KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY TRỒNG đề tài lan hồ điệp

Đây được xem là phương pháp chính để nhân giốngvô tính lan HồĐiệp.Phương pháp này tạo ra được một tỷ lệ cao các chồi duy trìtrạng thái ngủ hoặc có thể phát triển thành cuống hoa hay chồi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÀI BÁO CÁO MÔN KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH

ĐỖ MINH KHUÊ 1218167

5 Điều kiệ sinh thái

II Kỹ thuật nhân giống

1 Nhân giống truyền thống

1.1 Nhân giống hữu tính bằng hạt1.2 Nhân giống vô tính bằng tách chiết

2 Nhân giống hiện đại

2.1 Nhân giống vô tính sử dụng chồi đỉnh

2.2 Nhân giống vô tính sử dụng phát hoa Phalaenopsis

2.3 Tạo mô sẹo2.4 Tái sinh PLB từ mô lá2.5 Tái sinh PLB từ nhiều nguồn mô2.6 Phôi vô tính

2.7 Công nghệ tạo hạt nhân tạo

3 Những vấn đề trong nhân giống vô tính

III Kỹ thuật trồng và chăm sóc

3 Lưu ý trong chăm sóc

IV Bệnh trên lan Hồ điệp

A Sâu hại

1 Rệp son

KĨ THUẬT NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY TRỒNG

TRÊN LAN HỒ ĐIỆP( PHALAENOPSIS)

I.Tổng quan:

Công nghiệp hóa, Hiện đại hóa đất nước đã và đang là xu thế chung của toàncầu, và tất nhiên Việt Nam cũng là thành viên của xu thế ấy Với quy mô côngnghiệp dần mở rộng, trang thiết bị khoa học-kĩ thuật được đầu tư ngày càng hiệnđại, nền tri thức dần nâng cao,… thì tương lai không xa Việt Nam sẽ sớm đạtđược mục tiêu đó như dự định Thế nhưng, dù khoa học, dù nền văn minh nhânloại có hiện đại đến một giới hạn nào đó thì thiên nhiên với con người vẫn luônsong hành cùng nhau không thể tách rời.Điều đó không chỉ là lí thuyết suông mà

đã được các nhà khoa học chứng minh bằng hoạt loạt các phát minh, các báo cáokhoa học nói về sự tác động, ảnh hưởng của tự nhiên đến thế giới loài người.Vàtất nhiên khi nói về thế giới, về những bí ẩn của động thực vật lại luôn là những

đề tài có sức hút kì lạ với chúng ta Thế nên, một ví dụ điển hình: “ Lan Hồ Điệp”,

đã được tìm ra, được ứng dụng và thu lại lợi ích từ nó là điều rất thiết thực Hiện

nay Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) nói chung với các loại Lan khác nói riêng

được xem là cây trồng đem lại nhiều hiệu quả kinh tế cao; do đó đã có nhiều nhàvườn mạnh dạn đầu tư chuyển đổi cơ cấu cây trồng từ lúa, hoa màu sang trồngLan và đạt hiệu quả kinh tế cao gấp 2 - 3 lần so với cây trồng khác Lan Hồ Điệp

là một trong những loài lan đang rất được ưa chuộng và đóng vai trò quan trọngtrong ngành công nghiệp hoa cắt cành cũng như cây cảnh trên thế giới Khôngnhững chỉ mang lại giá trị cho nền kinh tế nước nhà mà chúng còn là biểu tượngcho “sắc đẹp” Chúng đẹp về màu sắc, kiểu dáng và mang một vẻ đẹp sang trọng

và trang nhã Tượng trưng cho sự ngây thơ, trong sáng Không chỉ là sứ giả truyềntải cảm xúc một cách nhẹ nhàng, hoa còn mang đến cho chúng ta vẻ đẹp tinh khiếtcủa tự nhiên, nét quyến rũ, sự sang trọng cho không gian sống

+Ở phương Đông, lan được chú ý đến vì vẻ đẹp duyên dáng của lá,hương thơm của hoa do đó Khổng Tử đề cao lan là vua của những loài cỏ cây cóhương thơm

+Riêng với LanHồ Điệp thì được khám phá vào năm 1750, đầu tiên đượcông Rumphius đặt tên là Angraecum album Đến năm 1753 thì Linne đổi tênthành Epidendrum Năm 1825, nhà thực vật Hà Lan định danh lại làPhalaenopsis

- Lịch sử nghiên cứu:

+ Thế giới:

Năm 1949, ông Rotor là người đầu tiên nhân giống lan Hồ Điệp bằngcách sử dụng cành phát hoa Đây được xem là phương pháp chính để nhân giống

vô tính lan HồĐiệp.Phương pháp này tạo ra được một tỷ lệ cao các chồi duy trìtrạng thái ngủ hoặc có thể phát triển thành cuống hoa hay chồi sinh dưỡng

Tanaka và Cộng sự (1976) đã sử dụng đỉnh rễ của cây lai phalaenopsistạo protocorm Ông là người đầu tiên nghiên cứu tập trung trên việc tối ưu hóaquy trình tạo chồi dinh dưỡng và nuôi lá ở nhiều yếu tố như protocorm, ánhsáng, nhiệt độ Tuy nhiên, hiệu suất vẫn chưa cao đồng thời không ứng dụngđược trên nhiều giống

Các thí nghiệm của Tanaka và Sakanishi (1977) cho thấy chồi ở các phầnphía trên có xu thế duy trì trạng thái ngủ bất chấp ảnh hưởng của nhiệt độ.Cácchồi nảy mầm đặt ở 200C hoặc 250C sẽ tăng trưởng sinh sản (trừ một số chồi ởphần gốc) và ở 280C các chồi đều tăng trưởng sinh dưỡng Chồi nuôi cấy đang ởtrạng thái ngủ sẽ được kích thích nảy mầm nếu bổ sung BA vào môi trường

Năm 1991, Sajise và Sagawa đã đưa ra báo cáo đầu tiên về sự hình thành

mô sẹo tạo phôi (embryogenic) và Tokuhara và Mii (2000) đã thực hiện cảmứng thành công mô sẹo tạo phôi từ các mẫu cấy đỉnh chồi trên cuống hoa lan hồđiệp trên môi trường NDM (New Dogashima Medium) và cấy chuyền thànhcông mô sẹo sang dạng huyền phù trong môi trường NDM lỏng

Young, Murthy và Yoeup (2000) đã thành công trong việc sử dụngbioreactor để nuôi cấy PLB từ các đoạn cắt lá, sau 8 tuần nuôi cấy, họ đã thuđược khoảng 18.000 PLB từ khoảng 1.000 PLB ban đầu trong 2 lít môi trườngHyponex Các PLB này được chuyển sang môi trường Hyponex rắn để tạo câycon

Năm 2002, Park So Young và Cộng sự, khảo sát tối ưu hóa quá trình tạoprotocorm từ lá, đưa ra quá trình hoàn chỉnh và kiểm chứng trên nhiều giống lan

Hồ Điệp khác nhau

Theo nhiều tác giả khi tái sinh thành cây con từ protocorm chỉ cần sửdụng các môi trường khoáng có bổ sung nước dừa, khoai tây…mà không sửdụng bất kì chất điều hòa tăng trưởng nào Tanaka và Sakanishi (1985) vàTanaka (1987) đã sử dụng môi trường Knudson C cải tiến, còn Haas-vonSchmude (1983,1985) sử dụng môi trường MS trong việc tái sinh cây con từprotocorm Griesbach (1983)sử dụng môi trường Murashige và Skoog cho việctái sinh cây con từ protocormtrong khi Lin (1986) sử dụng môi trường Knudson

C cải tiến có bổ sung BA (1mg/l) để chuyển protocorm thành cây con

Các nghiên cứu về chuyển gen cho phép đưa các tính trạng đặc biệt vàolan Hồ Điệp như khả năng tổng hợp sRNA kháng virus gây cháy lá, khả năngtổng hợp chất cay trong mù tạt để kháng bệnh (theo Rimaldi Sjahril, 2006) Cóthể trong tương lai, thế hệ lan Hồ Điệp mang gen kháng acetylene có hoa lâu tàn

sẽ được sản xuất và bán rộng rãi trên thị trường (theo Chai và Senthil, 2002)

-Việt Nam:

Bước đầu tìm hiểu về sự nuôi cấy in vitro lan Hồ Điệp (Phalaenopsis

sp),Võ Thị Bạch Mai 1996 và Lê Văn Hướng cho rằng dưới tác động của auxinvàcytokinin được bổ sung riêng lẻ hay kết hợp vào môi trường MS cải tiến Khi

có bổ sung 5 ppm BA và 1ppm 2,4 D, mô cấy được kích thích tạo ra tiền củ.Trong môi trường MS bổ sung 2 ppm BA, mô cấy sẽ phát triển thành cây hoànchỉnh

Khi “nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống và nuôi trồng lan

Phalaenopsis” Nguyễn Quang Thạch và cs (2003), đã sử dụng vật liệu nuôi cấy

mô khởi đầu bằng lá non, mắt ngủ trên phát hoa và đỉnh phát hoa

Liêu Hồng Phú 2005 nghiên cứu tạo phôi và hạt nhân tạo lan Hồ Điệpđược thực hiện tại Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm Tp.HồChí Minh nhằm tìm hiểu ảnh hưởng của các chất kích thích tố sinh trưởng vàcác loại môi trường đến khả năng tạo mô sẹo, phát sinh phôi, tái sinh chồi và tạohạt nhân tạo lan Hồ Điệp

Theo Trần Thị Dung, Trịnh Pari và Liêu Hồng Phú (2005): Khi nuôi cấyphát sinh mô sẹo từ protocorm trên môi trường VW (Vacin &Went) có bổ sung0,01 mg/ l BA + 200 mg/ l nước dừa + 40 g/ l đường cho khả năng tạo mô sẹocao nhất Đối với việc tạo phôi, môi trường thích hợp nhất là VW có bổ sung2mg/ lTDZ sau đó cấy chuyền sang môi trường ½ VW Môi trường tốt nhất choviệc tái sinh lan Hồ Điệp từ phôi là môi trường VW + 30 g/ l khoai tây + 1g / lthan hoạt tính

Theo Cung Hoàng Phi Phượng và Cộng sự (2007) sử dụng hệ thống nuôicấy ngập chìm tạm thời sẽ cung cấp chất dinh dưỡng và không khí cho các môsẹomột cách chủ động Cũng nhờ đó hệ số nhân giống cây cao gấp 5-6 lần sovới cách nhân giống lan Hồ Điệp bằng phương pháp sinh sản vô tính Trong môitrường nuôi cấy ngập chìm tạm thời, các mô phát triển nhanh và nhân chồi liêntục Trung bình, từ một mô sẹo sau 2-3 tháng có thể cho 20- 25 chồi con Cácchồi này có lálớn và ra rễ rất nhanh, chồi phát triển thành cây con chỉ sau 2- 3tháng Khi đưa ratrồng ở môi trường tự nhiên, 100% cây con được nuôi cấybằng kỹ thuật nói trênđều sống và phát triển tốt

Theo Dương Tấn Nhựt và cs (2007) sử dụng vật liệu nuôi cấy khởi đầu làprotocorm có màu xanh, đường kính từ 1- 1.5 mm cấy chuyền 2-3 tháng 1lần,

môi trường MS cơ bản bổ sung 2mg/ l BA, 1mg / l NAA và 20% nước dừa và

hệ thống nuôi cấy bioreactor ( bioreactor với hệ thống cung cấp và xả môitrường, hệ thống cấp và thoát khí vô trùng được thiết kế có khả năng tạo ra mộtmôi trường nuôi cấy vô trùng, kiểm soát các yếu tố môi trường bên trong như:

sự lắc, sự thoáng khí, nhiệt độ, oxi hòa tan, pH,…) rất thích hợp để nhân nhanhprotocorm ( là những cấu trúc tế bào nhỏ và được phát triển từ phôi hoặc từnuôi cấy đỉnh chồi sau vài tuần, thường có dạng hình cầu với đường kính 1-2mm, có màu xanh, được sử dụng trong nhân giống in vitro để hình thành phôisoma ) của lan Hồ Điệp

Monosaccharide (đường mía) không thích hợp cho nuôi cấy phôi vôtínhcây lan Hồ Điệp, đặc biệt D- fructose có tác động rất xấu đến mẫu cấy (gâychết100% mẫu) Các disaccharide thích hợp hơn cho nuôi cấy phát sinh phôi từmẫu đoạn mắt ngủ là phương pháp nhanh chóng và luân phiên để nhân giốngcây trồng, nhờ cấy mô sẹo Môi trường nuôi cấy bổ sung 20g / l sucrose sẽ chohiệu quả phát sinh phôi cao nhất (Dương Tấn Nhựt và Cộng sự, 2007)

Theo Trần Thị Kim Liên (2008) khi nghiên cứu khả năng phát sinh chồitừmắt ngủ trên phát hoa lan Hồ Điệp cho thấy: việc nuôi cấy mô từ các chấnthương,sẽ đạt được nhiều cây con Hồ Điệp hơn so với các khúc mắc bìnhthường chỉ chomột cây con duy nhất Môi trường thích hợp để phát sinh chồi làmôi trường MScó bổ sung 1 mg/ l BA và 2 mg/ l NAA

Hoàng Thị Hiền, 2009 Đề tài nghiên cứu “Xác định nồng độ nước javelcho quá trình khử mẫu phát hoa lan Hồ điệp.Ảnh hưởng của chất điều hòa sinhtrưởng BAP, TDZ, NAA đến quá trình sinh trưởng, phát triển của lan hồ điệp lai

(Phalaenopsis sp.) in vitro” được tiến hành tại phòng di truyền và chọn giống

-Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam

CN.Sinh học Đặng Thị Ánh Tuyết, 2009, đề tài nghiên cứu “Ứng dụngphương pháp nuôi cấy lỏng tĩnh để nhân nhanh giống lan Hồ điệp

(Phalaenopsis sp)” Tại Trung tâm Ứng dụng và Chuyển giao công nghệ Phú

Yên

Hồ Phan Thiết Toàn, 2011, đề tài nghiên cứu “Khảo sát một số yếu tốmôi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của lan Hồ Điệp

(Phalaenopsis) in vitro.” Tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của phòng Khoa

học nông nghiệp – CNSH, Trường Cao Đẳng Nguyễn Tất Thành Quận 4 TP HồChíMinh

2.Phân bố:

-Thế giới:Hồ Điệp phân bố chủ yếu ở Malaysia, Indonesia, Philippin,phía đông Ấn Độ và Úc

Loài Phân bố

Phalaenopsis amabilis Đông Malaysia đến Papuasia

Phalaenopsis amboinensis Sulawesi đến Moluccas

Phalaenopsis aphrodite Đông Nam Đài Loan đếnPhilippines

Phalaenopsis appendiculata Malaya đến đông bắcBorneo

Phalaenopsis chibae Việt Nam

Phalaenopsis fasciata Philippines

Phalaenopsis luteola Tây Bắc Borneo

Chúng có thể mọc ở nơi có khí hậu nhiệt đới và đồi núi cao 2000m, vìvậy chịu được khí hậu nóng ẩm và cả khí hậu mát.

-Việt Nam: Cũng có một số loài, nhưng có hoa nhỏ nên được gọi là Tiểu

Hồ Điệp ( phalaenopsis manni, gibbsa, lobbi, fuscata, cornucervi).

Bên cạnh đó, Lan Hồ điệp không trồng được tại các vùng lạnh như ĐàLạt song với đặc tính vừa chịu khí hậu nóng ẩm lại vừa chịu khí hậu mát nênđiều kiện tự nhiên của Di Linh được xem là địa điểm lí tưởng để nuôi trồng lan

Hồ điệp Tại đây toàn bộ Lan Hồ điệp đều nuôi trồng trong nhà kín bằng nguồngiống cấy mô và được trang bị lưới che, hệ thống quạt gió… để chủ động điềuchỉnh lượng ánh sáng và nhiệt độ thích hợp trong từng giai đoạn tăng trưởng,phát triển cụ thể của cây Tuy nhiên, cần chú ý đến nguồn giống khỏe mạnh,sạch bệnh và khả năng cung cấp với số lượng lớn

- Họ lan của nước ta cũng phong phú, theo thống kê sơ bộ có 140 chi,trên 800 loài Như vậy, hoa phong lan đã trở thành một đối tượng cực kỳ phongphú và đặc sắc của hệ thực vật Việt Nam

-Phân loại theo hình thái:

Lan Hồ Điệp có nhiều loại nhưng thường được chia làm hai nhóm chính:+ Nhóm có cành hoa dài ( dài đến 1m), thân được phân nhánh, lớn, vàhầu hết hoa có viền màu hồng hoặc trắng

+ Nhóm có thân ngắn và không tròn, hoa có nhiều màu sắc

Bên cạnh đó còn có nhiều chi lan khác được lai với Phalaenopsis và lai

ngay trong cùng chi, tạo ra 40.000 loài lai (Nguyễn Thiện Tịch và Cộng sự,1996), chi lan Hồ Điệp có thể chia ra thành 5 nhóm trong đó có 2 nhóm quantrọng đó là:

+ Nhóm Euphalaenopsis:Với các loài tiêu biểu là Ph.amabilis,Ph.aphrodite, Ph.philippinensis, Ph.sanderiana, Ph.schilleriana, Ph.stuartiana…chúng có đặc điểm nổi bật là cánh hoa dài và rộng hơn lá đài, cánh môi rộng và

có hai phụ bộ riêng biệt ở phía trước, bộ lá thường có màu lục đậm hơn ở mặttrên nâu sẫm ở mặt dưới, hoa nhiều và mảnh mai

Phalaenopsis stuartiana Phalaenopsis schilleriana Phalaenopsis amabilis

Phalaenopsis philippinensis Phalaenopsis sanderiana

+ Nhóm Stauroglottis chúng có đặc điểm khác biệt như sau: lá dài vàcánh hoa cùng một cỡ, cánh môi hẹp và không phụ bộ ở phía trước, bộ lá cómàu xanh lục nhạt ở cả mặt trên và mặt dưới lá, hoa nhỏ hơn và cánh dày hơnthường có màu hoa văn, một vài loài tiêu biểu là P.amboinensis, P.gigantea theo(Phạm Hoàng Hộ, 2000)

Phalaenopsis amboinensis Phalaenopsis venosa Phalaenopsis gigantean

Phalaenopsis lindenii Phalaenopsis violacea

Việt Nam có 7 loài Phalaenopsis: P.amabilis (L), P.cornucervi, P.lobbi,

P.gibbosa, P.mannii Reichbf, P.petelotii Mansf, P.fuscata Reichhf

4.Đặc điểm của cây:

Hồ Điệp là cây đơn thân nhưng rất ngắn, có lá mọc khít nhau nên không

có lóng, lá tương đối dày và mập, thường rộng ở phần trên, hẹp ở phần dưới,phát hoa ở nách lá, thường hay đứng có thể phân nhánh, hoa nhỏ hay khá to,mỗi hoa bền khoảng 2 – 3 tháng Vì vậy, cành hoa nở liên tiếp hơn nửa năm, láđài và cánh hoa gần như nhau, đôi khi cánh hoa lớn hơn, nhưng nổi bật là cánhmôi Môi gắn vào chân của trụ và không có cựa ở đáy, ba thùy với phụ bộ haycục u ở đáy thùy giữa, hay thùy bên, một trong những phụ bộ ấy là hai sợi râucủa môi hay phiến nhỏ dựng đứng ở thùy môi Trụ tương đối dài và nhỏ, haikhối phấn tròn hay hình trứng, vĩ phấn kéo dài, rộng ở phần trên và hẹp ở phầndưới, gót dẹp, nhiều loài thường cho cây con trên cọng phát hoa và nhiều loài cóvân màu trên lá

- Cơ quan sinh dưỡng:

+ Rễ:

Hệ rễ của lan Hồ Điệp rất đặc biệt Nó thuộc dạng phân nhánh, có dạngtròn, to, mập và có lông hút rõ ràng, rễ không phân chia thành rễ chính, rễ phụ.Rễthường có màu trắng, đầu rễ màu xanh, màu vàng trắng hoặc màu đỏ tối.Rễcủa chúng thường mọc tràn ra ngoài chậu, buông lơ lửng ra không khí, có lợicho việc hút ôxi và nước

Mặc khác, ngoài chức năng cố định cây ở bên dưới và hấp thụ nước, cácchất dinh dưỡng,… thì trong rễ còn chứa cả chất diệp lục nên có khả năng quanghợp và đồng hóa.

\ Hình ảnh của rễ lan Hồ Điệp

Do hạt của hoa lan nói chung đều không có nội nhũ, không được cungcấp đầy đủ dinh dưỡng khi nảy mầm, trong điều kiện nảy mầm tự nhiên, cần dựavào các nấm cộng sinh để hút chất dinh dưỡng Trong quá trình sinh trưởng của

cây, các loài nấm này sống cộng sinh tại rễ của cây lan để hỗ trợ lẫn nhau, vì thế

rễ lan còn được gọi là rễ nấm Đó cũng là lý do rễ lan Hồ Điệp có nấm cộng sinh

và chúng ta cần cẩn thận khi tưới nước và bón phân cho lan Hồ Điệp

+ Thân:

Lan Hồ Điệp thuộc loại đơn thân, tức là thân của chúng rất ngắn, không

hề có giả hành, cũng không có thời kì ngủ nghỉ rõ rệt Lan đơn thân sinh trưởngrất chậm chạp, thân chính của nó trong môi trường thuận lợi hàng năm lại mọc

ra các lá mới, chúng mọc theo hướng cao hơn theo phương thẳng đứng còn cáccành hoa thì mọc ở rìa thân hoặc nảy ra từ nách lá, lá mọc xếp thành hai hàng,xem kẽ nhau Theo sự sinh trưởng của cây, các lá già ở dưới gốc dần héo vàrụng đi, đến khi có chồi nách mọc ra, nhưng không mọc dài ra được Vì cây lanthường rất khó ra chồi, nhánh nên không dùng phương pháp tách lấy cây đểnhân giống Thân của lan Hồ Điệp ngoài tác dụng giữ cho cây thẳng đứng, còn

có chức năng tích trữ chất dinh dưỡng và nước cho cây

Hình ảnh của thân lan Hồ Điệp

+ Lá:

Lá của lan Hồ Điệp to, dày, đầy đặn Lá mọc đối xứng, ôm lấy thân Số

lá trên thân cây thường không nhiều, thông thường 1 cây lan trưởng thành có từbốn lá trở lên Trong nách lá có hai chồi phụ, chồi phụ trên to hơn là chồi sơcấp, bên dưới là chồi dinh dưỡng sơ cấp.Các chồi sơ cấp này sinh trưởng đếnmột mức độ nào đó thì bắt đầu đi vào giai đoạn ngủ nghỉ Màu sắc của lá gồm

ba loại: lá màu xanh, mặt trên và dưới lá màu đỏ, mặt trên lá đốm và mặt dưới làmàu đỏ Căn cứ vào màu sắc có thể phân biệt được màu sắc hoa của chính nó, lá

màu xanh thường ra hoa màu trắng hoặc hoa nhạt màu, còn các lá màu khácthường cho hoa màu đỏ.

Lá có khả năng quang hợp cố định cacbon và chức năng đồng hóa để lưutrữ cacbon có sẵn.Ngoại trừ Ca và Mg thì phần lớn các chất dinh dưỡng khác cóthể được hập thụ trực tiếp từ lá.Chính vì thế, nguồn cacbon chủ yếu trong cây đểcung cấp cho cành hoa và hoa là đều từ lá

Hình ảnh của lá lan Hồ Điệp

Lan Hồ Điệp dễ thích nghi với điều kiện sinh thái nguyên sinh, thôngthường bề mặt trên của lá không có khí khổng, chỉ có mặt dưới của lá mới cókhí khổng Lan Hồ Điệp là loại thực vật CAM, giống như các thực vật CAMkhác nên khi khổng mở ra vào ban đêm thu nhận khí CO2 để tạo ra chất dự trữtrong cơ thể, vào ban ngày khí CO2 đó được sử dụng cho quá trình quang hợp.

Ưu điểm của loại thực vật này là khí khổng không mở vào ban ngày nên câykhông bị mất nước do quá trình thoát hơi nước Điều kiện này đối với cây khôngđược cung cấp nước thường xuyên rất có lợi Khi cây có đủ nước thì khí khổngcũng mở ra vào ban ngày để hút khí CO2 và quang hợp bình thường Nếu gặpphải điều kiện khô khạn nghiêm trọng thì khí khổng sẽ đóng lại, quá trình quanghợp diễn ra chỉ vừa đủ cho lượng cacbônic tạo ra trong quá trình hô hấp Đâychính là nguyên nhân khiến cho cây lan Hồ Điệp có khả năng chống, chịu hạntốt mặc dù không có giả hành

- Cơ quan sinh sản:

+ Hoa:

Cành hoa của lan Hồ Điệp mọc ra từ nách lá, thông thường đếm theo thứ

tự từ trên xuống thì cành hoa bắt đầu mọc ra từ lá thứ ba hoặc thứ bốn Các cànhhoa có thể phân nhánh hoặc không phân nhánh Hoa lan to thường ít phânnhánh, còn hoa lan nhỏ phân nhánh rất rõ ràng, thậm chí một số giống hoa lannhỏ có thể nở đến 200 bông hoa Cành hoa khi chưa phân hóa các đốt hoathường ở dạng tiền chồi nách hoặc tiền chồi hoa, ở nhiệt độ dưới 15 độ và bịbấm ngọn có nảy thành chồi hoa, nhưng nếu nhiệt độ cao quá 28 độ thì chỉ cóthể nảy chồi nách Cơ quan này cũng có chứa diệp lục ( nên màu sắc tự nhiêncủa nó là màu xanh) và khả năng quang hợp giống rễ, lá Tuy nhiên, vật liệuđồng hóa không đủ đáp ứng cho nhu cầu của cành hoa và hoa, thế nên vẫn nhờ

sự cung cấp từ lá

Hình ảnh của hoa lan Hồ điệp

Đa số các giống hoa đơn cây chỉ ra một cành hoa, có một số giống kháchoặc trong điều kiện tốt cho chồi hoa phân hóa có thể mọc ra hai hoặc ba cànhhoa Nói chung, hoa lan Hồ Điệp đơn cây nếu phân hóa số cành hoa nhiều hoặccành nhánh càng nhiều thì hoa nhỏ do bị hạn chế dinh dưỡng Để trồng được lan

Hồ điệp có bông hoa to đẹp, cần phải khống chế số bông trên một cành, hoặc cắtbớt đi một số cành nhánh

Để đánh giá và thưởng thức hoa, người ta dùng hai khái niệm “hoa đềuđặn” hoặc “hoa cực kì đều đặn“ Hoa đều đặn là chỉ cánh hoa đều to rộng, giữacác cánh hoa không có khe hở rất nhỏ, cánh môi trải xuống tạo dáng hình elíp,

tất cả bông hoa tạo nên dáng hình tròn, còn loại “cực kì đều đặn” là hoa chỉ cóhình dáng rất tròn, cánh hoa chồng khít lên nhau, không có khe hở Loại có khe

hở khá lớn là hoa không đều đặn

Hình ảnh của quả và hạt lan Hồ Điệp

5 Yêu cầu sinh thái của cây lan:

-Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của lan Hồ Điệp:

+Kiểu gen: các đặc điểm của kiểu gen rất đa dạng, bao gồm: màu sắchoa, kích thước hoa, số lượng cành hoa, số lượng hoa, chiều cao thân,…

+Tình trạng của cây: cây phải đủ trưởng thành trước khi làm mát, chấtkhô đầy đủ lưu trữ trong cây, cây phải được bảo vệ chống lại thiệt hại của dịchbệnh, virut, thiệt hại hóa chất, muối tích tụ trong cây trồng.

+Môi trường: phải đảm bảo rằng sự kết hợp của các yếu tố này là tối ưunhất, bao gồm: ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ, nước tưới, phân bón, chậu…

II Nhân giống Lan hồ điệp

1 Nhân giống truyền thống

1.1 Nhân giống hữu tính bằng hạt

Trong môi trường tự nhiên, lan được thụ phấn nhờ vào côn trùng Cánhmôi hoa lan có cấu tạo đặc biệt và hình dáng thuận lợi cho côn trùng đậu vào,tiếp xúc với khối phấn và mang đi Thường thì tỉ lệ thụ phấn thành công thấpnên con người muốn thu hạt phải chủ động thụ phấn cho cây Những hạt củachúng thường rất nhỏ, có dạng bột, không phôi nhũ mà chỉ có một lớp vỏ rấtmỏng, trong điều kiện tự nhiên rất khó tự nảy mầm thành cây con, thường phảigieo hạt trong môi trường vô trùng thích hợp mới có thể thu được cây con

Năm 1899, nhà thực vật Pháp Noel Bernard đã phát hiện ra điều làm chohạt lan có thể nảy mầm: có liên quan tới sự cộng sinh của nấm, hệ rễ của nấmxâm nhập vào hạt lan và cung cấp nguồn cacbon cho phôi phát triển

Năm 1922, Knudson đã nghiên cứu thành công việc thay nấm bằng

đường ở môi trường thạch để gieo hạt Gieo hạt in vitro có thể làm cho các hạt

chưa chín nảy mầm và việc khử trùng cả quả dễ dàng hơn Khi quả chín 2/3, cóthể khử trùng bằng dung dịch thuốc tẩy và cồn Sau đó, dùng dao tách vỏ và lấyhạt ra để lên môi trường nuôi cấy trong điều kiện vô trùng, hạt sẽ nảy mầm theo

2 cách:

-Mọc qua thể tiền chồi: khi mới nảy mầm hình thành nên thể tiền chồimàu trắng, lớn dần lên, trên bề mặt sẽ xuất hiện rễ giả dạng lông hút, thể tiềnchồi này sẽ chuyển sang màu xanh lục, nhưng không mọc dài thêm nữa Trênchóp của thể tiền chồi sẽ nảy chồi Thông thường thì các thể tiền chồi này cókhả năng phân hóa thành cây.

-Mọc qua thân rễ: khi hạt nảy mầm ban đầu là thể màu trắng, sau đó sẽmọc dài ra rất nhanh tạo thành một dạng hình trụ dài, rồi hình thành nên thân rễ.Sau đó trên các kẽ của bề mặt thân rễ mọc ra các rễ giả dạng lông mao, trên môitrường phân hóa, đỉnh chồi của thân rễ sẽ mọc ra cây con, nhưng tỉ lệ phân hóa

ra cây con rất thấp

Chuyển cây con sang môi trường mới sau mỗi 30 - 60 ngày Khi cây con

có 2 – 3 lá thì rễ bắt đầu hình thành Khoảng 6 tháng sau thì có thể chuyển câycon ra vườn ươm Quá trình nhân giống này cho tới khi cây trưởng thành chohoa mất khoảng 4 năm hoặc nhiều hơn nữa tùy vào từng giống

Nhân giống bằng phương pháp này tốn rất nhiều thời gian, cây con mang

tỉ lệ biến dị cao, các cây con không đồng nhất về mặt di truyền và cây con chohoa không đẹp như cây mẹ Từ những bất cập liên quan trực tiếp tới giá trị củalan hồ điệp mà người ta ít sử dụng phương pháp gieo hạt

1.2 Nhân giống vô tính bằng cách tách chiết

Thời vụ tách chiết tốt nhất đối với các loại lan là vào đầu mùa tăngtrưởng Thường là mùa mưa, ẩm độ tốt hoặc là trồng trong các nhà kính mangtiểu khí hậu nhân tạo thì có thể tiến hành tách chiết quanh năm

Hồ điệp là loại đơn thân, nhưng nếu biết chăm sóc và có biện pháp thíchhợp thì tạo được cây con ở gốc cây mẹ (thường tiến hành trên cây lớn hơn 3năm tuổi) và ở gốc phát hoa

a Tách chiết cây con mọc từ cây mẹ

Ở những loài đơn thân như phalaenopsis không có giả hành nhưng trồng

lâu năm vẫn lên cao và cho nhiều rễ gió Muốn cắt trồng nên cắt phần ngọn có3-4 rễ gió, bôi thuốc kích thích ra rễ, trồng phần ngọn trong giá thể thoáng vớithan gỗ.Phần gốc còn lại chăm sóc tốt và bón phân đầy đủ thì nó sẽ nảy chồi 2-3cây con ở nách lá Thông thường, để giữ lại cây mẹ khỏe mạnh, thì không cắtngọn mà buộc dây kẽm vào thân cây mẹ trên 2-3 lá dưới cùng (hình 1.2a1,a2) đểhạn chế sự phát triển của phần ngọn, tập trung dinh dưỡng cho cây nảy chồi con.Dây kẽm buộc lún sâu vào khoảng 1mm là được Bón phân và tưới nước đầy đủ,khoảng 1-2 tháng sau ở phần nách lá dưới gốc cây mẹ bắt đầu nhú chồi non Ởgiai đoạn này không nên tưới nước lên chồi và không để giá thể chạm vào chồi,

vì chồi non rất dể bị thối nhũn.Trong thời gian chờ chồi non nảy mầm, nếu dâykẽm lỏng thì cứ siết thêm vào cho vừa chặt là được.Khi chồi non đã nhú lên nhưvậy, tiến hành mở dây cho cây mẹ Để cây con phát triển cùng với cây mẹ trongvòng 6 tháng là cây hoàn chỉnh rễ, thân, lá và có thể tách khỏi cây mẹ sang mộtchậu mới

Ngoài ra, phương pháp nhân giống lan Hồ Điệp từ phát hoa cũng được sửdụng phổ biến Cho Hồ Điệp mọc cây con trên phát hoa nhờ nguồn dinh dưỡngcủa cây mẹ (hình 1.2a3).Cách này thường dùng khi phát hoa sắp tàn, nhưngkhông nên để phát hoa héo quá.Lúc này, cắt phát hoa chừa lại 1 đoạn có 3-4chồi ngủ phát hoa trên cây mẹ.Chăm bón tốt cây mẹ, khoảng 1 – 2 tháng sau thìchồi con nhú ra từ mắt ngủ của gốc phát hoa Khi cây con đã có hệ rễ khỏemạnh (6 tháng) tách chiết cây con trồng vào chậu mới

Hình1.2 a1,2 : keiky từ gốc cây mẹ phalaenopsis

Hình 1.2a3: keiky từ phát hoa phalaenopsis

b Tạo cây con bằng cách giâm phát hoa.

Bước 1: chuẩn bị đất kĩ càng

Ngâm các viên than bùn dưới vòi nước cho tới khi thấy ngấm đủ nước

là được

Trải than bùn vào một khay nhựa nhỏ, lấp khoảng trống giữa các viênthan bùn bằng cát silica

Thêm vào khay đất một ít nước + một ít nước dừa

Bước 2: chuẩn bị mẫu

Đầu tiên, ta chọn phát hoa to, khỏe, bông đẹp, phát hoa chỉ mới nở 1

-2 bông

Bỏ mắt ngủ đầu tiên, cắt phát hoa ra làm các đoạn có độ dài bằng nhau,khoảng 3 cm (cắt lấy 3 -4 đoạn).Theo nghiên cứu thì các mắt ngủ thứ 2-3-4-5 có

tỉ lệ nảy chồi cao hơn các mắt ngủ ở gần ngọn (hình 1.2b1).Lưu ý: dùng dao bén

đã khử trùng cắt thật gọn lẹ, tránh làm mô bị dập nát, tổn thương, nên cắt xéo 1góc 45 độ

Cắt cành xong tiến hành gỡ bỏ lớp màng bao thật cẩn thận, tránh làm trầyxướt, tổn thương tới mắt ngủ (hình 1.2b2)

Đặt mắt ngủ cào trong khay đất đã chuẩn bị: đặt nằm ngang như hình

vẽ, chồi hướng lên trên (hình 1.2b3)

Đậy hộp bằng nắp nhựa hoặc túi ni lông để đảm bảo độ ẩm, để hộp ởnơi ấm và có tránh ánh nắng trực tiếp (hình 1.2b4)

Kiểm tra mỗi 3-4 ngày để chúng có đủ độ ẩm

Hình1.2b1: vị trí cắt phát hoa

Hình 1.2b3,4: mắt ngủ trước và sau khi gỡ bỏ màng bao

Hình 1.2b3: đặt mắt ngủ vào khay

Sử dụng phương pháp tách chiết, giâm phát hoa này có thể giúp

phalaenopsis ra hoa trong vòng 18 tháng đến 2 năm.

Việc nhân giống vô tính bằng phương pháp tách chiết truyền thống tạođược cây con đồng nhất nhưng thời gian nhân giống rất dài và hệ số nhân rấtthấp Hơn nữa cây con tạo ra có sức sống không cao Phương pháp nhân giốngnày chỉ thích hợp với những người trồng lan để thưởng thức Muốn trồng vớiqui mô lớn thì không thể áp dụng phương pháp này

2 Nhân giống hiện đại

2.1 Nhân giống vô tính sử dụng chồi đỉnh.

Phương pháp nuôi cấy chồi đỉnh tạo PLB lần đầu tiên được biết tới dotrường đại học Hawai thực hiện (Intuwong và Sagawa, 1974) Vật liệu là chồiđỉnh mang 6-7 lá non của các cây P amabilis, P.x Star của Santa Cruz, P xSurfrider, P x Ituby Lips, P.x Arcadia, và P.cochlearis

Phương pháp nhân giống vô tính sử dụng chồi đỉnh được ứng dụng thànhcông cho nhiều loại lan Tuy nhiên, đối với các loài lan đơn thân như

Phalaenopsis, khi sử dụng phương pháp này sẽ làm tổn thương cây mẹ Mặt

khác nguồn mẫu rất hạn chế nên phương pháp này ít được sử dụng

2.2 Nhân giống vô tính sử dụng phát hoa Phalaenopsis

Gavino Rotor là người đầu tiên thành công trong việc nhân giống vô tính

in vitro lan hồ điệp khi ông còn là nghiên cứu sinh của trường đại học Cornell.

Ông đã sử dụng phát hoa bỏ lá bắc mang 4-6 chồi ngủ, cắt phát hoa thành cácđoạn mang một chồi nằm giữa cách 2 đầu cắt 7-8 cm sau đó khử trùng bề mặt

và cắt vô trùng thành các đoạn cách hai đầu 1-2 cm Cấy các đoạn phát hoa vàomôi trường Knudson C làm rắn với agar, các đoạn phát hoa được cắm thẳng chochồi hướng lên Phương pháp này của ông ít được nhắc tới vì tỉ lệ nhiễm quá

nhiều và hệ số nhân thấp Khoảng 10 năm sau những nhà nghiên cứu khác đãtạo ra nhiều quy trình mới dựa trên phương pháp này Nghiên cứu của nhómErnst (1984) cho thấy khi nồng độ cytokinin trong môi trường tăng lên sẽ cảmứng tạo cụm chồi và hình thành cây con từ nốt phát hoa Về sau rất nhiều nhànghiên cứu quan tâm tới hướng này.

Đây là một quy trình đơn giản tạo chồi từ phát hoa lan hồ điệp Từ mẫuphát hoa, đoạn mang mầm ngủ được cắt ngắn, các mẫu này được lau bằng cồn

70o.Sau đó được rữa trong dung dịch có vài giọt teepol, rữa mẫu với nước sạch

và khử trùng trong dung dịch hypocloric canxi 7% trong 10 phút, rữa lại vớinước cất vô trùng từ 3-4 lần.trong tủ cấy vô trùng, các đoạn trên được cắt cáchđầu trên và đầu dưới mang mầm 1.5 cm, tách vẫy lá bao mầm Sau đó mẫu đượccấy trong các môi trường dinh dưỡng MS có bổ sung BA 3 mg/l và đặt nuôitrong điều kiện nhiệt độ là 25oC, chiếu sáng 12 giờ/ngày và ẩm độ từ 75 – 80%.Sau 2-3 tháng chồi phát triển, cấy chuyền sang môi trường REM chứa 10%nước chuối xay và không có chất điều hòa sinh trưởng để cây ra rễ sau 1-2 thángtiếp theo (hình 2.2a)

Hình 2.2a: phát sinh chồi từ phát hoa

Một số hình ảnh cảm ứng tạo mô sẹo từ mắt ngủ phát hoa

Ở phalaenopsis, phương pháp nhân giống từ phát hoa là phương pháp

phổ biến nhất Nhân giống bằng phương pháp này tạo được cây con sạch bệnh,đồng nhất về mặt di truyền, và đặc biệt là phương pháp này không làm tổnthương cây mẹ Tuy nhiên, khuyết điểm của phương pháp này là hệ số nhân

thấp Hiện nay phương pháp mới như phát sinh PLB trực tiếp từ mô in vitro, tạo

mô sẹo và phát sinh phôi vô tính đem lại kết quả rõ rệt, cải thiện tình trạng thiếugiống của mảng nuôi trồng hoa lan Phương pháp này được thực hiện nhằmcung cấp nguồn nguyên liệu các phương pháp mới sau này

2.3 Tạo mô sẹo

Mô sẹo (hình 2.3a) là một khối tế bào không phân hóa, phát triển vô tổchức, có đặc tính phân chia mạnh, hình thành do những xáo trộn trong quá trình

tạo cơ quan, nhất là trong sự tạo rễ Do đó, cây non (nguyên vẹn hay được cắtkhúc) hay mảnh thân non của cây trưởng thành dễ cho mô sẹo trong điều kiệnnuôi cấy in vitro, dưới tác động của một auxin mạnh (như 2,4-D) được áp dụngriêng lẽ hay phối hợp với citokinin Ngược lại những mảnh cơ quan trưởngthành thường không có khả năng tạo mới cơ quan, cũng không có khả năng tạo

mô sẹo Nói chung, sự tạo mô sẹo in vitro nhờ auxin thuộc về 3 quá trình:

-Sự phản phân hóa của tế bào nhu mô: nhu mô mộc và libe, nhu mô vỏhay lõi

-Sự phân chia của tế bào thượng tầng

-Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi

Hình 2.3a: mô sẹo

Mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong môi trườngkhông có chất kích thích tạo mô sẹo.Mô sẹo được thực hiện đối với các loại câykhông có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Mô sẹo được thu nhận từ nhiều loại mô khác nhau.

Ở phalaenopsis, mô sẹo được thu nhận từ chồi ngủ trên phát hoa bằngcách gây vết thương

Trong quá trình phát triển, mô sẹo thường xuất hiện 2 loại tế bào:

-Loại tế bào xốp, không bào to, nhân nhỏ và tế bào chất loãng

-Loại tế bào chặt, có không bào nhỏ và tế bào chất đậm đặc

Có 3 phương pháp gây vết thương như sau:

-Bỏ 2/3 chồi bằng cách cắt xéo theo trục hoa, song song trục thân

-Cắt đôi chồi bằng cách cắt dọc trục cuống

-Đâm thủng chồi theo chiều dọc bằng kim nhọn vô trùng

Phương pháp 1 và 3 cho kết quả hình thành mô sẹo cao nhất trên môitrường Knudson C hoặc MS (Murashige và Skoog, 1962) thay đổi.Các chồi bấtđịnh hình thành mô sẹo trên bề mặt, sau đó các mô sẹo tiếp tục phát triển thànhchồi Khoảng 12 cây con có thể hình thành trong 6 tháng tiếp theo trên mỗi nốt,

và sau đó các cây khác được tạo ra Từ phương pháp này, tác giả tiếp tục pháttriển phương pháp nhân giống mới thông qua mô sẹo

Theo Thomas và Davey (1975) sự hình thành chồi mô sẹo được kíchthích bởi:

-Các chất sinh trưởng đưa vào môi trường

-Chất sinh sản trong nuôi cấy mô sẹo

-Các chất có chứa sẵn trong mẫu nuôi cấy

Khả năng hình thành chồi sẹo phụ thuộc vào số lần cấy chuyền mà cácchất có trong mẫu không có khả năng tổng hợp trong thời gian dài (Gautheret,1959) và sự hình thành tế bào xốp.

Mô sẹo được thu nhận khi nuôi cấy chóp rễ của cây gieo hạt in vitro có

dạng màu vàng, các mô sẹo tiếp tục phát triển thành PLB và tái sinh cây con(Tanaka, 1976) Khi nuôi cấy phát hoa non, tỉ lệ mô sẹo tạo thành trên các môitrường 1mg/l BAP là 26% và môi trường 5mg/l BAP là 53 % (Lin, 1986), môsẹo này có màu vàng sáng Mô sẹo còn được tạo ra khi nuôi cấy lát cắt mỏng

phát hoa phalaenopsis (Kim và cộng sự, 1994).Các mô sẹo này sẽ tiếp tục biết

hóa thành phôi, hình thành PLB và tái sinh cây con

Ngày nay, người ta thường tạo mô sẹo từ nuôi cấy mô lá in vitro 5 x 5

mm và từ PLB, tạo mô sẹo từ PLB dễ hơn tạo mô sẹo từ mô lá khi nuôi cấy trênmôi trường VW bổ sung 40g/l sucrose, 20% nước dừa và làm đông với gellangum

Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ Từ một cụm tế bào

mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng,tuy nhiên mức độ biến dị soma lại cao hơn

2.4 Tái sinh PLB từ mô lá.

Protocorm được Bernard dùng để mô tả những cấu trúc hình cầu nhỏ củahoa lan hình thành từ hạt Các thể có cấu trúc tương tự hình thành từ các mẫucấy in vitro không được gọi là protocorm

PLB ( protocorm like body) (hình 2.4a) là thuật ngữ dùng để chỉ các cấutrúc tương tự protocorm được hình thành từ mô nuôi cấy hoặc mô sẹo in vitro

Hình 2.4a: PLB của lan hồ điệp

M.tanaka và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu việc nhân giống vô tính cây

phalaenopsis từ mô lá tại Đại học Osaka, Nhật Bản (1975, Tanaka và Sakanishi,

1977, 1980, 1985) Nguyên liệu ban đầu cho thí nghiệm là mô lá lấy từ cây

trưởng thành và mô lá lấy từ cây con in vitro tạo thành nhờ gieo hạt Tuy nhiên

kết qủa cho thấy, các lá trưởng thành không có khả năng tạo PLB, trong khi đó

lá của các cây con mới nảy mầm thì tạo được PLB Điều này cho thấy khả năngtạo PLB giảm xuống khi độ tuổi cây giống tăng lên (Tanaka và cộng sự, 1975)

Hiện nay nguồn mẫu cung cấp tạo PLB là chồi non được tạo ra từ nuôicấy phát hoa trong môi trường MS, mỗi mẫu tạo ra trung bình khoảng 3,8 PLBtại mặt cắt của mẫu lá Các PLB này có thể biệt hóa tiếp tục trên môi trườnglỏng Vacin-Went bổ sung 20% nước dừa và tiếp tục được tái sinh trên môi

trường gieo hạt phalaenopsis Quy trình này tạo được số lượng lớn cây giống

đồng nhất về mặt di truyền

Các mẫu phát hoa 1-1,5 cm mang một chồi bên của cây lai phalaenopsis

Munssterland Stern “Alpha”, Babette “Symphony”, Windspiel “Duseldorf”, vàBarbara Moler “Firecracker” cũng như mẫu lá tạo từ các phát hoa này đượcHass-von Schmude sử dụng (1983, 1985) để tạo PLB (hình 2.4b) Khử trùngmẫu với dung dịch sodium hypochlorite 0,6%, mẫu được nuôi cấy trên môitrường MS lỏng, lắc 100 vòng/phút trong vài tuần hoặc nuôi trên môi trườngrắn Các mẫu nuôi trong môi trường rắn tạo cây con, mẫu nuôi trong môi trườnglỏng tạo PLB Các nhà khoa học đã tìm thấy nhiều tế bào với nhân to tương tự ởphôi.Các mô này được cắt và nuôi cấy lỏng lắc trong môi trường MS như mô tả

ở trên Phương pháp này có thể tạo ra 30000 cây con từ một phát hoa

phalaenopsis Babette “Symphony” trong vòng 3 năm, phalaenopsis

Munssterland Stern “Alpha” tạo 10000 cây con trong 2 năm, phalaenopsis

Barbara Moler “Firecracker” tạo 3000 cây trong vong 18 tháng (Hass-vonSchmude)

Hình 2.4b : PLB của phát hoa phalaenopsis

2.5. Tái sinh PLB phalaenopsis từ nhiều nguồn mô

Thu nhận PLB từ nuôi cấy toàn bộ cây con (cây con in vitro) được

Zimmer và cộng sự nghiên cứu thực hiện tại trường Đại học Kỹ thuật Hannover(Đức) năm 1976, 1978, 1979 và thu được kết quả tốt Tách rời mô lá, mô rễ, môcương và nuôi cấy trên môi trường Knudson C thay đổi có chứa BA và KNA(potassium naphthaleneacetate) giúp cảm ứng sự hình thành PLB Sau đó PLBđược nuôi cấy trên môi trường Knudson C để biệt hóa thành cây con Phươngpháp này có thể tạo 500-1000 cây con từ một phát hoa ban đầu

PLB được tạo từ chóp rễ phalaenopsis, nghiên cứu của Tanaka năm 1976

trên cây lai P amabilis gieo hạt in vitro Từ cây con gieo hạt, cắt các đầu rễ dài

3 mm đặt vào môi trường MS bổ sung auxin và cytokinin Khoảng 40% mẫu

349 ngày tuổi tạo được PLB sau 120-272 ngày trên môi trường MS Sau khoảng

3 tháng, thấy tạo hình cầu ở đỉnh hoặc mặt sau của mẫu chóp rễ Các khối cầu

này biệt hóa thành mô sẹo và sau đó phát triển dần thành PLB Chỉ 10% mẫu

194 ngày tuổi hình thành khối mô sẹo màu sáng trên môi trường MS cải biến.Các PLB sau đó được tách rời và cấy chuyển sang cùng môi trường thu được 12PLB Các PLB sau đó tăng trưởng thành cây con trên môi trường gieo hạt Một

số chóp rễ không tạo được PLB, nó kéo dài và phát triển chồi

Năm 1986, Lin nhân giống phalaenopsis từ phiến mô mỏng của mẫu lóng

phát hoa cây phalaenopsis lai 3 năm tuổi trồng trong vườn ươm Phát hoa 60-75

ngày tuổi thường tạo được PLB, năng suất PLB cao nhất ở các phát hoa 35-45ngày tuổi, phát hoa từ 180 ngày tuổi trở lên sẽ không tạo được PLB Các mẫuphát hoa đã nở hoa thường không có khả năng tạo PLB Khi dùng mẫu phát hoachưa nở hoa thì cho thỉ lện tạo PLB cao nhất (62.9-77.1%)

Năm 2000, Park và cộng sự đã phát triển phương pháp nhân sinh khốibằng bioreactor Nuôi cấy chìm chu kì trong 2 lít môi trường Hyponex bổ sungthan hoạt tính, độ thông khí trong Bioreactor là 0.5 hoặc 2.0 ppm trong vòng 8tuần sẽ tạo được 18000 PLB mới từ 1000 PLB ban đầu

Bioreactor sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật được cải tiến từ cácloại bioreactor sử dụng trong nuôi cấy tế bào vi sinh Bioreactor có hệ thốngcung cấp và xả môi trường, hệ thống cấp toát khí vô trùng được thiết kế có khảnăng tạo môi trường nuôi cấy vô trùng, kiểm soát các yếu tố môi trường bêntrong như lắc, sự thoáng khí, nhiệt độ, oxy hòa tan, pH Hiện nay, nhân giốngthực vật qua nuôi cấy phôi, mô và tế bào bằng bioreactor đang có nhiều triểnvọng trong nhân giống cây trồng quy mô công nghiệp

2.6 Phôi vô tính