm chủ động nguồn nguyên liệu, đảm bảo cho việc tách chiết dược chất có ý nghĩa lớn mặt khoa học thực tiễn Xuất phát từ sở trên, thực đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng sớ chất kích kháng lên tích lũy eurycomanone ni cấy huyền phù tế bào bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack)” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Xác định loại chất kích kháng, nồng độ thời gian xử lý thích hợp để sản xuất eurycomanone với hàm lượng cao từ huyền phù tế bào bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack) NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU Nội dung nghiên cứu - Sản xuất sinh khối tế bào Bách bệnh khảo sát q trình tích lũy eurycomanone tế bào; + Nghiên cứu khả sinh trưởng callus tế bào huyền phù bách bệnh; + Xây dựng đường cong sinh trưởng đường cong tích lũy tế bào huyền phù; + Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên khả sinh trưởng tích lũy eurycomanone tế bào huyền phù - Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ thời gian xử lý chất kích kháng: salicylic acid, methyl jasmonate, dịch chiết nấm men lên khả sinh trưởng tích lũy eurycomanone tế bào huyền phù Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu thực callus bách bệnh, sử dụng 03 chất kích kháng: salicylic acid, methyl jasmonate, dịch chiết nấm men, nghiên cứu tiến hành phạm vi phịng thí nghiệm ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN Luận án có đóng góp sau: Đây cơng trình sử dụng chất kích kháng (methyl jasmonate, salicilic acid dịch chiết nấm men) để nghiên cứu cải thiện khả tích lũy eurycomanone tế bào huyền phù bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack) Luận án tìm mơi trường thích hợp cho sinh trưởng callus bách bệnh, mơi trường MS có bổ sung 1,25 mg/L NAA 1,00 mg/L KIN, callus sinh trưởng mạnh với số sinh trưởng đạt 10,07; tìm điều kiện ni cấy thích hợp cho tế bào huyền phù mơi trường MS lỏng có bổ sung 1,25 mg/L NAA 1,00 mg/L KIN, nguồn carbon 3% sucrose Nghiên cứu xác định methyl jasmonate nồng độ 0,02 mM, bổ sung sau ngày nuôi cấy cho hiệu tích lũy eurycomanone cao sau 14 ngày nuôi cấy, cao 10 lần so với mẫu đối chứng tế bào không xử lý chất kích kháng khoảng lần so với mẫu tự nhiên CẤU TRÚC LUẬN ÁN Luận án trình bày 109 trang A4 Trong đó, phần Mở đầu trang, phần Tổng quan tài liệu 35 trang, phần Đối tượng Phương pháp nghiên cứu trang, phần Kết nghiên cứu 21 trang, phần Bàn luận 17 trang, Kết luận Kiến nghị trang, Danh mục cơng trình cơng bố trang, Tài liệu tham khảo 19 trang, phần Phụ lục trang Luận án có 150 tài liệu tham khảo, có 137 tài liệu tiếng Anh Phần kết nghiên cứu có 12 bảng 12 hình Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CÂY BÁCH BỆNH Bách bệnh thảo mộc, thường xanh, sinh trưởng chậm, bụi gỗ nhỏ, chiều cao tối đa 15-18 m sau 2-3 năm nuôi trồng Tuy nhiên, để tích lũy hợp chất sinh học tốt đến 25 năm, mục đích thương mại, rễ thu hoạch sau 4-5 năm Hầu tất phận sử dụng phương thuốc dân gian Dịch chiết rễ sử dụng để phục hồi lượng sinh lực, tăng cường lưu thông máu, bổ sung vào thành phần thảo dược cho phụ nữ sau sinh Lá sử dụng thầy thuốc địa phương để điều trị sốt rét, khối u, bệnh nướu răng, ngồi chúng cịn chữa số bệnh lây qua đường tình dục giang mai, lậu Thành phần hoạt chất bách bệnh quassinoid Quassinoid nhóm triterpenoid giảm cấp giàu oxy, phân bổ chủ yếu họ Simaroubaceae 1.2 HỢP CHẤT THỨ CẤP THỰC VẬT Ở thực vật, có nhiều loại hợp chất hữu chất chuyển hóa tạo trình trao đổi chất Các hợp chất thứ cấp thực vật thường tổng hợp từ sản phẩm quang hợp như: alkaloid tổng hợp từ amino acid; hợp chất steroid, terpenoid cardiac glycoside tổng hợp từ acetic acid; chất kháng sinh vitamin tổng hợp từ carbohydrate Những thành tựu đạt lĩnh vực công nghệ sinh học, đặc biệt phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật, cung cấp phương thức cho q trình thương mại hóa chất hóa học có nguồn gốc từ thực vật Phương pháp mở rộng tăng khả thu hồi hóa chất có giá trị, thay từ quy mô nông nghiệp truyền thống lên quy mô công nghiệp sản xuất hợp chất thứ cấp 1.3 CHẤT KÍCH KHÁNG THỰC VẬT Chất kích kháng định nghĩa chất hỗn hợp chất mà đưa nồng độ thấp vào hệ thống tế bào sống sẻ khởi đầu cải thiện sinh tổng hợp hợp chất đặc trưng Sự kích kháng q trình cảm ứng tăng cường sinh tổng hợp chất trao đổi thêm vào lượng nhỏ chất kích kháng Chất kích kháng phân loại dựa vào tính tự nhiên chúng, gồm chất kích kháng sinh học phi sinh học dựa vào nguồn gốc chúng, gồm chất kích kháng ngoại sinh nội sinh Sự tăng cường sản xuất hợp chất trao đổi thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật thơng qua kích kháng mở lĩnh vực nghiên cứu mới, mang lại lợi ích kinh tế quan trọng cho ngành dược Một vài thông số tính chọn lọc nồng độ chất kích kháng, thời gian kích kháng, thời kỳ kích kháng, dịng tế bào, điều hòa sinh trưởng, thành phần dinh dưỡng, chất lượng nguyên liệu thành tế bào… ảnh hưởng đáng kể đến tăng cường sản phẩm tích lũy Jasmonic acid (JA) methyl jasmontae (MeJA) phân tử tín hiệu stress sinh học phi sinh học Tác dụng rộng rãi chúng giải thích thực tế phân tử hoạt động chất kích kháng với phổ rộng đường tín hiệu MeJA JA chứng minh kích thích sản xuất vài hợp chất (alkaloid, terpenoid, phenolic phytoalexin, coumarin taxane) nhiều lồi thực vật Dịch lọc ni cấy nấm, dịch chiết nấm men (YE-Yeast Extract) xác vi khuẩn gây khả đáp ứng bảo vệ tế bào thực vật Tuy nhiên, loại kích kháng hỗn hợp phức tạp nhiều chất hóa học, phần có hiệu cảm ứng tích lũy hợp chất đặc trưng 1.4 GIỚI THIỆU VỀ EURYCOMANONE Eurycomanone tìm thấy bách bệnh, có nhiều rễ Đây hợp chất quassinoid bách bệnh, sử dụng chất thị để đánh giá chất lượng sản phẩm dược liệu từ Eurycomanone có số hoạt tính sinh học làm tăng sản xuất testosterone tinh hồn chuột, hoạt tính chống thấm (antiulcer activity), gây độc dòng tế bào ung thư kháng sốt rét Phân tích HPLC sản phẩm dược liệu Malaysia cho thấy eurycomanone xuất 58,9% sản phẩm dược liệu, hàm lượng eurycomanone bách bệnh khoảng 0,8-1,5% (w/v) Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu callus cảm ứng từ rễ bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack) in vitro nghiên cứu TS Võ Châu Tuấn Hạt bách bệnh thu thập huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam ni cấy tạo in vitro, sau rễ in vitro tuần tuổi sử dụng để cảm ứng tạo callus Các thí nghiệm thực phịng ni cấy mơ tế bào thực vật, Khoa SinhMôi trường, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Môi trường điều kiện nuôi cấy ban đầu Môi trường dùng để nuôi cấy môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) có bổ sung chất điều hịa sinh trưởng (ĐHST) khác tùy theo mục đích thí nghiệm Mơi trường ni cấy có nguồn carbon sucrose 3%, làm đặc agar 0,8%, pH điều chỉnh đến 5,8 sau khử trùng 1210C (1 atm) 20 phút 2.2.2 Nuôi cấy callus bách bệnh Callus (3 g) nuôi cấy môi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D, NAA KIN (kinetin) nồng độ khác để khảo sát khả tăng sinh callus bách bệnh Sau tuần nuôi cấy (14 ngày), callus thu nhận, loại bỏ nước bám bên callus phương pháp lọc (giấy lọc Whatman No.1) xác định khối lượng tươi Sau callus sấy đến khối lượng khơng đổi nhiệt độ 50oC, để xác định khối lượng khô Chỉ số sinh trưởng (GI-growth index) tế bào xác định công thức: GI = W14/W0 Trong đó: W14 W0 khối lượng tươi tế bào thời điểm đánh giá thời điểm bắt đầu nuôi cấy 2.2.3 Nuôi cấy huyền phù tế bào bách bệnh Sau đánh giá môi trường tốt cho sinh trưởng callus, g callus 14 ngày tuổi (tương đương 1,7 g callus sau lọc chân khơng) có màu vàng nhạt, rời, từ mơi trường rắn ni cấy lỏng bình tam giác tích 250 mL chứa 50 mL môi trường để nuôi cấy tế bào huyền phù Công thức môi trường cho callus sinh trưởng tốt sử dụng để nuôi cấy huyền phù tế bào Quá trình ni cấy thực với tốc độ lắc 120 vòng/phút Sinh khối tế bào thu sau ngày nuôi cấy 20 ngày để xây dựng đường cong sinh trưởng đường cong tích lũy eurycomanone tế bào 2.2.4 Xác định ảnh hưởng nguồn carbon lên sinh trưởng tích lũy eurycomanone huyền phù tế bào bách bệnh Sau xác định thời gian tích lũy sinh khối eurycomanone tối ưu, tiến hành khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon khác lên khả sinh trưởng tích lũy eurycomanone tế bào Các nguồn carbon: sucrose, fructose glucose bổ sung riêng lẻ vào môi trường nuôi cấy huyền phù tế bào nồng độ khác (mỗi nguồn carbon sử dụng mức nồng độ: 20, 30 40 g/L) Sau thời gian nuôi cấy định (đã xác định mục 2.2.3), sinh khối tế bào thu hoạch để xác định khối lượng tươi, khối lượng khô hàm hàm lượng eurycomanone tích lũy 2.2.5 Xác định ảnh hưởng pH môi trường lên sinh trưởng tích lũy eurycomanone huyền phù tế bào bách bệnh Để khảo sát ảnh hưởng pH lên khả sinh trưởng tích lũy eurycomanone tế bào, sử dụng môi trường nuôi cấy với nguồn carbon thích hợp (đã xác định mục 2.2.4) cho sinh trưởng tích lũy, điều chỉnh giá trị pH môi trường từ 4,75 đến 6,75 trước khử trùng, khoảng chênh lệch pH môi trường 0,5 Sau 14 ngày nuôi cấy, sinh khối tế bào thu hoạch để xác định khối lượng tươi, khối lượng khơ hàm lượng eurycomanone tích lũy 2.2.6 Xử lý chất kích kháng Xác định ảnh hưởng nồng độ chất kích kháng lên sinh trưởng tích lũy eurycomanone huyền phù tế bào bách bệnh Ảnh hưởng nồng độ chất kích kháng đánh giá cách bổ sung riêng lẻ YE, MeJA SA vào môi trường với nồng độ khác thời điểm bắt đầu nuôi cấy (thời điểm kích kháng ngày) Trong đó, SA MeJA có nồng độ từ 0,01-1 mM, YE từ 20-250 mg/L Đối chứng công thức không bổ sung chất kích kháng Sau thời gian ni cấy định, sinh khối tế bào thu hoạch để xác định khối lượng tươi, khối lượng khô hàm lượng eurycomanone Xác định ảnh hưởng thời điểm kích kháng lên sinh trưởng tích lũy eurycomanone huyền phù tế bào bách bệnh Nồng độ chất kích kháng cho huyền phù tế bào bách bệnh sinh trưởng tích lũy tốt (đã xác định trên) lựa chọn để đánh giá thời điểm kích kháng tối ưu Chất kích kháng bổ sung vào môi trường thời điểm từ – 12 ngày ni cấy (mỗi cơng thức thí nghiệm cách ngày) Đối chứng công thức bổ sung chất kích kháng thời điểm ban đầu Sau thời gian nuôi cấy định, tế bào thu hoạch để xác định khối lượng tươi, khối lượng khô hàm lượng eurycomanone 2.2.7 Chiết xuất eurycomanone Eurycomanone chiết xuất theo phương pháp Mohamad cs (2013) có điều chỉnh để phù hợp với điều kiện cụ thể phịng thí nghiệm Sinh khối khơ tế bào (callus, huyền phù tế bào, rễ tự nhiên) nghiền thành bột mịn, sau chiết cách ngâm 0,5 g mẫu 10 mL methanol (Merck), lắc 120 vòng/phút 600C giờ, sau để lắng thu dịch chiết Quy trình chiết lặp lại lần Dịch chiết (khoảng 30 mL) lọc qua giấy lọc Whatman (No.1) đặc 500C Sau đó, kết tủa hòa tan mL methanol, lọc qua màng lọc Minisart 0,2 µm (Sartorius, Goettingen, Đức), để phân tích HPLC nhằm xác định hàm Bảng 3.2 Ảnh hưởng NAA đến khả sinh trưởng callus bách bệnh NAA Khối Khối Chỉ số sinh (mg/L) lượng tươi (g) lượng khô (g) trưởng (GI) 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 1,75 2,00 2,25 20,47d 21,92b 21,30c 23,59a 18,50e 18,21e 17,24f 16,79f 0,79c 0,88b 0,87b 0,93a 0,72d 0,71d 0,65e 0,62f 6,8 7,3 7,1 7,8 6,2 6,1 5,7 5,6 Hình thái callus Vàng nhạt, mọng nước Vàng nhạt, mọng nước Vàng đậm, rắn, rời rạc Vàng đậm, rắn, rời rạc Vàng đậm, rắn, rời rạc Vàng đậm, rắn, rời rạc Vàng nhạt, mọng nước Vàng nhạt, mọng nước 3.1.2 Ảnh hưởng kết hợp chất ĐHST Trong nội dung nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hịa riêng lẻ, chúng tơi nhận thấy sử dụng NAA có hiệu so với 2,4D, chúng tơi sử dụng NAA thí nghiệm kết hợp với KIN Bảng 3.3 Ảnh hưởng NAA KIN đến khả sinh trưởng callus bách bệnh NAA KIN Khối lượng (mg/l) (mg/l) tươi (g) 1,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 1,75 2,00 23,43c 30,98ab 32,34a 28,80b 24,65c 20,49d 18,70d Khối lượng khô (g) Chỉ số sinh trưởng Hình thái callus 0,92c 1,26a 1,31a 1,11b 0,94c 0,79d 0,78d 7,8 10,3 10,7 9,6 8,2 6,8 6,2 Vàng nhạt, mọng nước Vàng nhạt, mọng nước Vàng đậm, rắn, rời rạc Vàng đậm, rắn, rời rạc Vàng đậm, rắn, rời rạc Vàng nhạt, mọng nước Vàng nhạt, mọng nước Kết kết hợp 1,25 mg/L NAA KIN cho thấy sinh khối callus đạt cao (30,98-32,34 g tươi/bình, tương ứng với 11 1,26-1,31 g khơ/bình) thu nhận từ mơi trường MS chứa 0,75 – 1,00 mg/L KIN, GI đạt tương ứng 10,3-10,7 (Bảng 3.3) Kết chứng tỏ bổ sung NAA kết hợp với KIN thúc đẩy việc sinh trưởng callus so sánh với bổ sung riêng chất điều hòa sinh trưởng 3.1.3 Sự tích lũy eurycomanone callus bách bệnh Kết phân tích HPLC mẫu dịch chiết từ callus 14 ngày tuổi môi trường tốt (MS có bổ sung 1,25 mg/L NAA 1,00 mg/L KIN) rễ bách bệnh tự nhiên khoảng năm tuổi cho thấy tất mẫu xuất peak có thời gian lưu giống với chất chuẩn eurycomanone (khoảng 4,15 phút) Hàm lượng eurycomanone callus 0,17 mg/g chất khô (bằng khoảng 8% so với mẫu rễ tự nhiên 2,09 mg/g) 3.2 THIẾT LẬP NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO 3.2.1 Xây dựng đường cong sinh trưởng tích lũy eurycomanone Hình 3.1 Đường cong sinh trưởng tế bào Kết nghiên cứu trình bày hình 3.1 cho thấy pha thích nghi diễn ngắn (khoảng ngày), sau pha sinh trưởng nhanh (kéo dài đến ngày thứ 14), pha ổn định diễn ngắn sau nhanh chóng chuyển qua pha chết Với tỷ lệ tiếp mẫu khoảng 1,7 g bau đầu, sinh trưởng tế bào đạt cực đại vào ngày thứ 14, khối lượng tươi thu khoảng 15,67 g/bình (0,69 g khơ/bình), cao gấp 9,21 lần sinh khối tươi ban đầu 12 A B Hình 3.2 Phổ HPLC phân tích hàm lượng eurycomanone tế bào A Eurycomanone chuẩn, B Dịch chiết eurycomanone từ tế bào huyền phù 14 ngày tuổi Hình 3.3 Đường cong tích lũy eurycomanone Phân tích HPLC tiến hành dịch chiết tế bào kết cho thấy peak với thời gian lưu 4.194 phút, tương tự chất chuẩn eurycomanone (4.141 phút) (Hình 3.2) Như vậy, 13 eurycomanone tổng hợp tế bào in vitro bách bệnh biến đổi sinh học dường khơng có sai khác ý nghĩa Kết xây dựng đường cong tích lũy cho thấy eurycomanone sản xuất q trình ni cấy từ đầu đến ngày 20, hàm lượng cao (1,65 mg/g khô) thu vào ngày thứ 14 giống tích lũy sinh khối tế bào (Hình 3.3) 3.2.2 Ảnh hưởng nguồn carbon đến sinh trưởng tế bào Kết trình bày bảng 3.4 cho thấy glucose thích hợp cho sinh trưởng tế bào, đặc biệt nồng độ 3% (sinh khối tươi đạt 20,30 g), nhiên môi trường tích lũy sinh khối khơ khơng tốt (chỉ đạt 0,59 g) Trong đó, sucrose nồng độ 3% sinh trưởng tế bào không tốt glucose (sinh khối tươi đạt 17,43 g) tích lũy sinh khối khô lại tốt nhiều (0,72 g) Khi nuôi cấy tế bào môi trường chứa fructose tế bào khơng sinh trưởng, hóa nâu chết sau vài ngày Bảng 3.4 Ảnh hưởng nguồn carbon lên sinh trưởng tế bào bách bệnh Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g) Eurycomanone (mg/g) Glucose 17,58b 20,30a 12,57c 0,43c 0,59b 0,44c 0,47e 0,77d 1,36b Sucrose 17,62b 17,43b 18,00b 0,44c 0,72a 0,61b 1,54ab 1,70a 1,11c - - - - - - Nguồn carbon (%) Fructose Ở môi trường nuôi cấy chứa sucrose 3%, sản xuất eurycomanone tế bào đạt cao (1,70 mg/g) Ảnh hưởng nồng độ glucose lên tích luỹ eurycomanone thấp sucrose 14 3.2.3 Ảnh hưởng pH môi trường đến sinh trưởng tế bào Trong nghiên cứu chúng tôi, pH môi trường nuôi cấy điều chỉnh giao động khoảng 4,75-6,75 trước khử trùng Kết nghiên cứu trình bày bảng 3.5 cho thấy tích lũy sinh khối tươi sinh khối khô tốt pH 5,75 Ở công thức mơi trường này, tích lũy sinh khối tươi khô, hàm lượng eurycomanone đạt cao nhất, tương ứng 17,27 g/bình, 0,76 g/bình 1,67 mg/g khơ Bảng 3.5 Ảnh hưởng pH môi trường đến sinh trưởng tế bào pH Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g) Eur (mg/g) 4,75 11,04d 0,49d 0,49c 5,25 15,47b 0,68b 1,38b 5,75 17,27a 0,76a 1,67a 6,25 13,68c 0,60c 1,34b 6,75 13,52c 0,60c 1,31b 3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH KHÁNG LÊN SỰ SINH TRƯỞNG TẾ BÀO VÀ TÍCH LŨY EURYCOMANONE 3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất kích kháng đến tích lũy eurycomanone 3.3.1.1 Ảnh hưởng dịch chiết nấm men Số liệu trình bày bảng 3.6 cho thấy YE có tác dụng ức chế sinh trưởng tế bào, khối lượng khơ mẫu có xử lý kích kháng YE đạt 0,41 đến 0,51 g/bình (mẫu đối chứng 0,72 g/bình) Tuy nhiên, tích luỹ eurycomanone tăng đạt cực đại khoản 3,71 mg/g khô xử lý với nồng độ 200 mg/L YE (tương ứng 1,82 mg/bình), cao đối chứng khoản lần 15 Bảng 3.6 Ảnh hưởng dịch chiết nấm men lên sinh trưởng tích lũy eurycomanone tế bào bách bệnh YE Khối lượng tươi Khối lượng khô Eurycomanone (mg/L) (g) (g) (mg/g) 17,43a 0,72a 1,70d ĐC 14,7bc 0,42e 1,61d 20 b d 14,98 0,47 1,71d 50 15,24b 0,46d 1,79d 100 c e 13,96 0,41 2,28c 150 17,08a 0,49c 3,71a 200 a b 16,68 0,51 3,07b 250 ĐC: đối chứng không bổ sung YE 3.3.1.2 Ảnh hưởng methyl jasmonate Khác với xử lý YE, kích kháng MeJA ảnh hưởng cách rõ rệt đến sinh trưởng tế bào bách bệnh Sự sinh trưởng tế bào giảm cách đáng kể nồng độ MeJA tăng từ 0,01- 0,50 mM Ở nồng độ 1,00 mM MeJA, tế bào hóa nâu, không phát triển (Bảng 3.7) Tuy nhiên, hàm lượng eurycomanone đạt cao 6,60 mg/g chất khô nồng độ 0,02 mM MeJA (tương ứng 3,16 mg/bình), kết cao cao lần so với đối chứng Bảng 3.7 Ảnh hưởng methyl jasmonate lên sinh trưởng tích lũy eurycomanone tế bào MeJA Khới lượng tươi Khối lượng khô Eurycomanone (mM) (g) (g) (mg/g) ĐC 17,43a 0,72a 1,70c b c 0,01 10,58 0,43 5,17b 0,02 8,14c 0,48c 6,60a d b 0,05 5,22 0,61 1,23d 0,10 2,29e 0,33d 1,11d f e 0,20 1,63 0,22 0,51f 0,50 0,76g 0,07f 0,85e 1,00 ĐC: đối chứng không bổ sung MeJA 16 3.3.1.3 Ảnh hưởng salicylic acid Bảng 3.8 Ảnh hưởng salicylic acid lên sinh trưởng tích lũy eurycomanone tế bào SA (mM) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g) Eurycomanone (mg/g) ĐC 0,01 0,02 0,05 0,10 0,20 0,50 1,00 17,43b 16,32c 19,08a 14,67d 2,86e - 0,72a 0,48bc 0,56b 0,52b 0,37c - 1,70b 3,30a 3,51a 3,35a 0,9c - ĐC: đối chứng không bổ sung SA Kết trình bày bảng 3.8 cho thấy ức chế mạnh SA lên khả sinh trưởng tế bào bách bệnh nồng độ lớn 0,05 mM Ở nồng độ 0,20 – 1,00 mM SA, tế bào hóa nâu, khơng phát triển Trong đó, hàm lượng eurycomanone tăng khoản lần so sánh với mẫu đối chứng mơi trường có bổ sung SA 0,02 mM (eurycomanone đạt 3,51 mg/g khô, tương ứng 1,96 mg/bình) 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian kích kháng đến tích lũy eurycomanone 3.3.2.1 Ảnh hưởng thời điểm kích kháng YE lên tích lũy eurycomanone Hàm lượng eurycomanone tế bào xử lý 200 mg/L YE ngày thứ q trình ni cấy đạt giá trị cao 6,25 mg/g chất khơ (tương ứng 3,125 mg/bình), cao gấp 3,68 2,98 lần so với mẫu đối chứng khơng xử lý chất kích kháng mẫu rễ năm tuổi 17 Bảng 3.9 Ảnh hưởng thời điểm kích kháng YE lên tích lũy eurycomanone Thời điểm kích Khới lượng Khới lượng Eurycomanone kháng (ngày) 10 12 tươi (g) 17,08b 16,86b 17,20b 16,67b 18,21a 17,01b 18,42a khô (g) 0,49a 0,49a 0,50a 0,50a 0,52a 0,50a 0,50a (mg/g) 3,71c 3,87c 4,83b 6,25a 4,49b 2,12d 2,02d 3.3.2.2 Ảnh hưởng thời điểm kích kháng MeJA lên tích lũy eurycomanone Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian xử lý 0,02 mM MeJA lên khả sinh trưởng tế bào cho thấy MeJA ức chế mạnh sinh khối tươi, thời gian xử lý chất kích kháng dài khả sinh trưởng tế bào bị ức chế Đối với sinh khối khơ, xử lý chất kích kháng từ 8-10 ngày làm tăng khả tích lũy sinh khối khô Hàm lượng eurycomanone tế bào xử lý MeJA sau ngày nuôi cấy đạt giá trị cao 17,36 mg/g khô (9,54 mg/bình) (Bảng 3.10), cao gấp khoảng 10 lần so với mẫu đối chứng mẫu rễ năm tuổi 3.3.2.3 Ảnh hưởng thời điểm kích kháng SA lên tích lũy eurycomanone Khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy 0,02 mM SA, sinh khối tế bào tất thời điểm bổ sung giảm, bổ sung vào đầu giai đoạn sinh trưởng (2-6 ngày) ức chế mạnh Hàm lượng eurycomanone tế bào đạt cao 5,20 mg/g (2,44 mg/bình) SA bổ sung vào môi trường sau ngày nuôi cấy (Bảng 3.11) Như vậy, kích thích q trình sinh tổng hợp eurycomanone thời điểm kích kháng khác khác nhau, sinh trưởng tế bào không bị ảnh hưởng 18 thời điểm Hầu hết mẫu xử lý, sinh khối tế bào đạt từ 0,46 đến 0,56 g khơ/bình Bảng 3.10 Ảnh hưởng thời điểm kích kháng MeJA lên tích lũy eurycomanone Thời điểm kích kháng (ngày) Khới lượng tươi (g) Khối lượng khô (g) Eurycomanone (mg/g) 10 12 8,14e 8,32e 9,21d 10,43c 11,40b 13,83a 14,09a 0,48ab 0,50ab 0,55a 0,56a 0,49ab 0,42b 0,43b 6,60d 12,83b 17,36a 9,18c 5,99d 3,81e 2,77f Bảng 3.11 Ảnh hưởng thời điểm kích kháng SA lên tích lũy eurycomanone Thời điểm kích Khới lượng tươi Khới lượng Eurycomanone kháng (ngày) (g) 19,08a 15,58c 16,00c khô (g) 0,56a 0,46b 0,47b (mg/g) 3,51c 4,26b 5,20a 10 12 15,90c 17,09b 18,00b 17,36b 0,47b 0,50ab 0,53a 0,50ab 5,01a 2,37d 2,01d 1,97d 19 Chương BÀN LUẬN 4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG LÊN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA CALLUS Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sinh trưởng callus bách bệnh nhiều tác giả nghiên cứu cơng bố Trong Mahmood cs (2010) cho 2,4-D loại auxin phù hợp để cảm ứng tạo callus nhân sinh khối callus từ nhiều nguồn gốc khác bách bệnh, callus tạo thành từ mẫu lá, cuống đơn, cuống kép mầm môi trường có bổ sung 2,4-D cho kết tốt với tỷ lệ tạo callus từ 78,33-88,33% Vì vậy, chúng tơi sử dụng 2,4-D chất điều hịa sinh trưởng để khảo sát khả sinh trưởng callus Tuy nhiên, nghiên cứu 2,4-D khơng phải chất điều hịa sinh trưởng cho hiệu tốt Khi bổ sung riêng lẻ 2,4D, công thức bổ sung mg/L 2,4-D cho kết tốt nhất, số sinh trưởng callus đạt 2,52 (Bảng 3.1) Một số nghiên cứu cho thấy việc kết hợp auxin cytokinin vào môi trường nuôi cấy thúc đẩy mạnh mẽ việc tạo callus nhiều giống Theo hướng đó, chúng tơi sử dụng kết hợp NAA KIN lên khả sinh trưởng callus bách bệnh, kết thu khả quan Kết kết hợp 1,25 mg/L NAA 1,00 mg/L KIN cho thấy sinh khối callus đạt cao (32,34 g tươi/bình, tương ứng với 1,31 g khơ/bình, GI đạt tương ứng 10,7 (Bảng 3.3) Trên giới, việc sử dụng NAA KIN nuôi cấy callus bách bệnh để sản xuất hợp chất thứ cấp thực So với nghiên cứu chúng tơi, nồng độ chất điều hịa sinh trưởng mà tác giả sử dụng thấp 4.2 THIẾT LẬP NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO 4.2.1 Sự tích lũy sinh khối tươi khơ nuôi cấy huyền phù Trong nghiên cứu chúng tôi, sinh trưởng tế bào đạt cực đại vào ngày thứ 14 q trình ni cấy (Hình 3.3), khối lượng 20 tươi thu khoảng 15,67 g/bình (0,69 g khơ/bình), cao gấp 9.21 lần sinh khối tươi ban đầu Kết thu cao nhiều so với nghiên cứu công bố trước Keng cs (2010) thu sinh khối cao (3,1 g tươi/0,22 g khô) vào ngày thứ 13 nuôi cấy 0,5 g tế bào bách bệnh môi trường MSB (thay đổi từ môi trường MS) xử lý với mg/L NaH2PO4 4.2.2 Sự tích lũy eurycomanone nuôi cấy huyền phù Qua số nghiên cứu trước cho thấy, đa số trường hợp nuôi cấy callus tế bào thực vật cho hàm lượng chất thứ cấp cao nhiều lần so với điều kiện tự nhiên Nguyễn Hoàng Lộc cs (2010, 2011) nghiên cứu sản xuất solasodine từ callus cà gai leo nhận thấy hàm lượng solasodine cao khoảng 8,5 lần so với tách chiết từ rễ tự nhiên năm tuổi Đối với bách bệnh nghiên cứu này, eurycomanone sản xuất q trình ni cấy từ đầu đến ngày 20, hàm lượng cao (1,65 mg/g khô) thu vào ngày thứ 14 giống tích lũy sinh khối tế bào (Hình 3.7) Kết cao so với nghiên cứu Mohamad cs (2013), hàm lượng eurycomanone bách bệnh 6-7 năm thu thập từ Muar (Malaysia) gần 1,4 mg/g khô 4.2.3 Ảnh hưởng nguồn carbon pH môi trường Nguồn carbon xem có ảnh hưởng đến phát triển tế bào sản xuất chất có nguồn gốc thực vật ni cấy in vitro Trong nghiên cứu nồng độ sucrose 3% thích hợp cho sinh trưởng tế bào Ở nồng độ này, sinh trưởng tế bào đạt tốt, sinh khối tươi đạt 17,43 g sinh khối khô đạt 0,72 g, sản xuất eurycomanone tế bào đạt cao (1,7 mg/g) Bên cạnh nguồn carbon, pH môi trường ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng tích lũy hợp chất thứ cấp tế bào Trong nghiên cứu chúng tôi, pH 5,75 cho kết thu tốt Ở cơng thức mơi trường này, tích lũy sinh khối tươi khô, hàm lượng eurycomanone đạt cao nhất, tương ứng 17,27 g/bình, 21 0,76 g/bình 1,67 mg/g khô Kết nghiên cứu thu tương tự kết nghiên cứu Siregar cs (2004), tác giả nhận thấy pH 5,75 tối ưu cho nuôi cấy tế bào 4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH KHÁNG LÊN SỰ SINH TRƯỞNG TẾ BÀO VÀ TÍCH LŨY EURYCOMANONE 4.3.1 Ảnh hưởng chất kích kháng lên sinh trưởng tế bào Thơng thường, bổ sung chất kích kháng vào mơi trường nuôi cấy ức chế khả sinh trưởng tế bào, kết công bố nhiều cơng trình nghiên cứu trước Trong nghiên cứu chúng tơi, YE có tác động lên sinh trưởng tế bào, MeJA ức chế mạnh SA tăng khả sinh trưởng tế bào xử lý nồng độ thấp (Bảng 3.6-3.8) Đối với YE, hợp chất bao gồm nhiều thành phần khác nhau, amino acid, vitamin khống chất, Vì vậy, YE thường ức chế trình sinh trưởng tế bào bách bệnh, đặc biệt sinh khối tươi (Bảng 3.6) MeJA chất ức chế sinh trưởng tế bào tăng cường sản xuất hợp chất thứ cấp nuôi cấy rễ Bupleurum falcatum L., Taxus spp lúa Trong nghiên cứu chúng tôi, môi trường có MeJA sinh trưởng tế bào bách bệnh bị ức chế mạnh so với đối chứng (Bảng 3.7) Kết phù hợp với nghiên cứu trước ức chế MeJA lên sinh trưởng tế bào thực vật Đối với SA, hầu hết cơng trình nghiên cứu cơng bố, việc xử lý chất kích kháng SA ức chế sinh trưởng tế bào Trong nghiên cứu chúng tôi, sinh trưởng tế bào bổ sung SA thấp không bổ sung SA, khối lượng tươi lẫn khối lượng khô hầu hết công bố khác trước 4.3.2 Ảnh hưởng chất kích kháng lên tích lũy eurycomanone Từ kết nghiên cứu cho thấy, YE bổ sung vào môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến tích lũy eurycomanone tế bào bách bệnh Bổ sung YE với nồng độ từ 150-250 mg/L làm tăng mạnh hàm lượng eurycomanone, 22 nồng độ 200 mg/L hàm lượng eurycomanone cao gấp đối đối chứng (Bảng 3.6) Đối với MeJA, hàm lượng eurycomanone đạt cao nghiên cứu 6,60 mg/g khô, thu nồng độ 0,02 mM MeJA, kết cao lần so với đối chứng cao gấp đôi so với YE (Bảng 3.7) Nhìn chung, MeJA ảnh hưởng lên khả sinh tổng hợp eurycomanone tế bào bách bệnh rõ rệt YE SA, hàm lượng eurycomanone thu đạt gần gấp đôi Việc sử dụng SA làm chất kích kháng để tăng cường tổng hợp hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật phổ biến Hàm lượng eurycomanone tế bào bách bệnh tăng dần bổ sung SA từ 0,01-0,05 mM, sau giảm gần tế bào khơng phát triển chết Ở mơi trường có bổ sung 0,02 mM SA, lượng eurycomanone tế bào đạt cao (3,51 mg/g khối lượng khô), tương đương xử lý YE thấp xử lý MeJA khoảng 50% Trong nghiên cứu chúng tôi, hàm lượng SA sử dụng thấp (0,01-0,05 mM), tương đương với số nghiên cứu công bố Chẳng hạn, Yousefzadi cs (2010) bổ sung 10 µM SA vào ngày thứ ba nuôi cấy tế bào Linum album, hàm lượng podophyllotoxin thu 333 µg/g khối lượng khơ, cao gấp ba lần so với tế bào nuôi cấy môi trường không bổ sung SA 4.3.2 Ảnh hưởng thời gian kích kháng Xử lý chất kích kháng thời điểm bắt đầu nuôi cấy gây ức chế sinh trưởng tế bào bách bệnh Sinh khối khô đạt 0,570,71% (xử lý YE), 0,1-0,85% (xử lý MeJA) 0,51-0,78% (xử lý SA) so với mẫu đối chứng sau 14 ngày nuôi cấy (p