KĨ THUẬT NHÂN GIỐNG vô TÍNH cây TRỒNG đề tài THÔNG đỏ

Phương pháp nuôi cấy lỏng đã cho thấy nhiều ưu thế vượt trội trong việc thu nhận tế bào so với phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch truyền thống vì nó cho phép việc tối ưu hóa tốc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Khoa Sinh Học - Bộ môn: Vi Sinh MÔN: KĨ THUẬT NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY TRỒNG

ĐỀ TÀI: THÔNG ĐỎ

Taxus Wallichiana Zucc

GVHD: TS Dương Công Kiên

Phan Thị Diễm Quỳnh 1115647

MỤC LỤC

I Mục đích đề tài 1

II Tổng quan 3

1 Phân loại học cây thông đỏ 3

2 Đặc điểm thực vật và phân bố địa lý 4

2.1 Đặc điểm 4

2.2 Phân bố địa lí 5

2.3 Một số loài thông đỏ trên thế giới 6

3 Hợp chất ngừa ung thư từ cây thông đỏ 11

3.1 Nguồn gốc 12

3.2 Phân tích hàm lượng 10-DAB và taxol ở các bộ phận (lá, thân, rễ) theo tuổi cây 13

4 Thực trạng trồng cây thông đỏ ở Việt Nam 14

4.1 Trong phòng thí nghiệm 14

4.2 Trong thực tiễn rừng trồng 14

III Kỹ Thuật nhân giống cây thông đỏ 15

1 Nhân giống hữu tính 15

2 Nhân giống vô tính : 17

2.1 Giâm cành 17

2.2 Ghép cành 18

3 Gây trồng 20

4 Nhân giống bằng nuôi cấy mô 23

4.1 Giới thiệu: 23

4.2 Các bước nuôi cấy mô 24

4.3 Ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào trong công tác nhân giống cây trồng: 26

4.4 Nuôi cấy in vitro phát triển rễ trên cây Thông đỏ Taxus wallichiana Zucc 27

4.5 Công nghệ phôi soma trong công tác bảo tồn và phát triển cây thông đỏ

(Taxus wallichiana Zucc.) 37

4.6 Nuôi cấy tế bào và tái tạo mô sẹo từ huyền phù tế bào cây thông đỏ hymalaya (thông đỏ Lâm Đồng) 40

IV CÔNG NGHỆ SINH KHỐI TẾ BÀO THỰC VẬT 51

1 Khái niệm, ưu điểm và khó khăn khi triển khai 51

1.1 Khái niệm và nguyên tắc 51

1.2 Giới thiệu về phương pháp bioreactor 51

1.3 Ưu điểm của công nghệ sinh khối tế bào thực vật 54

1.4 Những khó khăn khi triển khai công nghệ sinh khối tế bào thực vật 55

2 Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật 56

3 Quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) để chiết xuất hợp chất điều trị ung thư 57

3.1 Nguyên liệu và hoá chất 57

3.2 Quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ 58

3.3 Kết quả và thảo luận: 60

V Sâu bệnh trên cây thông đỏ (Taxus) 63

1 Một số loại nấm 63

2 Mọt nho đen (Otiorhynchus sulcatus (Fabricius)) 63

3 Mạt chồi thông đỏ (Cecidophyopsis psilaspis) 64

4 Nấm mốc bồ hóng 64

5 Nấm Phytophthora 67

VI GIÁ TRỊ LÂM SẢN CỦA THÔNG ĐỎ (Taxus Wallichiana zucc) 68

1 Giá trị sử dụng cho y học: 68

1.1 Paclitaxel 69

1.2 Docetaxel 70

2 Giá trị kinh tế 71

3 Giá trị về tinh thần và thẩm mỹ 72

VII Kết Luận 73

VIII Tài liệu tham khảo 74

là không thể tổng hợp hóa học được Vì thế cần có nhiều phương pháp để làm tăng số lượng cây giống phục vụ cho mục đích khác nhau của con người

Trong nguồn tài nguyên thực vật rừng Việt Nam, nhóm Thông chỉ chiếm một

số lượng loài hết sức khiêm tốn, song chúng lại có giá trị khoa học, nguồn gen và kinh tế đáng lưu ý Theo kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước, trong tổng số 33 loài Thông được xác định bản địa ở Việt Nam, có tới 14 loài nằm trong danh sách

bị đe doạ cấp toàn cầu và 29 loài đang bị đe dọa ở cấp quốc gia Trong đó, có

nhóm Thông đỏ thuộc chi Thông đỏ (Taxus) họ Taxaceae Ở Việt Nam, có 2 loài là: Thông đỏ lá ngắn hay còn gọi là Thông đỏ bắc (Taxus chinensis Pilg.), phân bố

rải rác ở một số tỉnh miền núi phía Bắc và Thông đỏ lá dài hay còn gọi là Thông

đỏ nam (Taxus wallichiana Zucc.)

Cây Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) là dược liệu quý phân bố chủ yếu tại

khu vực dãy núi Hymalaya Ở Việt Nam, thông đỏ được tìm thấy tại các huyện Đức Trọng, Đơn Dương, Lạc Dương và Thành phố Đà Lạt tỉnh Lâm Đồng ở độ cao từ 1.300 m đến 1.700 m với số lượng cá thể nhỏ Trong khi đó, môi trường sống của chúng bị thu hẹp nghiêm trọng Vì vậy, loài này đang bị nguy cấp ở mức cao tại nước ta Năm 2002, Thomas và Nguyễn Đức Tố Lưu còn cho rằng: quần

thể Thông đỏ ở Việt Nam là điểm phân bố cuối cùng về phía Nam của chi Taxus

L trong lục địa châu Á Chúng phân bố biệt lập, cách xa các điểm phân bố của loài ở phía Đông Nam Trung Quốc và vùng cận Hymalaya, nên có thể đây là một

xuất xứ riêng Như vậy, về giá trị nguồn gen, Thông đỏ đang là nhóm đối tượng được quan tâm ở Việt Nam Về giá trị kinh tế, Thông đỏ là loài cho gỗ tốt, cũng là cây có hoạt chất tự nhiên dùng làm thuốc chữa ung thư.Thuốc chống ung thư xuất

xứ từ các loài Thông đỏ trên thị trường hiện nay có tên thương mại là paclitaxel (taxol) do Hãng Dược phẩm Bristol Myers Squibb (Mỹ) sản xuất và docetaxel (taxotere) được Công ty Sanofi - Aventis (Pháp) sản xuất Do có giá trị kinh tế cao, Thông đỏ bị lạm dụng khai thác, đặc biệt là ở vùng Himalaya và Trung Quốc, nguồn dược liệu thiên nhiên này trở nên khan hiếm, đang bị đe dọa tuyệt chủng Tuy nhiên, thông đỏ tăng trưởng rất chậm và thời gian ngủ của hạt kéo dài từ 1,5 đến 2 năm nên việc tìm kiếm các nguồn nguyên liệu để tách chiết taxol khác ngoài

vỏ cây là điều rất cần thiết Vì vậy việc nhân giống như là một cách tiếp cận rất cần thiết để có thể có thêm một số lượng lớn cây trong thời gian ngắn

Bộ (ordo): Pinales

Họ (familia): Taxaceae Các chi: gồm 2 nhóm

 Taxaceae:

Austrotaxus - thanh tùng New Caledonia Pseudotaxus - thông trắng (bạch đậu sam) Taxus - thanh tùng (thông đỏ, hồng đậu sam)

 Cephalotaxaceae:

Amentotaxus - dẻ tùng, sam bông Cephalotaxus - đỉnh tùng (phỉ ba mũi) Torreya - phỉ

Hình1: Cây Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.)

Các khác biệt giữa Taxaceae (nghĩa hẹp) và Cephalotaxaceae như bảng dưới đây:

hạt

Bao phủ toàn bộ hạt

Thời gian phát triển 6-8 tháng 18-20 tháng

2.1.1.Họ Thông Đỏ hay họ Thanh Tùng

Được định nghĩa theo 2 cách:

- Nghĩa hẹp (sensu stricto): là một họ của 3 chi và khoảng 7 tới 12 loài thực vật quả nón

- Nghĩa rộng (sensu lato): là họ của 6 chi và khoảng 30 loài Họ này chủ yếu là các loài cây bụi hay cây thân gỗ nhỏ nhiều cành Lá của chúng thường xanh, sắp xếp theo hình xoắn ốc, thường vặn xoắn tại gốc lá để xuất hiện theo kiểu 2 hàng Các lá có dạng thẳng hay hình mũi mác, với dải khí khổng màu lục nhạt hay trắng ở mặt dưới Các loài phần lớn là đơn tính khác gốc, ít khi đơn tính cùng gốc Các nón đực dài khoảng 2-5 mm, tung phấn ra vào đầu mùa xuân Các nón cái bị suy giảm mạnh, chỉ có một lá noãn và một hạt Khi hạt chín, lá noãn phát triển thành áo hạt nhiều thịt, bao phủ một phần của hạt Áo hạt khi chín có màu sáng, mềm, nhiều nước và ngọt, chúng bị một số loài chim

ăn và nhờ đó mà hạt được phát tán khi chim đánh rơi chúng

2.1.2.Cây Thông đỏ

- Đặc điểm nhận dạng: thuộc loại đại mộc, cây đơn tính khác gốc, sinh trưởng rất chậm, tầng tán ngang tầng với các cây gỗ khác mọc cạnh bên Tổ thành rừng với các

loài Pinus kremfii (thông hai lá dẹt), Podocarpus imbricatus (bạch tùng), Podocarpus

sp (kim giao), Podocarpus neriifolius (thông tre), Dacrydium sp (hồng

tùng), Taloma gioi (giổi), Magnolietia fordiana (vàng tâm), Shima sp (chò xót), các

cây thuốc họ Sim (Myrtaceae), họ Đỗ quyên (Ericaceae) Cây ưa sáng và ưa ẩm, nhưng

cần bóng râm để nảy mầm và phát triển vào những năm đầu

- Đặc điểm lâm sinh học: Thông đỏ thuộc loài đại mộc, thân cao to 15-30m, đường kính gốc (d1,3) 0,5-1,5m; Cây đơn tính khác gốc, phân biệt đực cái dựa vài hình dáng nón và sự phân bố của chúng trên cành Cây đực có nón hình trứng, phân bố ở nách lá trên đoạn cành củ (năm trước); Cây cái có nón hình cầu, phân bố lác đác ờ nách lá trên đoạn cành mới và quả chỉ có ở đoạn cành củ Tử y màu đỏ khi quả chín Phôi nằm ở gốc quả (đầu lớn), phát triển dần lên đỉnh quả (đầu nhỏ) và đâm xuyên vỏ hạt để nảy mầm, quá trình này diễn ra trong 2 năm Mùa hoa từ tháng 8-9 năm này đến 6-7 năm sau xuất hiện quả non và từ tháng 10-12 quả chín đỏ đồng loạt, đồng thời lúc này hoa cũng nở rộ Màu đỏ của quả không phải của vỏ mà là của tử y lúc quả chín Điểm cần quan tâm nữa là thông đỏ mang đặc tính bảo lưu cục bộ và hạt cần hai năm sau mới nảy mầm.Thông đỏ phát triển trên nhiều loại đất khác nhau như đỏ vàng trên granit, nâu đỏ trên bazan, nâu vàng trên đacit… Độ ẩm cao, đá tảng lộ thiên hay bán lộ thiên, pH khá chua Đất khá giàu dinh dưỡng và tơi xốp Nhiệt độ bình quân 17,2 – 180C, lượng mưa 1634-1828mm/năm Độ ẩm 80-90%

2.2 Phân bố địa lí

Thông đỏ (Taxus sp.) hay cây thủy tùng là loài cây rừng rất quý, có giá trị kinh tế rất cao Chúng phân bố khắp các vùng ôn đới của Bắc bán cầu, có tuổi đời kéo dài hàng trăm năm nhiều Cây phân bố hẹp ở các nước Châu Á như: Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc, Myanmar, Philippines, Indonesia, Nepal, Afghanistan…8 loài được ghi nhận bao gồm: thông đỏ Châu Âu (T baccata); thông đỏ Thái Bình Dương (T brevifolia); thông

đỏ Canada (T canadensis); thông đỏ Trung Quốc (T chinensis), thông đỏ Nhật Bản (T cuspidata), thông đỏ Florida – Hoa Kỳ (T floridana); thông đỏ Mexico (T globosa) và thông đỏ Himalaya (T wallichiana) – loài thấy có ở cao nguyên Đà Lạt – Lâm Đồng của nước ta Ngoài ra, còn có hai giống lai được công nhận: Taxus × media = T baccata

× T cuspidata và Taxus × hunnewelliana = T cuspidata × T canadensis

Ở Việt Nam, vào năm 1995, Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia khảo sát tại vùng Pà Cò, Mai Châu, Hòa Bình đã gặp 5 cây thông đỏ T Chinensis (còn gọi là thông đá, cây tra, thông đỏ Trung Quốc) bên trái dòng núi đá vôi Hiện nay có thể gặp loài này tại các vùng Sapa – Lào Cai, Mai Châu – Hoà Bình, Tam Đảo - Vĩnh Phúc,

Ba Vì – Hà Nội, Sìn Hồ - Lai Châu Riêng ở Lâm Đồng, các cán bộ của Trung tâm

Nghiên cứu Lâm sinh Lâm Đồng đã phát hiện một loài thông đỏ Himalaya (T Wallichiana Zucc) có rải rác nhiều nơi, trên độ cao khoảng 1.500m

Thông đỏ Himalaya (Lâm Đồng ) phân bố ở các huyện Đức Trọng, Đơn Dương, Lạc Dương và TP Đà Lạt, ở độ cao từ 1.300m đến 1.700m Khu phân bố là các hẻm núi cây lá rộng thường xanh chiếm ưu thế, rất ít cây lá kim, bao quanh là thông ba lá đang

có xu hướng tiến dần vào khu phân bố làm cho chúng ngày càng thu hẹp Cách nay (2013) khoảng 5 năm, theo thống kê của ngành lâm nghiệp, quần thể thông đỏ trưởng thành (hàng nghìn năm tuổi) ở Lâm Đồng còn khoảng 250 cây Nhưng hiện nay, với những gì đã diễn ra liên quan đến quần thể thông đỏ cuối cùng này, con số cá thể còn lại chỉ rất ít Mặt khác, vì đặc tính tái sinh hẹp và thế hệ trung gian hầu như không có nên nguy cơ diệt vong của loài cây rừng thông đỏ rất cao

2.3 Một số loài thông đỏ trên thế giới

2.3.1 Taxus baccata

Taxus baccata là một cây hạt trần có nguồn gốc từ miền Tây, miền Trung và miền

Nam châu Âu, phía tây bắc châu Phi, miền bắc Iran và Tây Nam Á Ban đầu cây được gọi là thủy tùng

Đây là một cây thường xanh có kích thước nhỏ đến kích thước trung bình, cao từ 10-20 mét (33-66 fit) (đặc biệt cao lên đến 28 mét (92 fit), với đường kính cây lên đến 2 mét (6 fit 7 in) ( đặc biệt đường kính lên tới 4 mét (13 fit) Vỏ mỏng, có vảy màu nâu, dạng mảnh nhỏ phù hợp với thân cây Các lá phẳng, màu xanh đậm dài 1-4 cm (0,39-1,57 in) và rộng 2-3 mm (0,079-0,118 in), sắp xếp thành vòng xoắn trên thân Các lá có

độ độc cao Các tế bào hạt giống hình nón , mỗi nón có chứa một hạt giống duy nhất dài 4-7 mm (0,16-0,28 in), cấu trúc giống như quả mọng màu đỏ tươi được gọi là aril dài 8-

15 mm (0,31-0,59 in) và rộng mở ở cuối Các arils trưởng thành từ 6-9 tháng sau khi thụ phấn Các hạt giống cực kỳ độc hại và đắng, nhưng các aril là không độc hại, nếm keo và rất ngọt Các tế bào hình nón đực là hình cầu, có đường kính 3-6 mm (0,12-0,24 in) và ra phấn hoa vào đầu mùa xuân Nó chủ yếu là loài đơn tính, nhưng thỉnh thoảng

có cây lưỡng tính hoặc thay đổi đặc tính với thời gian

Taxus baccata có thể đạt tới 400-600 tuổi Một số mẫu vật sống lâu hơn nhưng tuổi

của cây thủy tùng thường được đánh giá cao Tên cây thủy tùng ở Anh được cho là có

trước thế kỷ thứ 10 Tuổi tiềm năng của cây thủy tùng là không thể xác định chính xác

và có nhiều tranh chấp

Hình2: Taxus baccata và hạt giống của nó

2.3.2 Taxus brevifolia

Taxus brevifolia (thủy tùng Thái Bình Dương hay thủy tùng Tây) là một cây lá

kim bản địa của vùng Tây Bắc Thái Bình Dương của Bắc Mỹ Nó dao động từ phía nam Alaska tới trung tâm California, chủ yếu ở các dãy bờ biển Thái Bình Dương, nhưng với sự cô lập dân cư ở phía đông nam British Columbia (đáng chú ý nhất xảy ra trên đảo Zuckerberg gần Castlegar ) và ở phía nam đến trung tâm Idaho

Đặc điểm: Các thủy tùng Thái Bình Dương là một cây thường xanh nhỏ, cao10-15

m và với đường kính thân cây lên đến 50 cm Trong một số trường hợp, cây có chiều cao vượt quá 20 m xảy ra trong công viên và khu bảo tồn khác Cây trồng phát triển rất chậm, và có thói quen mục nát từ bên trong, tạo ra các hình thức rỗng Điều này làm khó khăn trong việc xác định chính xác tuổi thực sự của một mẫu Nó có vảy mỏng màu nâu của vỏ cây, bao gồm một lớp mỏng màu trắng của nhựa cây với một tâm gỗ sẫm màu hơn mà thay đổi màu sắc từ màu nâu sang một màu đỏ tươi / màu tím Các lá là hình mũi mác, bằng phẳng, màu xanh đậm, dài 1-3 cm và rộng 2-3 mm, sắp xếp thành vòng xoắn trên thân

Các tế bào hạt giống rất thay đổi, mỗi nón có chứa một đơn hạt giống dài 4-7

mm Các arils trưởng thành từ 6-9 tháng sau khi thụ phấn, và các hạt bị các loài chim tấn công, trong đó phân tán hạt cứng không bị hư hại trong phân của chúng; trưởng thành của các arils được lan truyền trên 2-3 tháng, tăng cơ hội phát tán hạt thành công Các tế bào hình nón nam là hình cầu, đường kính 3-6 mm, và đổ họ phấn hoa vào

đầu mùa xuân Nó chủ yếu là cây đơn tính cùng gốc, nhưng thỉnh thoảng có cây đơn tính khác gốc, hoặc thay đổi với thời gian

Môi trường sống : Thủy tùng Thái Bình Dương phát triển trong nhiều môi trường khác nhau Tuy nhiên, trong môi trường khô là chủ yếu và giới hạn ở dòng môi trường sống bên cạnh, trong khi ở môi trường ẩm ướt nó sẽ phát triển lên trên sườn núi Thủy tùng Thái Bình Dương là cây chịu bóng ; Tuy nhiên nó cũng có thể phát triển trong ánh mặt trời Nó có thể mọc dọc sông suối cung cấp bóng mát để duy trì nhiệt độ nước

2.3.3 Taxus Canadensis

Taxus canadensis (Canada Diệu) là một cây lá kim có nguồn gốc từ Trung và

Đông Bắc Mỹ , phát triển mạnh trong khu rừng đầm lầy, khe núi, bờ sông và trên bờ

hồ Các địa phương gọi đơn giản là "Diệu", loài này cũng được gọi là Mỹ Diệu Hầu hết phạm vi của nó là ở phía bắc của sông Ohio Tuy nhiên, được tìm thấy như là một kỷ băng hà hiếm có trong một số vịnh nhỏ của dãy núi Appalachian Các thuộc địa phía nam được biết đến từ Ashe và Watauga ở bắc Carolina Nó thường là một sắc màu rực

rỡ như cây bụi, hiếm khi cao vượt quá 2,5 m Đôi khi nó hình thành các nhánh thẳng đứng nhưng không thể được hình thành từ các chi nhánh lan rộng Các loại cây bụi có vảy màu nâu mỏng vỏ Các lá là hình mũi mác, bằng phẳng, màu xanh đậm, dài 1-2,5

cm, rộng 1,5 mm, được sắp xếp thành hai hàng ngang hai bên của nhánh

Taxus Canadensis

2.3.4 Taxus cuspidata

Taxus cuspidata (Diệu Nhật Bản hoặc lây lan Diệu) là thành viên của chi Taxus , có

nguồn gốc từ Nhật Bản , Hàn Quốc , phía đông bắc Trung Quốc và đông nam cực của Nga Đây là một cây thường xanh lớn hay cây bụi phát triển cao 10-18 m, với một thân cây có đường kính lên đến 60 cm Các lá là hình mũi mác, bằng phẳng, màu xanh đậm, dài 1-3 cm và rộng 2-3 mm, sắp xếp thành vòng xoắn trên thân, nhưng với lá căn

cứ xoắn để sắp xếp các lá hơi phẳng thành hai hàng hai bên của gốc trừ thẳng măng hàng đầu mà sự sắp xếp xoắn ốc là rõ ràng hơn

Taxus cuspidata

2.3.5.Taxus floridana

Taxus floridana (Florida Diệu) là một loài thủy tùng , chỉ được tìm thấy trong một

khu vực nhỏ dưới 10 km ² ở phía đông của sông Apalachicola ở miền bắc Florida ở độ cao 15-30 m Nó được liệt kê là cực kỳ nguy cấp Nó được bảo vệ trong khu bảo tồn tại Vườn Tiểu bang Torreya, đồng Bảo tồn Thiên nhiên 's Apalachicola Bluffs và khe núi bảo tồn, và được sự bảo vệ của pháp luật Hoa Kỳ và Florida loài bị đe dọa của pháp luật

Mô tả: cây thường xanh, lá kim, cây bụi hay cây nhỏ phát triển cao đến 6 m (hiếm khi 10 m) với một thân cây có đường kính lên đến 38 cm Các vỏ mỏng, có vảy màu tím nâu, và các ngành đang lan rộng Các chồi xanh lúc đầu, trở thành màu nâu sau ba hoặc bốn năm Các lá mỏng, phẳng, hơi falcate ( liềm hình chữ), dài 1-2,9 cm, rộng 1-2 mm, với một đỉnh thẳng thừng cấp tính; chúng được sắp xếp thành vòng xoắn trên chồi nhưng xoắn tại các cơ sở xuất hiện ở hai cấp bậc ngang trên tất cả trừ chồi thẳng

chì Đây là đơn tính, với các nón đực và cái riêng biệt Các phấn hoa hình nón là hình cầu, đường kính 4 mm, được sản xuất trên dưới của cành vào đầu mùa xuân Phân biệt các loài thủy tùng khác nhau là khó khăn và giống như hầu hết các cây thủy tùng nó đôi khi được coi là một phân loài của Taxus baccata

2.3.6.Taxus globosa

Taxus globosa hoặc thủy tùng Mexico là một cây bụi thường xanh và là một trong

tám loài thủy tùng Các thủy tùng Mexico là một loài quý hiếm, chỉ được tìm thấy trong một số ít các địa điểm ở phía đông Mexico, Guatemala , El Salvador và Honduras và được liệt kê như là một loài nguy cấp Các thủy tùng Mexico

là một loại cây bụi mọc đến độ cao trung bình 4.6m

cm (1 1/2 inch) dài rộng hơn so với hầu hết các cây thủy tùng và thường kết thúc như một mũi nhọn rất nhỏ Mặt dưới của mỗi lá có hai sọc màu vàng rộng lớn

Taxus wallichiana

Hợp chất ngừa ung thư từ cây thông đỏ

3

3.1 Nguồn gốc

Trong những thập niên gần đây, thông đỏ được coi là một nguồn dược liệu quan trọng sau việc khám phá một hợp chất diterpene amide chống ung thư mới với tên thương mại là “Taxol” từ vỏ cây thông đỏ Thái Bình Dương (Taxus brevifolia) (Wani et al., 1971; Edgington 1991) Hợp chất này còn được gọi là paclitaxel, hay tên đầy đủ theo IUPAC (Liên đoàn hóa học thuần túy và ứng dụng quốc tế) là 5-α-20-epoxy-1,2-α-4,7-β-10-β-13-α-hexahydroxytax-11-en-9-one-4,10-diacetate-2-benzoate-13-ester

Taxol đã được Cục quản lý thực phẩm & dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) chứng nhận khả năng chữa ung thư buồng trứng và ung thư vú; ngoài ra, hợp chất này còn có khả năng chống các khối u ác tính, ung thư phổi và một số dạng khối u rắn khác (Wickremesinhe

và Arteca, 1993, 1994) Taxol cũng đã được tách chiết từ nhiều bộ phận của nhiều loài thông đỏ khác nhau bao gồm hạt phấn, hạt, lá, thân non, thân gỗ, vỏ và rễ (Wani et al., 1971; Witherup et al., 1990; Vidensek et al., 1990; Fett-Neto et al., 1992; Wickremesinhe và Arteca, 1994) Nguồn cung cấp Taxol cho nhu cầu chữa trị phụ thuộc phần lớn vào cây thông đỏ, gần 7 tấn vỏ cây mới sản xuất được 1 kg Taxol (Cragg et al., 1993) Vì thông đỏ tăng trưởng rất chậm và thời gian ngủ của hạt kéo dài

từ 1,5 đến 2 năm (Steinfeld, 1992) nên việc tìm kiếm các nguồn nguyên liệu để tách chiết Taxol khác ngoài vỏ cây là điều rất cần thiết Hiện nay có năm con đường để công nghiệp hóa sản xuất taxol: chiết tách từ vỏ các loài thông đỏ , tổng hợp toàn phần, bán tổng hợp, nuôi cấy mô tế bào thực vật, công nghệ chuyển hóa và lên men nấm nội sinh Tuleke (1959) là một trong những nhà khoa học tiên phong trong nuôi cấy in vitro giao tử thể và hạt phấn Taxus mặc dù con người vẫn chưa biết đến Taxol vào thời điểm

đó Nhiều nghiên cứu vi nhân giống Taxus spp khác đã được thực hiện rộng rãi như các nghiên cứu sự nảy mầm của phôi T baccata, đặc biệt chú trọng đến việc khảo sát sự ngủ của hạt (Lepage-Degivry, 1973; Lepage-Degivry và Garello, 1973), các phương pháp nuôi cấy phôi để giảm thời gian ngủ của hạt T brevifolia (Flores và Sgrignoli, 1991; Chee, 1994), và phương pháp nuôi cấy đoạn cắt thân để tạo cây con T brevifolia (Eccher, 1988; Chee 1994) Đã có nhiều báo cáo về các phương pháp sản xuất Taxol từ

mô Taxus spp trong nuôi cấy mô sẹo và huyền phù tế bào (Fett-Neto et al., 1992; Wickremesinhe và Arteca, 1994) Để tăng hàm lượng các hợp chất thứ cấp, các nhà khoa học cũng nghiên cứu việc bổ sung các hợp chất kích thích (elicitor) (Christen et al., 1991; Zhong et al., 1995) hay các tiền chất của paclitaxel như kalium acetate,

mevalonolactone, glucose, leucine và phenylalanine (Strobel et al., 1992; Fett-Neto et al., 1994; Shuler et al., 1994) vào môi trường Phương pháp nuôi cấy lỏng đã cho thấy nhiều ưu thế vượt trội trong việc thu nhận tế bào so với phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch truyền thống vì nó cho phép việc tối ưu hóa tốc độ tăng trưởng, cho phép thu nhận tế bào bằng cách lọc, và quan trọng là tế bào trong nuôi cấy lỏng vẫn giữ được khả năng phát triển thành mô sẹo (Phillips et al., 1996) Nuôi cấy tế bào trong các bình phản ứng sinh học (bioreactor) cũng đã được thực hiện để thu một lượng lớn sinh khối

và Taxol (Park et al., 1994; Yoon và Park, 1994)

Công thức hóa học của 2 hợp chất:

3.2 Phân tích hàm lượng 10-DAB và taxol ở các bộ phận (lá, thân, rễ) theo tuổi cây Khảo sát ở mỗi cấp tuổi 15 cá thể ở các bộ phận lá, thân cành và rễ của Thông đỏ từ lúc bắt đầu trồng cho đến thu mẫu

- Ở lá: hàm lượng 10-DAB tỷ lệ nghịch theo tuổi cây, cây càng lớn hàm lượng càng giảm Ngược lại, hàm lượng taxol tăng tỷ lệ thuận theo tuổi cây, cây càng lớn hàm lượng càng tăng (p < 1%)

- Ở thân cành: hàm lượng 10-DAB tỷ lệ nghịch theo tuổi cây, cây càng lớn hàm lượng càng giảm Hàm lượng taxol biến động không theo quy luật (p < 1%)

- Ở rễ: hàm lượng 10-DAB biến động không theo quy luật, hàm lượng taxol có chiều hướng tăng theo tuổi cây (p < 1%)

- Hàm lượng 10-DAB trong lá trung bình ở các cấp tuổi cao hơn thân cành 23,74 lần và cao hơn ở rễ 13,65 lần Hàm lượng taxol trong lá trung bình ở các cấp tuổi cao hơn thân cành 2,23 lần và thấp hơn ở rễ 2,31 lần

- Ở cây 1 tuổi, hàm lượng 10-DAB trong lá trung bình cao hơn thân cành 20,12 lần

và cao hơn rễ 12,98 lần Hàm lượng taxol trong lá trung bình cao hơn thân cành 1,87 lần và thấp hơn so với rễ là 2,72 lần

- Ở cây 5 tuổi, hàm lượng 10-DAB trong lá trung bình cao hơn thân cành 56,24 lần

và cao hơn rễ 8,83 lần Hàm lượng taxol trong lá trung bình cao hơn thân cành 4,7 lần

và thấp hơn so với rễ là 2,35 lần

Như vậy, có thể nuôi trồng Thông đỏ thu hoạch lá để vừa tách chiết 10-DAB và taxol cho đến khi cây lớn hơn 5 tuổi, có triệu chứng già cỗi, năng suất kém thì thu luôn

cả cây để tách chiết taxol là hiệu quả nhất

Thông đỏ, sử dụng chất kích thích NAA và IBA ở nồng độ 1 và 1,5% cho tỷ lệ ra rễ

> 90%

- Chọn mật độ trồng Thông đỏ với khoảng cách 1 m x 1 m (10.000 cây/ha) Chế độ phân bón 20 tấn phân hữu cơ + 318 kg N + 106 kg P + 106 kg K hiệu quả nhất để bón cho Thông đỏ

- Thời vụ thu hoạch 10-DAB vào mùa mưa cho hàm lượng cao hơn mùa khô và ngược lại, thu hoạch mùa khô cho hàm lượng taxol cao hơn mùa mưa

- Hàm lượng 10-DAB trong lá giảm dần khi tuổi cây càng lớn và taxol tăng dần khi cây càng lớn, nhưng cao hơn so với ở rễ và thân cành Hàm lượng 10-DAB và taxol trong thân cành thấp hơn ở lá và rễ Hàm lượng taxol trong rễ càng tăng khi tuổi cây càng lớn Vì thế, nên trồng Thông đỏ để thu lá cho đến khi cây có dấu hiệu cằn cỗi, sau

đó thu cả cây cho hiệu quả tốt hơn

Thực trạng trồng cây thông đỏ ở Việt Nam

4.2 Trong thực tiễn rừng trồng

Trung tâm Nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt đã trồng được 100.000

cây thông đỏ Taxus wallichiana Zucc có chứa hoạt chất taxol và taxote với hàm lượng

cao để làm nguyên liệu sản xuất thuốc chữa bệnh ung thư

Theo các nhà khoa học, cây thông đỏ được trồng tại Tà Nung và Cam Ly (TP Đà

Lạt) với chế độ chăm sóc phân bón và nước tưới đầy đủ cho hàm lượng hoạt chất taxol

và 10-DAB (Deacetyl Baccatyl III) cao gấp 2-4 lần so với cây thông đỏ ngoài tự nhiên Trung tâm cũng chọn lọc được 4 dòng thông đỏ có hàm lượng taxol cao và 3 dòng

có hàm lượng 10-DAB cao để khảo nghiệm và sản xuất giống thông đỏ Ngoài ra, trung

tâm này cũng đã xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu lá thông đỏ dùng để chiết xuất các

hoạt chất này

Lâm Đồng: Dự án trồng 50 ha “thần dược” thông đỏ: Giám đốc sở NN&PTNN

Lâm Đồng cho biết các giáo sư viện sĩ, tiến sĩ viện khoa học và công nghệ việt nam,

viện hóa học, viện khoa học dược liệu, hội ung thư việt nam cùng với tổng giám đốc

vinadimex vừa có chuyến khảo sát về “thần dược” thông đỏ tại lâm đồng

KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG CÂY THÔNG ĐỎ

III

Nhân giống hữu tính

1

Phương pháp nhân giống hữu tính là phương pháp nhân giống bằng hạt

* Những ưu điểm của phương pháp nhân giống bằng hạt

- Kỹ thuật đơn giản, dễ làm

- Chi phí lao động thấp, do đó giá thành cây con thấp

- Hệ số nhân giống cao

- Tuổi thọ của cây trồng bằng hạt thường cao

- Cây trồng bằng hạt thường có khả năng thích ứng rộng với điều kiện ngoại cảnh

* Những nhược điểm của phương pháp nhân giống bằng hạt

- Cây giống trồng từ hạt thường khó giữ được những đặc tính của cây mẹ

- Cây giống trồng từ hạt thường ra hoa kết quả muộn

- Cây giống trồng từ hạt thường có thân tán cao, gặp khó khăn trong việc chăm sóc

cũng như thu hái sản phẩm

* Những điểm chú ý khi nhân giống bằng hạt

- Phải nắm được các đặc tính, sinh lý của hạt: một số hạt chín sinh lý sớm, nảy mầm

ngay trong hạt (hạt mít, hạt bưởi); một số hạt có vỏ cứng cần xử lý hoá chất, bóc bỏ vỏ

cứng trước khi gieo (hạt xoài, hạt mận) và một số hạt khi để lâu sẽ mất sức nảy mầm (hạt nhãn, hạt vải)

- Phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh cho hạt nảy mầm tốt: nhiệt độ, không quá thấp hoặc quá cao, độ ẩm đất đảm bảo 70 - 80% độ ẩm bão hoà và đất gieo hạt phải tơi xốp, thoáng khí

- Phải tuân thủ nghiêm ngặt các bước chọn lọc: chọn giống có khả năng sinh trưởng khoẻ, năng suất cao và phẩm chất tốt; chọn những cây mang đầy đủ các đặc điểm của giống muốn nhân; chọn những quả có hình dạng đặc trưng của giống; chọn những hạt

to, mẩy, cân đối và chọn cây con to, khoẻ, sinh trưởng cân đối

* Phương pháp tiến hành:

Bước đầu nhận thấy rằng thông đỏ Lâm Đồng có thời gian ngủ sinh lý là hai năm và thời gian nảy mầm kéo dài từ 2-3 tháng Trước mắt có thể xử lý hạt theo hướng sau: Thu hái, loại bỏ tử y bằng cách vò kỹ với cát, rửa thật sạch, ngâm trong benlat 0.3%/ 10phút (hay bằng chất sát trùng nào khác), mang gieo trên giá thể dễ thoát nước nhưng phải thường xuyên giữ ẩm như dớn, thảm mục trong rừng già hay hạt cát lớn Sau 2 năm hạt sẽ nảy mầm, nhưng không đồng loạt như các loài cây khác

Các phương pháp gieo hạt làm cây giống

- Gieo ươm hạt trên luống đất

+ Đất gieo hạt phải được cày bừa kỹ, bón lót 50 - 70 kg phân chuồng hoai mục + 0,5 - 0,7 kg supe lân/100m2 và lên thành các luống cao 10 - 15 cm, mặt luống rộng 0,8 - 1,0 m, khoảng cách giữa các luống 40 - 50 cm

+ Hạt được gieo thành hàng hoặc theo hốc với các khoảng cách tuỳ thuộc, gieo ươm

để lấy cây ra ngôi hoặc gieo trực tiếp lấy cây giống Độ sâu lấp hạt từ 1 - 3 cm tuỳ thuộc vào thời vụ gieo và tuỳ thuộc vào hạt giống cây đem gieo

+ Các khâu chăm sóc phải được làm thường xuyên như: tưới nước giữ ẩm, nhổ cỏ, xới xáo phá váng, bón phân đặc biệt là theo dõi, phát hiện và phòng trừ bệnh kịp thời Bón thúc bằng nước phân chuồng pha loãng 1/10 - 1/15 hoặc các loại phân vô cơ pha loãng 1%

- Gieo ươm hạt trong bầu

Phương pháp gieo ươm hạt trong túi bầu được sử dụng cho cả phương pháp nhân giống bằng hạt và gieo ươm cây gốc ghép cho nhân giống bằng phương pháp ghép Hạt giống được gieo trực tiếp vào túi bầu tiêu chuẩn hoặc gieo vào túi bầu nhỏ rồi tiến hành

ra ngôi sau Hạt giống thường được xử lý và ủ cho nứt nanh mới tiến hành gieo Hỗn hợp bầu đang được sử dụng là đất + phân chuồng hoai mục với tỷ lệ là 1 m3 đất mặt +

200 - 300 kg phân chuồng hoai mục + 10 - 15 kg supe lân Các khâu kỹ thuật chăm sóc được tiến hành tương tự như phương pháp gieo ươm hạt trên luống đất

Nhân giống vô tính :

2

Phương pháp nhân giống vô tính là phương pháp mà thông qua các cách làm khác nhau tạo ra những cây hoàn chỉnh từ những phần riêng biệt ở cơ quan sinh dưỡng của cây mẹ

2.1 Giâm cành

Giâm cành là phương pháp nhân giống cây trồng bằng cơ quan sinh dưỡng Cơ sở khoa học của phương pháp tương tự như nhân giống bằng phương pháp chiết cành

* Những ưu điểm của phương pháp giâm cành

- Giữ nguyên được đặc tính di truyền của cây mẹ

- Tạo ra cây giống sau trồng sớm ra hoa kết quả

- Thời gian nhân giống nhanh

- Có thể nhân nhiều giống mới từ một nguồn vật liệu giới hạn ban đầu

độ 1-1,5% (chất mang là than hoạt tính), tỷ lệ ra rễ 85-100% (hom từ cây còn tơ), so với 76,6% ở nồng độ 0,5% và 55% đối chứng; cấy sâu 3-4cm, mật độ 5x5cm trên giá thể là cát Muốn việc gây trồng đạt kết quả tốt, trước tiên phải có hom tốt để tạo cây giống tốt Nếu không phải nhân giống để bảo tồn cá thể thì không nên lấy hom từ cây đang thoái hoá (hom ốm yếu cũng có tỷ lệ ra rễ tốt (70-80%), nhưng cây phát triển kém) Cây cho hom còn tơ, khoẻ, mọc ngoài sáng vừa phải là tốt nhất

Về kích thích ra rễ, các hoạt chất thuộc nhóm auxin đều sử dụng được, nhưng tốt nhất là IBA; ABT, NAA, IAA cũng cho kết quả tốt Nồng độ an toàn từ 0,5-2% (đối với thuốc bột) hay từ 100-150ppm/ 4giờ (đối với dung dịch) Trên ngưỡng này, hom chóng

ra rễ hơn nhưng tỷ lệ chết cao hơn, nhất là khi dùng hom còn khá non Nhưng dưới ngưỡng này hom chậm ra rễ và tỷ lệ chết cũng cao hơn do hom bị thối gốc

Sau khi giâm cần tưới ướt bề mặt lá thường xuyên ở dạng phun sương để tránh thoát hơi nước gây rụng lá Khi cành giâm có một đợt lộc mới ổn định sinh trưởng và có đầy

đủ rễ thì tiến hành ra ngôi và chăm sóc cây cho đến khi đạt tiêu chuẩn xuất vườn

Giai đoạn từ giâm cho tới khi có rễ và lộc mới ổn định cần được tiến hành trong nhà giâm, khi ra ngôi cần chọn thời điểm có điều kiện thời tiết thuận lợi hoặc ra ngôi trong điều kiện có mái che

2.2 Ghép cành

Cơ sở khoa học của phương pháp là khi ghép, bằng những phương pháp nhất định làm cho tượng tầng của gốc ghép và thân ghép tiếp xúc với nhau, nhờ sự hoạt động và khả năng tái sinh của tượng tầng làm cho mắt ghép và gốc ghép gắn liền với nhau

* Những ưu điểm của phương pháp ghép

- Cây ghép sinh trưởng phát triển tốt nhờ sự phát triển, hoạt động tốt của bộ rễ gốc ghép và khả năng thích nghi với điều kiện khí hậu, đất đai của cây gốc ghép

- Cây ghép giữ được các đặc tính của giống muốn nhân

- Hệ số nhân giống cao, trong thời gian ngắn có thể sản xuất được nhiều cây giống đáp ứng yêu cầu của sản xuất

- Giống làm gốc ghép sớm cho ra hoa kết quả vì mắt ghép chỉ tiếp tục giai đoạn phát dục của cây mẹ

- Tăng cường khả năng chống chịu của cây với điều kiện bất thuận như: chịu hạn, chịu úng, chịu rét và sâu bệnh

- Thông qua gốc ghép có thể điều tiết được sự sinh trưởng của cây ghép

- Có khả năng phục hồi sinh trưởng của cây, duy trì giống quý thông qua các phương pháp ghép như: ghép nối cầu hay ghép tiếp rễ

* Yêu cầu của giống gốc ghép

- Giống làm gốc ghép phải sinh trưởng khoẻ có khả năng thích ứng rộng với điều kiện địa phương

- Giống làm gốc ghép phải có khả năng tiếp hợp tốt với thân cành ghép

- Giống làm gốc ghép phải có khả năng chống chịu sâu bệnh và có khả năng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất thuận

- Giống làm gốc ghép phải sinh trưởng nhanh, dễ gây giống, ít mọc mầm phụ ở gốc cây con

* Những yêu cầu kỹ thuật để nâng cao tỷ lệ ghép sống và tỷ lệ cây đạt tiêu chuẩn xuất vườn

- Chăm sóc cây con trước khi ghép: sau khi ra ngôi cần áp dụng đầy đủ các quy trình khác của kỹ thuật chăm sóc để cây gốc ghép sớm đạt tiêu chuẩn ghép Trước khi ghép 1 - 2 tuần cần tiến hành vệ sinh vườn cây gốc ghép và tăng cường chăm sóc để cây

có nhiều nhựa, tượng tầng hoạt động tốt

- Chọn cành, mắt ghép tốt: cành ghép được lấy từ vườn chuyên lấy cành ghép hoặc trên vườn sản xuất với những cây mang đầy đủ các đặc tính của giống muốn nhân Cành ghép được chọn ở giữa tầng tán, không có các đối tượng sâu bệnh nguy hiểm gây hại Tuổi cành ghép chọn phù hợp tuỳ thuộc vào thời vụ ghép khác nhau Trong điều kiện cần vận chuyển đi xa, cần bảo quản trong điều kiện đủ ẩm, tránh nhiệt độ cao

- Chọn thời vụ ghép tốt

Thao tác kỹ thuật ghép: đây là khâu kỹ thuật có tính chất quyết định, phụ thuộc vào

sự thành thạo của người ghép Các thao tác ghép cần được tiến hành nhanh và chính xác

- Chăm sóc cây con sau khi ghép: tất cả các khâu kỹ thuật từ mở dây sau ghép, xử lý ngọn gốc ghép, tỉa mầm dại, tưới nước làm cỏ, bón phân, tạo hình cây ghép cho tới công tác phòng trừ sâu bệnh hại cần được tuân thủ một cách nghiêm ngặt, đúng kỹ thuật

* Phương pháp ghép:

Nhằm khắc phục hiện tượng topophysic: Dùng chồi vượt, ghép lên gốc ghép là cây hom từ cành Tỷ lệ thành công 85-90%

Ghép mắt:

-Mắt ghép là chồi non nhú lên trên nách lá

-Cành lấy mắt ghép là những cành " bánh tẻ", đường kính gốc cành từ 6- 10 mm tùy mùa ghép và tùy theo giống loài Mỗi cành có từ 6-8 mầm ngủ ở các nách lá to Chú ý chọn những cành ngoài bìa tán, không có sâu bệnh và ở các cấp cành cao Mỗi cành có

từ 6-8 mầm ngủ ở các nách lá to Vệ sinh chăm sóc và chuẩn bị gốc ghép như ở phương

pháp ghép đoạn cành Có 2 phương pháp ghép mắt chủ yếu là: ghép chữ T và ghép cửa sổ:

a Ghép chữ T: Thường áp dụng cho những cây non, vỏ mỏng, gốc ghép phải đang lên nhựa mới thực hiện được

b Ghép cửa sổ: Thường áp dụng đối với những cây to, vỏ dày và già

Dùng dao ghép mở "cửa sổ" trên thân gốc ghép, cách mặt đất từ 10-20cm Nếu đất

ẩm thì mở cửa sổ cao, đất khô cần ghép thấp hơn Kích thước miệng ghép " cửa sổ" 1 x

2 cm Bóc một miếng vỏ trên cành ghép đã mở Đặt mắt ghép vào " cửa sổ" đã mở của gốc ghép, đậy cửa sổ lại và quấn dây nilông mỏng cho thật chặt Trong vài ngày dầu không nên tưới vì có thể làm úng và hỏng mắt ghép Sau ghép 15-20 ngày có thể mở dây buộc và cắt miếng vỏ đậy ngoài của gốc ghép, nếu có nhựa hàn kín, chứng tỏ việc ghép dã thành công Cắt ngọn gốc ghép cách vết ghép 2cm và nghiêng một góc 450 về phía ngược chiều với mắt ghép Ghép cửa sổ là một trong những phương pháp ghép có

tỷ lệ sống cao nhất

1: Cắt vỏ trên gốc ghép - 2: Lấy mắt ghép - 3: Đặt mắt ghép vào gốc ghép

- 4: Quấn chặt lại bằng dây nilon (chừa đỉnh sinh trưởng của mắt ghép)

Gây trồng

3

Từ năm 1997 đến năm 2000, bố trí thí nghiệm gây trồng được 3,5 ha trên 5 lập địa khác nhau nhằm tìm kiếm biện pháp trồng rừng thích hợp

* Lập địa 1: Thảm thực vật là sim mua, phát thành băng 1,5-2m, chừa 2 hàng hai

bên để che bóng Độ dốc cao, ít thoáng gió Đất nâu vàng trên phiến thạch, thành phần

cơ giới: nhẹ và rất giàu mùn Diện tích 0,2 ha Cây mang trồng là cây hom, trồng năm 1997-1998

* Lập địa 2:Trồng xen trong rừng thưa gồm thông 3 lá và bạch đàn cao 15-20m

Đất nâu đỏ trên bazan, thành phần cơ giới: trung bình Độ dốc lớn nhưng vùng đất trồng tương đối bằng phẳng và khá thoáng gió Diện tích 1ha, trồng năm 1997 và 1998 Cây mang trồng từ hom giâm

* Lập địa 3: Rừng cây bụi và cây nhỏ lá rộng, chặt trồng, đào hố trồng, nên tàn che

khá cao Đất nâu vàng trên phiến thạch, khá nhiều sét ở trên cao, nhưng tơi xốp và giàu mùn ở chân đồi, độ thoáng gió vừa phải, dưới chân đồi có khe suối cạn, đá lộ thiên Tóm lại, đây là vùng đất trồng tương đối giống với khu phân bố tự nhiên Diện tích 1,5ha, trồng năm 1997 và 1999 Cây mang trồng từ hom giâm

* Lập địa 4:Đất ven rừng thông 15 tuổi và trồng xen cả trong lô thông 3 lá này,

nhưng trước đây đã được tỉa khá thưa và đã được tận dụng trồng cây thuốc, nên đất khá tơi xốp và giàu dinh dưỡng Đất nâu đỏ, độ dốc lớn, nhưng vùng đất trồng tương đối bằng phẳng, thoáng gió và độ che bóng tốt Diện tích 0,5 ha Cây mang trồng là cây hữu tính (trồng năm 1998) và cây hom (trồng năm 2000)

* Lập địa 5: Đất trồng trước kia đã được ủi thành băng rộng 2m Đất nặng và cây

không có tàn che, tỷ lệ sống 50% và cây sinh trưởng kém Diện tích 0,2ha, trồng năm

1999 Cây mang trồng là cây hom

Kết luận và đề nghị

*Kết luận

+ Sinh trưởng và đất trồng (lập địa)

– Mức sinh trưởng về chiều cao là thấp, nhất là các cây trồng từ hom cành ngang

Do hiện tượng bảo lưu cục bộ, cây có xu hướng tăng số cành hơn là tăng chiều cao Do vậy, nếu xét về sinh khối thì cây phát triển không quá kém

– Nếu cây phát triển chiều cao thì tăng số cành Có cây có mức sinh trưởng chỉ có 3cm nhưng phát triển đến 15 cành, lại có cây có mức sinh trưởng đến 18cm nhưng chỉ

có 3 cành Sự phát triển theo tỷ lệ nghịch này là phổ biến, nhất là đối với cây từ cành giâm

– Từ năm tuổi 2-3, cây mới phát triển mạnh Nếu xét về chiều cao thì năm thứ hai cây phát triển mạnh hơn hẳn về sinh khối nghĩa là cây phát triển mạnh về cành nhánh – Trong các năm đầu, cây trồng trong bóng râm có tỷ lệ sống cao hơn và sinh trưởng tốt hơn Do râm hơn nên ở lập địa 3 có mức sinh trưởng 10,5cm, trong khi ở lập địa 1 và 2 mức sinh trưởng chỉ có 4-5cm

– Cây mang trồng càng lớn thì mức độ sinh trưởng càng cao về số cành và chiều cao Lập địa 4 cho thấy cây mang trồng có chiều cao lúc trồng là 13cm thì sinh trưởng 4,6cm và mang 7 cành, trong khi đó cây mang trồng cao 48cm thì sinh trưởng 17,6cm

– Kiểm tra cây chết vào mùa khô, cho thấy chúng có bộ rễ ngoằn ngèo, phát triển kém, không đâm sâu vào đất như những cây còn sống

Tóm lại, trong gây trồng, thông đỏ phát triển tốt ở lập địa có cây lá rộng che bóng tầng cao, đất thường xuyên ẩm, tơi xốp và có lớp thảm mục dày như ở lập địa 3 Tuy nhiên, cần chú ý phát quang dần dần Ở lập địa 4 cũng khá tốt, đất ẩm, tơi xốp, giàu mùn và thông thoáng Tuy vậy, thông đỏ lại trồng xen trong rừng thông ba lá – điều không thấy trong tự nhiên, nên cũng cần tiếp tục theo dõi để có kết luận chính xác hơn

+ Che bóng (xử lý thực bì)

Có thể che bóng cho cây con mới trồng bằng nhiều cách:

– Thực bì là cây bụi: Phát thành băng 1-1,5m, chừa 2 hàng 2 bên để che bóng, hàng năm phát quang theo băng vào giữa mùa mưa cho đến khi tán cây vượt qua tầng bụi – Thực bì là cây nhỡ: Cũng phát thành băng Tuy nhiên, cần có kế hoạch tỉa cành và đốn bỏ dần các cây gần thông đỏ, để thoả mãn tính ưa sáng ngày càng cao của chúng – Trồng xen trong rừng thưa tán cao: Có thể chặt bỏ toàn bộ cây bụi và cây nhỡ chỉ

để lại nơi lỗ hổng có nắng chiếu trực tiếp

– Trồng ngoài nắng không có tàn che tự nhiên và không được tưới nước: Cần che túp ngay sau khi trồng, nếu được tưới nước thì không cần che túp

Trong mọi trường hợp cần giữ cho vùng đất trồng được thông thoáng

+ Cây giống: Tuổi cây từ 1,5-2 tuổi, cây khoẻ, cao từ 30cm trở lên và không mang

mầm bệnh, nhất thiết phải loại các cây không đảm bảo chất lượng Thực tế cho thấy cây

hom từ chồi vượt tỏ ra hiệu quả hơn, nhất là trong trồng rừng thuần tuý Do vậy, cần có vườm hom cho chồi vượt để chủ động hơn trong sản xuất ở quy mô lớn

* Đề nghị

– Khu phân bố thông đỏ đang bị thu hẹp và mất dần, nên việc khoanh nuôi bảo vệ là rất cần thiết Chặt thấu quang để giải phóng chúng khỏi các cây bụi và dây leo cũng như chặt bỏ thông ba lá mọc trong khu phân bố

– Trồng bảo tồn nguồn gen cá thể vì hàm lượng taxoid giữa các cá thể rất khác nhau

– Tiếp tục chăm sóc rừng trồng để có kết luận về gây trồng chính xác và đầy đủ hơn

– Hạt thông đỏ rất khó nảy mầm và không phải năm nào cây cũng cho quả Vì vậy,

xử lý bảo quản và nhân giống bằng hạt cũng cần quan tâm nghiên cứu

– Xây dựng vườn giống chất lượng cao nhằm cung cấp hom đúng tiêu chuẩn kỹ thuật, nhất là khi cần sản xuất cây hom từ chồi vượt

Nhân giống bằng nuôi cấy mô

4

4.1 Giới thiệu:

Nuôi cấy mô (tissue culture) là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy vô trùng in vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật Môi trường có các chất dinh dưỡng

thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường

Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép sinh chồi hoặc cơ quan (sự phát sinh cơ quan) từ các

mô như: lá, thân, hoa hoặc rễ

Trước kia người ta dùng phương pháp nuôi cấy tế bào và mô thực vật để nghiên cứu

về đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, sự di truyền và tác dụng của hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy

Ngày nay phương pháp nuôi cấy mô thực vật đã hướng về những ứng dụng thực tiễn, vì nó liên hệ mật thiết với các giống cây trồng Các nhà thực vật học đã áp dụng phương pháp này với mục đích sau

- Tạo một quần thể lớn và đồng nhất trong một thời gian ngắn, với diện tích thí nghiệm nhỏ, có điều kiện hóa lý kiểm soát được

- Tạo được nhiều cây con từ mô và cơ quan của cây (long, thân, phiến lá, hoa, hạt phấn, chồi phát hoa,…) mà ngoài thiên nhiên không thực hiện được

- Làm sạch nguồn virus cho cây bằng cách cấy mô phân sinh ngọn

- Cải tiến các giống cây trồng bằng công nghệ sinh học

Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền (ví dụ: giống cây trồng), sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý…

Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Nuôi cấy các cơ thể thực vật hoàn chỉnh

- Nuôi cấy các cơ quan, bộ phận tách rời của thực vật như- mẩu lá, mẩu rễ, một đoạn thân, một bộ phận của hoa, quả

- Nuôi cấy phôi non (phôi chưa phân hoá hoàn toàn), phôi trưởng thành

- Nuôi cấy mô sẹo (callus)

- Nuôi cấy tế bào: Tế bào thực vật đơn (nuôi cấy huyền phù tế bào), tế bào trần

4.2 Các bước nuôi cấy mô

Ngày nay, hầu hết các nhà nghiên cứu khoa học đều thống nhất rằng thành công của nuôi cấy mô tế bào chỉ đạt được khi nó trải qua 5 bước sau:

Bước 0: Bước chuẩn bị

Chọn lọc cây mẹ đạt tiêu chuẩn sau:

- Cây mẹ có đặc điểm di truyền, đặc điểm nông, sinh học quý ta cần

- Có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt

- Sạch bệnh, đặc biệt là sạch virus

- Nếu trong tự nhiên không có những cây đạt tiêu chuẩn trên, phải trồng các cây

mẹ trong điều kiện cách ly với nguồn bệnh hoặc tối ưu về điều kiện chăm sóc, dinh dưỡng, bảo vệ thực vật… để có cây mẹ đạt tiêu chuẩn

Bước 1: Nuôi cấy khởi động

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh mẫu nuôi cấy Mẫu nuôi cấy thường sử dụng trong phòng thí nghiệm là chồi đỉnh, chồi nách của cây mẹ Ngoài ra, tuỳ thuộc từng đối tượng nuôi cấy người ta còn có thể sử dụng các mẫu nuôi cấy như: mẩu lá, đài hoa, cánh hoa, mẩu rễ, phôi non

Cần xác định chế độ khử trùng cho mẫu cấy trước khi tiến hành để đảm bảo mẫu sạch vi sinh vật nhưng tỉ lệ sống cao Hiện nay sử dụng chủ yếu là phương pháp sát trùng bề mặt bằng chất hoá học, thường là HgCl2 0,1% sát trùng trong 5-10 phút Ít phổ

biến hơn là các dung dịch hypoclorit như NaOCl, Ca(OCl)2 5% trong 20-30 phút Ngoài ra còn dùng H2O2 15%, dung dịch Brom 5-10% nhưng hiệu quả không cao

Sau khi khử trùng mẫu cấy, ta tiến hành đưa mẫu cấy vào môi trường thích hợp để mẫu cấy tạo thành chồi mầm hoặc phôi vô tính Việc lựa chọn môi trường thích hợp là rất khó khăn, cần phải đặc biệt chú ý đến tỷ lệ, hàm lượng các chất điều khiển sinh trưởng trong môi trường để làm cho mẫu cấy phát sinh được hình thái

Bước 2: Nhân nhanh mẫu

Toàn bộ quá trình nuôi cấy mô tế bào xét cho cùng chỉ nhằm mục đích chính là tạo

ra hệ số nhân chồi cao nhất Chính vì vậy giai đoạn này được coi là giai đoạn đánh giá tính ưu việt hay không ưu việt của phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Ở giai đoạn này, môi trường dinh dưỡng nhân tạo để nuôi cấy thường được đưa thêm vào chất điều khiển sinh trưởng, các chất bổ sung khác như nước dừa, nước chiết nấm men, dịch thuỷ phân casein kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng nhằm đạt được hệ số nhân chồi cao nhất mà vẫn đảm bảo sức sống, bản chất di truyền, có thể tạo thành cây hoàn chỉnh, đạt tiêu chuẩn cây giống ở giai đoạn sau Tuy nhiên, tuỳ từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể đạt được hệ số nhân cao bằng việc kích thích sự hình thành các cụm chồi hay kích thích sự phát triển của các chồi nách hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính

Bước 3: Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được một kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường trong bước 2 vào môi trường tạo rễ Thường sau 2-3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ Ở giai đoạn này, người ta bổ sung vào môi trường các auxin vì auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy Tuy nhiên, ở một

số loài như chuối hoặc cây ngái sự hình thành rễ tốt hơn cả đạt được trong môi trường không có chất điều hoà sinh trưởng

Bước 4: Thích ứng cây in vitro trong điều kiện tự nhiên

Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quy trình nuôi cấy mô tế bào Cây lấy ra ống nghiệm phải được rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ

để tránh sự xâm nhập của côn trùng và nấm mốc Theo Bhojwani và Razdan(1983), quy trình này sẽ thành công hơn nếu trước khi đưa cây con ra đất ta ươm cây trên cát

có độ ẩm 90% từ 10 đến15 ngày Trong những khoảng thời gian này, rễ mới đượcc sinh

ra và bắt đầu hình thành lá mới Sau đó chuyển cây ra đất với chế độ chăm sóc bình thường

Tuy nhiên vẫn còn một số các vấn đề tồn tại trong việc nuôi cấy mô tế bào Đó là:

- Sự bất định di truyền

+ Khi sử dụng kĩ thuật nuôi cấy mô để nhân giống vô tính, có xảy ra hiện tượng biến dị soma: sù sai khác về hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hoá, di truyền của những cây tái sinh nhận được ở ngay giai đoạn invitro hoặc giai đoạn exvitro

+ Khắc phục: Chọn mẫu cấy là mô non it chuyên hoá để dễ điều khiển và phát triển hình thái, giảm lượng chất điều khiển sinh trưởng sử dụng, từ đó giảm được ảnh hưởng của chúng Đồng thời, phải hạn chế số lần cấy chuyển khi nhân nhanh (5-6 lần), để giảm sự tích luỹ, gia tăng ảnh hưởng của các chát điều khiển sinh trưởng

- Sự nhiễm mẫu cấy

+ Có một số vi sinh vật có khả năng xâm nhập và tồn tại rất sâu trong hệ thống mô dẫn của thực vật Khi tế bào thực vật bắt đầu phát triển, phân chia, chúng làm nhiễm mẫu vào môi trường sau 2-3 tuần nuôi cấy

+ Khắc phục: Chọn và nuôi trồng cây mẹ đúng tiêu chuẩn, nếu cây mẹ bị bệnh có thể dùng kháng sinh để khử trùng mẫu

- Sự tiết độc tố từ mẫu cấy

+ Sau 1-2 ngày đưa vào môi trường, mẫu cấy tiết ra những chất màu đen, nâu làm hỏng môi trường, chết mẫu Các chất đó có thể là tanin, polyphenol bị oxy hoá + Khắc phục: Chọn mẫu non để giảm hàm lượng tanin, polyphenol, gây vết thương

cơ giới tối thiểu nhất, xử lý mẫu cấy bằng cách ngâm trong dung dịch acid hữu cơ

có tính khử mạnh: acid ascorbic, acid citric; bổ sung vào môi trường than hoạt tính để hấp phụ các chất nói trên

- Hiện tượng thuỷ tinh hoá mẫu cấy

+ Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng và bình nuôi bị hạn chế về khả năng trao đổi khí thì tế bào và mô thực vật bị mọng nước, trở nên trong suốt, có hình dạng không bình thường

+ Khắc phục: Bổ sung vào môi trường chất gây áp suất cao, chất ức chế tổng hợp etilen, tăng cường độ chiếu sáng và giảm nhiệt độ phòng nuôi

4.3 Ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào trong công tác nhân giống cây trồng:

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật có thể phục vụ rất nhiều lĩnh vực khác nhau Trong công tác giống cây trồng, nuôi cấy in vitro được ứng dụng để:

- Làm phong phú vật liệu di truyền cho công tác chọn giống

- Duy trì, bảo quản, nhân nhanh các giống và cá thể có ý nghĩa khoa học, có giá trị kinh tế cao

- Làm sạch virus, phục tráng giống bị thoái hoá vì bệnh

Trong số đó, ứng dụng để nhân nhanh giống vô tính cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy in vitro được quan tâm hơn cả Người ta ước tính có khoảng

300 loại cây có thể được nhân giống bằng phương pháp này Lợi ích của nó là

ở chỗ: có thể tạo ra một quần thể cây con với số lượng lớn mà vẫn giữ nguyên đặc tính cây mẹ, đó cũng là những cây giống khoẻ mạnh, sạch virus, sinh trưởng tốt

và cho năng suất cao; có thể phục tráng một quần thể thực vật có nguy cơ diệt vong; có thể trao đổi quốc tế nguồn gen và lưu giữ, bảo quản dạng cây in vitro Chính nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, người ta có thể tạo ra được hệ số nhân giống cao, sớm phát huy được hiệu quả kinh tế, không tốn diện tích cho nhân giống, dễ chăm sóc và dễ dàng khắc phục được những điều kiện bất lợi Phương pháp này tỏ ra đặc biệt hiệu quả với những loại cây khó nhân giống bằng con đường hữu tính, các giống quý hiếm có số lượng giống ban đầu hạn chế mà lại cần nhân nhanh

4.4 Nuôi cấy in vitro để phát triển rễ trên cây Thông đỏ Taxus wallichiana Zucc

Kỹ thuật cắt đã được sử dụng trong thời gian 1994-1996 để bảo tồn T wallichiana

tại Viện Sinh học Đà Lạt mà tỷ lệ hình thành rễ là 38% sau 90 ngày (Hình 1A) Nhìn

chung, các nhánh của Taxus wallichiana thực hiện có rễ phát triển mạnh, sau 3 tháng và chiều dài rễ trung bình 6-8 cm đã được ghi nhận

Đối với việc bảo tồn và nhân giống hàng loạt các loài nguy cấp và có giá trị này, T wallichiana, một quy trình trong ống nghiệm đã được phát triển thông qua cảm ứng

chồi nụ, chồi cây và tái sinh rễ

Hình 1: Kĩ thuật cắt cành đối với cây T wallichiana: (A) Cành cho rễ (B) Rễ sau 3

tháng

Quy trình thí nghiệm:

Phần này mô tả các quy trình để phát triển chồi non trong ống nghiệm và cảm ứng

chồi nụ của Taxus wallichiana Zucc.,

4.4.1.Cấy vô trùng

Bộ mẫu cấy T wallichiana được lựa chọn từ các nhánh còn non mang nhiều chồi ngủ (dormant buds) (hình 2) Đánh dấu những chồi ( sprout) mới được tạo ra Sau 15 đến 25 ngày, thu thập các mẫu cấy bằng cách cắt bằng kéo sắc nhọn và sạch vào cuối chồi mới tạo ra, để lại bộ phận cũ Chỉ cây non, màu xanh, chồi tăng sinh mạnh không

có bất kỳ triệu chứng nhiễm trùng có thể được lựa chọn

Hình 2 Cây non cho bộ mẫu cấy (a) Thông đỏ Taxus wallichiana năm tuổi trồng ở Đà

Lạt Viện Sinh học (b) nhánh non có chồi ngủ (c) Chồi nụ (d) Chồi non

Khử trùng mẫu cấy Sau khi thu mẫu, nhánh, thân còn non và chồi được cắt thành các đoạn dài 5 cm dài và rửa sạch nhiều lần bằng nước cất vô trùng Đầu tiên, nhúng các đoạn trong chất tẩy rửa loãng cho 25 đến 30 phút và rửa sạch dưới vòi nước chảy để 1,5-2 h Khử trùng bề mặt được thực hiện với ethanol 70% trong 30 giây, HgCl2 1 ‰ thêm 2-3 giọt 0,01% Tween-80 trong vòng 10 đến 12 phút Sau đó rửa sạch các đoạn bốn lần bằng nước cất vô trùng

Bộ mẫu cấy và vô trùng có thể đạt được tốt nhất với thân non 25 ngày tuổi và chồi cây 14 ngày tuổi Bảng 1 cho thấy sự khác biệt trong các mẫu cấy sau khi vô trùng và nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản (Murashige & Skoog, 1962)

Ba loại mẫu cấy, nhánh 45 ngày tuổi, thân non 25 ngày tuổi và chồi cây 14 ngày tuổi

đã được kiểm tra về khả năng tồn tại và phát triển sau khi vô trùng Thể hiện như trong bảng 1, mẫu cấy có nguồn gốc từ các nhánh 45 ngày tuổi có nguy cơ bị ô nhiễm cao (100%) Các mẫu còn non (thân non và chồi từ mẫu cấy) bị ô nhiễm thấp hơn (10%),với

tỉ lệ sống sót cao hơn và tỉ lệ phần trăm chồi cây

Sau khi vô trùng, cắt các đoạn mẫu cấy thành 2-2,5cm và đặt chúng theo chiều dọc trên môi trường nuôi cấy

4.4.2.Môi trường nuôi cấy

Môi trường cơ bản chứa khoáng MS và vitamin (Murashige & Skoog, 1962) bổ sung20 g/l sucrose sử dụng trong suốt toàn bộ quá trình Auxin NAA (acid α-naphthaleneacetic), IAA (indole-3-acetic acid) và IBA (indole-3-butyric acid), cytokinin BA (6-bebzyladenine) được thêm vào môi trường nuôi cấy ở các nồng độ khác nhau ( bảng 2, 3 và 4) Than hoạt tính cũng được bổ sung để giảm ảnh hưởng của hợp chất phenolic trong các mẫu cấy (Pan & Staden, 1998) Môi trường được hóa rắn bằng cách thêm 9 g/l thạch agar

Nuôi cấy chồi cây được thực hiện trong các ống nghiệm 250ml (40ml môi trường nuôi cấy/ống) Giá trị pH được điều chỉnh ở 5,8-5,9 bằng cách thêm 1N NaOH và 1N KCl trước khi hấp khử trùng tại 121°C, 1 atm (1.02 × 10 Ba) từ 30 đến 40p

Một môi trường nuôi cấy tối ưu, bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGRs) khác nhau, nên thử nghiệm để cho kết quả cụ thể (xem bảng 2,3 và 4)

4.4.3.Điều kiện nuôi cấy

Nuôi cấy trong phòng sinh trưởng ở 25 ± 2°C, độ ẩm tương đối 75-80%, mật độ dòng photon hữu hiệu cho quang hợp ( PPDF ) 45-50 μmol.m - 2.s - 1, chiếu sáng dưới 16h

Bảng 2: Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật α - naphthaleneacetic axít (NAA), indole - 3 - acid acetic (IAA) và indole - 3 - a - xít bu - ti - ric (IBA) và than hoạt tính

bổ sung vào môi trường cơ bản MS dùng cho sinh trưởng rễ và sự kéo dài

Bảng 3: Nồng độ chất điều hòa tăng trương thực vật ( 6 – benzyladeninei.e BA) và than hoạt tính bổ sung vào môi trường cơ bản MS dùng để gây cảm ứng chồi ngẫu nhiên

Bảng 4: Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật α-naphthaleneacetic acid (NAA), indole- 3-acetic acid (IAA) và indole-3-butyric acid (IBA, vitamin B1 và than hoạt tính

bổ sung vào toàn bộ hoặc một nửa của môi trường cơ bản MS được sử dụng để hình thành rễ

4.4.4.Thiết lập nuôi cấy chồi non

Sử dụng thân non dài 1,5-2 cm và / hoặc chồi cây dài 2-2,5 cm

*Tăng trưởng và phát triển chồi non

Hầu hết các lá cây T wallichiana từ mẫu cấy là thân có màu xanh và vẫn còn sống trong khi hơn một nửa số lá có nguồn gốc từ mẫu cấy chồi cây trở thành màu vàng, chuyển màu nâu và chết sau 8 tuần nuôi cấy Tất cả các ngọn chồi cây nuôi cấy chỉ cho thấy kéo dài chồi cây ở mỗi mẫu cấy trong các môi trường nuôi cấy thử nghiệm, trong khi mẫu cấy thân có chồi nụ (bud) kéo dài ở nách lá (Hình 3 và 4)

Hình 3: Tỷ lệ phần trăm của mẫu cấy T wallichiana trên môi trường nuôi cấy mô cơ

bản MS khác nhau không có than hoạt tính cho thấy nách nụ kéo dài

Để có chồi nụ ở nách lá, nuôi cấy chồi cây trong môi trường C7 (có bổ sung 1mg/l IBA) Để có chồi cây kéo dài, nuôi chồi cây trong môi trường C4 (có bổ sung 1mg/l IBA) (Hình 3 và 4)

Ở nồng độ cao, auxin ức chế sự phát triển của chồi nụ ban đầu hoặc ở nách lá và gây

ra sự hình thành mô sẹo Chồi kéo dài tốt hơn trong môi trường có chứa nồng độ PGRs thấp hơn (Chang và cộng sự., 2001) Hầu như tất cả mẫu cấy đặt trong môi trường nuôi cấy có bổ sung 3mg.l-1 và 5mg.l-1 auxin đã cho thấy giảm tốc độ tăng trưởng, sinh phenolic, và hình thành mô sẹo

Để thúc đẩy chồi cây kéo dài và làm giảm việc hình thành các hợp chất phenolic, thêm than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy Tỷ lệ mẫu cấy cho thấy chồi nụ tăng trưởng ở nách lá trong môi trường nuôi cấy có bổ sung 2 g.l–1 than hoạt tính có thể đạt tới trên 80% với chiều dài trung bình chồi cây khoảng 3,32 cm, và gần 90% chiều dài trung bình của chồi cây khoảng 3,7 cm trong môi trường C10 và C11, tương ứng

Hình 4: Chiều dài trung bình rễ (cm) của T wallichiana cấy trên môi trường khác nhau

MS mà không có than hoạt tính

* Mẫu cấy ban đầu đối với tăng trưởng chồi cây

Chồi cây mới vô trùng được sử dụng trong tăng trưởng chồi ở điều kiện ống nghiệm Các chồi mới được vô trùng và chồi cây 7 tuần tuổi đặt trong ống nghiệm và thân cây được cấy vào môi trường C10 và C11 Sau 10 tuần nuôi cấy, tất cả các mẫu cấy ex vitro phát triển rất tốt, lá có màu xanh lá cây; trong khi ban đầu trong ống nghiệm 7 tuần tuổi cho thấy không có sự tăng trưởng và lá có màu vàng Đây là có thể là do trạng thái sinh

lý trước đó cũng như các điều kiện tăng trưởng (Bảng 5)

4.4.5.Cảm ứng chồi nụ

Thân cây non dài 1,5-2 cm trong môi trường nuôi cấy Cytokinin rất cần thiết cho sự cảm ứng của mầm nụ ở các vj trí khác trong loài cây lá kim Trong số các cytokinin,

BA được cho thấy là có hiệu quả nhất để kích thích chồi từ nuôi cấy thân của giống cây

Taxus mairei (Chang và cộng sự., 2001)

Cảm ứng và nhân chồi ngẫu nhiên từ thân cây non được khảo sát trên AB1 (chứa 1mg.l-1 BA) và trung bình AB4 (chứa 1mg.l-1 BA và 2g.l-1 than hoạt tính) 22,4% các

mẫu cấy hình thành chồi ngẫu nhiên trong môi trường AB1 sau 6 tuần nuôi cấy Trong

số đó, 0,9% mẫu cấy có hai chồi và 3,45% chồi mới được kéo dài với chiều dài trung bình khoảng 0,75 cm Một số mẫu cấy phồng lên và hình thành mô sẹo nhỏ ở đầu cắt của chồi 18% mẫu cấy tạo ra chồi nụ ngẫu nhiên trong môi trường AB4; trong đó 3,33% các nụ mới kéo dài với chiều dài trung bình khoảng 1,3 cm

Sau 12 tuần nuôi cấy, số lượng mẫu cấy có chồi ngẫu nhiên tăng trong cả hai môi trường AB1 và AB4 Trong AB1, 80,7% mẫu cấy có thể sản sinh chồi ngẫu nhiên (Hình 5) Trong số đó, 17,4% mẫu cấy hình thành hai chồi nụ và 1,8%, 0,9% và 0,9% mẫu cấy hình thành ba, bốn, và sáu chồi, tương ứng Trong AB4, 41,9% do mẫu cấy chồi ngẫu nhiên, 54,2% mẫu cấy hình thành mô sẹo Theo Ahuja (1985), khi than hoạt tính đã

được sử dụng, chồi non kéo dài và kích thước của lá bạch đàn Eucalyptus citriodora

tăng nhưng số lượng chồi non giảm Webb et al (1988) phát hiện ra rằng sự kéo dài chồi dược kích thích bởi than nhưng làm ức chế cảm ứng chồi non khi có cả BA Mẫu

cấy T wallichiana có thể được tạo ra trong cả hai môi trường AB1 và AB4 Tuy nhiên,

trong môi trường AB1 các mẫu cấy tạo ra nhiều chồi nụ hơn một nụ trên mỗi mẫu cấy, nhưng các chồi ngắn hơn những chồi trong môi trường AB4