1. Trang chủ
  2. » Nông - Lâm - Ngư

kỹ thuật nhân giống khoai tây sạch bệnh bằng phương pháp nuôi cấy mô

12 2,5K 7

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 12
Dung lượng 239,37 KB

Nội dung

Kỹ thuật Nhân giống khoai tây sạch bệnh bằng phương pháp nuôi cấy mô In Vitro Diện tích trồng khoai tây ở nước ta đã có thời gian đạt trên 11 vạn ha, nhưng sau đó cứ giảm dần.. Nhân giố

Trang 1

Kỹ thuật Nhân giống khoai tây sạch bệnh bằng phương pháp nuôi cấy mô (In Vitro)

Diện tích trồng khoai tây ở nước ta đã có thời gian đạt trên 11 vạn ha, nhưng sau đó cứ giảm dần Đến nay diện tích khoai tây hàng năm biến động trong phạm vi 2,5 đến 3,3 vạn ha nguyên nhân chính là do trồng khoai tây chưa có hiệu quả kinh tế cao; đầu tư lớn (trong đó có khâu giống quá tốn kém lại có biểu hiện thoái hoá), đặc biệt giống bị nhiễm bệnh virus rất nặng Tỷ lệ bệnh virus hại khoai tây ở nước ta khoảng 20 - 70% và bệnh này lây lan rất nhanh Nếu vụ thứ nhất chỉ có 0,63% cây bệnh thì vụ thứ 4 tỷ lệ bệnh lây lan

tự nhiên đã là gần 22%, sau 10 năm có thể đạt tới 48,3% Năng suất khoai tây

bị giảm 28 - 70% do nhiễm bệnh virus gây ra, chủ yếu là bệnh xoắn lá lùn

Do đó, việc liên tục sản xuất các giống khoai tây sạch bệnh để cung cấp cho sản suất đại trà là 1 yêu cầu bức xúc của người nông dân Nhân giống khoai tây bằng phương pháp nuôi cấy mô là 1 trong những cách tích cực nhất,

khoa học nhất để nhân nhanh giống khoai thây sạch bệnh

I Tạo nguồn vật liệu sạch virus để nuôi cấy in vitro:

Công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật là 1 công cụ hữu hiệu gần như là duy nhất để tạo ra nguồn giống cây sạch virus

I.1 Nguyên lý, kỹ thuật làm sạch virus qua nuôi cấy mô phân sinh

đỉnh (meristem)

Trong thực tế, sự phân bố của virus vào tế bào mô của những cây bị bệnh không đồng nhất như nhau mà phụ thuộc vào khả năng sinh trưởng và phân chia của tế bào Kết quả nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới đều thống nhất ở cây nhiễm bệnh, bộ phận mô phân sinh đỉnh hoàn toàn không có virus (mô này nằm ở đỉnh chồi, kích thích khoảng 0,1 - 0,2mm, chuyên làm

Trang 2

nhiệm vụ phân chia tế bào để hình thành hàng loạt các tế bào mới) Vì vậy, năm 1950 Morel và Martin (Pháp) đã đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào phân sinh đỉnh để tạo ra cây sạch virus

I.2 Các kỹ thuật làm sạch virus in vitro:

Kỹ thuật làm sạch virus in vitro gồm có:

I.2.1 Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh (meristem)

Thao tác chính xác để tách meritem có kích thước < 0,3mm, nuôi cấy chúng trên môi trường sinh dưỡng phù hợp để tái sinh thành cây Sau đó kiểm tra độ sạch virus ở cây tái sinh bằng phương pháp khác nhau để thu nhận được cây sạch bệnh

I.2.2 Nuôi cấy meristem kết hợp x ử lý nhiệt độ cao:

ở nhiệt độ cao 36 - 360C thì 1 số loài virus không có khả năng nhân lên Lợi dụng đặc tính này, áp dụng phương pháp nuôi cấy meristem kết hợp xử lý nhiệt độ để tẩy sạch virus ra khỏi mẫu Theo phương pháp này có thể tách meristem ở kích thước lớn hơn (0,5 - 1mm) nên việc tách và tái sinh cây thuận lợi hơn so với tách meristem ở kích thước nhỏ

Có thể xử lý nhiệt độ cao 36 - 370C thời gian dài đối với cây mẹ trước khi tách meristem hoặc xử lý các mẫu sau Khi đưa vào nuôi cấy in vitro ở 39

- 400C trong 1 - 2 tuần

I.2.3 Nuôi cấy meristem kết hợp xử lý hoá chất:

Người ta đưa vào môi trường nuôi cấy meristem có kích thước lớn 0,5 - 1mm các hoá chất như: 2-Thiouracil, Ribavirin Vidarabin để làm tăng khả năng kháng virus của tế bào, mô thực vật

I.2.4 Quy trình làm sạch virus được tiến hành theo sơ đồ:

Trang 3

- Xác định virus

- Xử lý nhiệt độ cao 36 - 370C

- Tiếp tục xử lý nhiệt độ cao 39- 400C

Nuôi cấy mô

phân vi sinh

Nuôi cấy môi trường thích hợp

Cây sạch bệnh

Cây tái sinh

Trồng trong vườn

ươm

Cung cấp cho sản xuất Cây bị bệnh

Xét nghiệm virus:

- Cây chỉ thị

- Kính hiển vi Điện tử Duy trì độ sạch bệnh:

- Huyết thanh - Nhà màn cách ly, vùng cách ly

- ELISA - Thanh lọc, vệ sinh

Trang 4

II Các bước tiến hành kỹ thuật nuôi cấy meristem

II.1 Bước 1: Chuẩn bị mẫu

- Lấy củ khoai tây đã có mầm trồng vào chậu đất mùn hoặc cát để được

vô trùng và đặt trong điều kiện nhiệt độ, ánh sáng bình thường

- Khi mầm cao 10 - 15cm, cắt lấy phần ngọn dài 3 - 4cm

- Rửa ngọn bằng nước xà phòng loãng

- Dùng vòi nước chảy để rửa nước xà phòng, sau đó được rửa lại bằng

nước cất rồi đặt vào buồng cấy để thực hiện các thao tác tiếp theo

II.2 Bước 2: Khử trùng mẫu trong buồng cấy vô trùng

- Tráng lại mẫu bằng cồn 700, sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng 2

- 3 lần

- Khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 5 - 7 phút

- Rửa mẫu 2 - 3 lần bằng nước cất Sau đó đặt mẫu lên giấy lọc đã vô

trùng cho thấm bớt nước rồi đặt trong bình trụ đã được vô trùng

II.3 Bước 3: Tách meristem:

- Dùng dụng cụ ( dao cấy, kéo, panh nhỏ, kim nhọn) đã được vô trùng

để tách meristem dưới kính hiển vi soi nổi có độ phóng đại x 25

- Dùng dao cấy hoặc kim nhỏ gạt bỏ các lá ngoài để lộ đỉnh sinh trưởng

- Dùng dao cấy tách lấy meristem với độ dài 0,2 - 0,5mm rồi cấy trên

môi trường thạch nghiêng

II.4 Chú ý các điều kiện để nuôi cấy:

- Về nhiệt độ phòng nuôi cấy: 20 - 250C

- Về quanh chu kỳ nuôi cấy: 16 giờ sáng/8 giờ tối

- Về môi trường nuôi cấy thành phần như sau:

TT Tên hoá chất

Lượng pha 1 lít dung dịch

mẹ

Lượng lấy cho 1 lít môi trường nuôi cấy

Ghi chú

I Đa lượng

Lấy 50ml/lít Pha chung

5 CaCl2 2H2O 8,8gr Lấy 50ml/lít Pha riêng

Trang 5

II Vi lượng

Lấy 10ml/lít Pha chung

III Sắt

Lấy 5ml/lít Pha chung

IV Vitamin

1 Axit Nicotinic (B5) 50,0mg

2 Thiamin HCl 50,0mg

4 Ca-pantothenate 25,0mg

Lấy 20ml/lít Pha chung

VII

Bổ sung sau khi

đã khử trùng môi trường

VIII pH môi trường 5,3 - 5,5

- Môi trường cấy được phân phối khoảng 3 - 4ml cho mỗi ống nghiệm

nhỏ 12 x 100mm

- Sau khi nuôi cấy khoảng 4 - 5 tuần, đỉnh sinh trưởng phát triển thành 1

cây khoai tây rất mảnh, cao khoảng 2 - 3cm Các lá phía dưới bị biến đổi ở

dạng vảy nhỏ và còn 1 - 2 lá trên ngọn có hình thái rõ Lúc này có thể cắt các

đoạn cây khoai tây để nhân Sau 2 - 3 lần nhân cây khoai tây trở về kích thước

bình thường của cây khoai tây nuôi cấy mô

- Khi cây đã hoàn chỉnh cần chuyển sang môi trường mới để nhân dòng

Nếu kiểm tra sạch virus thì nuôi cấy trên môi trường nhân để tạo số lượng lớn

cây sạch bệnh

Trang 6

III Sản xuất khoai tây sạch bệnh bằng kỹ thuật nuôi cấy mô:

Kỹ thuật sản xuất khoai tây sạch bệnh bằng phương pháp nuôi cấy mô

được tiến hành theo các bước sau đây:

III.1 Kỹ thuật đưa mẫu cây sạch bệnh vào nuôi cấy mô:

- Chọn tách lấy mầm khoai tây khoẻ có độ dài 1 - 1,5cm, sạch virus

- Ngâm lắc mầm trong nước xà phòng 2 - 5 phút

- Rửa sạch xà phòng dưới vòi nước chảy

- Khử trùng bằng HgCl2 nồng động 0,1% từ 5 - 10 phút

- Rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng 5 lần

- Vệ sinh, cắt bỏ bớt phần dập hỏng (mẫu nuôi cấy có kích thước 0,5 - 0,7mm)

- Cắt các đoạn chồi mầm có kích thước 0,5 - 0,7mm để nuôi cấy

- Cấy vào môi trường có agar, nên dùng ống nghiệm, mỗi ống nghiệm cấy 01 mẫu

- Sau 15 - 20 ngày chuyển những mẫu không bị nhiễm bệnh hoặc không

bị chết sang môi trường mới (môi trường nhân nhanh) còn gọi là môi trường

MS (Murashige and Skoog - 1962) gồm có thành phần như sau:

TT Tên hoá chất Lượng pha 1 lít

dung dịch mẹ

Lượng lấy cho

1 lít môi trường nuôi cấy

Ghi chú

I Đa lượng

Lấy 50ml/lít Pha chung

5 CaCl2 2H2O 8,8gr Lấy 50ml/lít Pha riêng

II Vi lượng

2 MnSO4 4H2O 2300,0mg

6 MoO4Na2 2H2O 25,0mg

Lấy 10ml/lít Pha chung

Trang 7

III Sắt

Lấy 5ml/lít Pha chung

IV Vitamin

1 Axit Nicotinic

2 Thiamin HCl 20,0mg

Lấy 2ml/lít Pha chung

Pha chung

VIII PH môi trường 5,0 - 5,5

III.2 Kỹ thuật nhân nhanh:

- Cắt cây thành những đoạn có 1 - 2 lá (Riêng phần ngọn cắt những

đoạn có 2 - 3 lá) cấy từ 5 - 7 đoạn/1 bình môi trường lỏng chứa từ 7 - 10 ml môi trường MS + 10% nước dừa (Chú ý cấy đoạn thân riêng, đoạn ngọn riêng) Trên môi trường đặc cấy từ 7 - 10 đoạn/1 bình (khoảng 25 - 30ml môi trường) Sau 12 - 15 ngày cấy chuyển 1 lần

- Chú ý nên cấy chuyển luân phiên giữa môi trường đặc và lỏng để đảm bảo cả hệ số nhân và chất lượng cây giống

- Điều kiện phòng nuôi cấy:

+ Nhiệt độ phòng nuôi: 20 - 220C

+ Quang chu kỳ: 16 giờ sáng/8 giờ tối

+ Cường độ ánh sáng: 4000 Lux

- Môi trường sử dụng cho nhân nhanh có thể sử dụng 1 trong các môi trường dưới đây:

+ MS + 2% Saccaroza + 10% nước dừa (môi trường lỏng)

+ MS + 2% Saccaroza + 10% nước dừa + 6 - 6,5gr agar (môi trường

đặc)

IV Sản xuất khoai tây sạch bệnh trong ống nghiệm:

Củ bi (microtuber) được tạo trong ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy (in vitro) từ những cây sạch bệnh nên là củ siêu sạch

IV.1 Tiêu chuẩn để tạo củ trong ống nghiệm:

Trang 8

Muốn cây hình thành được nhiều củ thì cây phải được sinh trưởng tối đa

về thân lá Bộ lá càng lớn thì củ càng to Sau khi cấy 25 - 30 ngày cây đạt tiêu chuẩn tạo củ phải đảm bảo: Cao 7 - 10cm, có khoảng 8 - 10 lá

IV.2 Môi trường tạo củ trong ống nghiệm:

MS + 12% đường

IV.3 Các bước tạo củ trong ống nghiệm:

- Đặt các bình có chứa đủ tiêu chuẩn tạo củ trong tủ cấy vô trùng, mở nút, đốt khử trùng miệng bình rồi rót cẩn thận dung dịch môi trường tạo củ qua phễu đã khử trùng vào bình

- Mỗi bình trụ, bình huyết thanh có thể đổ 30 - 40ml, bình tam giác đổ

50 - 70ml Nhìn chung, lượng môi trường tạo củ rót vào bình cần đủ để ở tạo một lớp 1 - 1,5cm trên mặt thạch

- Sau khi đổ dung dịch tạo củ, đốt khử trùng miệng bình và đậy nút

- Chuyển những bình đã bổ sung dung dịch tạo củ vào buồng tối có nhiệt độ 20 - 250C Sau 2 tháng để ở điều kiện này có thể tiến hành thu hoạch

củ in vitro Trước thu hoạch 10 ngày đưa bình ra điều kiện ánh sáng tán xạ để lục hoá vỏ củ, làm tăng khả năng chống chịu và bảo quản củ sau này

V Kỹ thuật ra cây, tạo bồn mạ và nhân nhanh cây sạch bệnh bằng cắt ngọn

Chuyển cây từ trong in vitro ra ngoài điều kiện tự nhiên là giai đoạn cuối cùng của quy trình nhân nhanh giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật Giai đoạn này tối quan trọng quyết định sự thành công của việc nhân giống vô tính in vitro Công việc này cần được đảm bảo:

+ Tiêu chuẩn cây để đưa ra thích hợp

+ Thời vụ ra cây thích hợp

+ Giá thể trồng cây tối ưu

+ Chế độ chăm sóc hợp lý

V.1 Tiêu chuẩn cây in vitro đưa ra bồn mạ:

Cây được xem là đủ tiêu chuẩn khi đã cấy chuyển được 10 ngày cây cao

4 - 5cm, co 4 - 5 lá, có rễ đầy đủ Tránh sử dụng cây quá cao dễ bị đổ gẫy và

mọc vống

Trang 9

V.2 Bồn mạ và phương pháp tạo bồn mạ khoai tây:

Bồn mạ khoai tây là nơi trồng cây nuôi cấy mô với mật độ lớn Bồn mạ

có thể được làm bằng khay gỗ, khay nhựa không quá lớn để dễ dàng di chuyển

- Kích thước của bồn: dài 50cm x rộng 40cm x sâu 10cm Trồng 150 cây/khay Phía dưới khay là hộp xốp hoặc thùng đựng dung dịch dinh dưỡng theo dạng thuỷ canh

- Cách tạo bồn mạ: Cây trong bồn được lấy ra nhẹ nhàng bằng panh, sau

đó dùng thuốc rửa sạch môi trường (agar, đường) còn bám dính vào rễ Rửa từng cây và thật nhẹ nhàng để tránh dập nát Rửa được 10 bình (khoảng 100 cây lại thay nước 1 lần)

V.3 Giá thể ra cây thích hợp

V.3.1 Giá thể thích hợp là yêu cầu đầu tiên của việc đưa cây in vitro ra

bồn mạ Giá thể phải đảm bảo: sạch nấm bệnh, tơi xốp, dễ thoát nước, thông thoáng Giá thể tốt nhất được làm chủ yếu bằng trấu hun, vỏ trấu, than củi, củi khô, gạch hoặc đá, ống kim loại hình trụ đường kính 10 - 12cm, cao 0,7 - 1m

- Dùng gạch hoặc đá để dựng ống hình trụ, cao so với mặt đất 15cm

- Xếp củi xung quanh và đốt cho than củi cháy

- Rắc vỏ trấu xung quanh cho cháy từ từ Khi lớp trấu đầu đã cháy hết thì tiếp tục bổ sung các lớp trấu mới cho đến khi đống trấu hun cao đến miệng ống trụ kim loại

- Quá trình hun khoảng 10 phút đảo 1 lần cho trấu cháy hết, đảo đều 3 -

5 lần là được

- Khi hun xong tãi mỏng đống trấu cho chóng nguội

V.3.2 Chuẩn bị giá thể để trồng cây:

Giá thể (trấu hun) cần được rửa sạch trước khi trồng cây, sau đó cho vào khay, độ dày 7 - 8cm Khay có kích thước 50cm x 40cm chia thành 11 hàng ngang, mỗi hàng trồng 13 cây Dùng que tre để tạo lỗ nhỏ rồi trồng cây với mật độ sau 0,5cm

Trồng xong, dùng bình phun để phun ướt ngay toàn bộ mặt lá, sau đó 15 phút phun 1 lần, công việc này tiến hành liên tục trong 3 ngày

Trang 10

Khi cây ra rễ mới (sau trồng 5 ngày) thình giảm số lần phun nước xuống

còn 5 - 7 lần/ngày

Sau khi trồng 10 ngày có thể cung cấp dinh dưỡng Knop liên tục cho

cây bằng kỹ thuật trồng cây trong dung dịch Môi trường dung dịch Knop có

thành phần như sau:

TT Tên hoá chất Lượng dùng cho 1000 lít dung

dịch trồng Ghi chú

Pha chung

1 Fe chelat 6,3gr FeSO4 + 9,3gr EDTA Pha riêng

Pha chung

pH môi trường 6,2

Ghi chú:

- Lượng trên dùng cho 1000 lít dung dịch trồng

- Chỉ cung cấp dinh dưỡng Knop khi ra cây được 5 - 7 ngày

- Thời gian cây sống ở bồn mạ, cần thường xuyên kiểm tra dung dịch

vào đáy khay là tốt nhất)

V.3.3 Thời vụ ra cây:

Nhiệt độ và ẩm độ là 2 yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến cây Vì vậy, ra

cây in vitro từ 15 tháng trở đi sẽ đảm bảo thành công vì lúc này nhiệt độ dưới

250C, ẩm độ dưới 82%

Tuy nhiên, giữa mùa đông cũng có ngày nhiệt độ lên cao, ảnh hưởng

đến cây in vitro trong bồn mạ Vì vậy cần kết hợp sử dụng máy điều hoà nhiệt

độ bằng nước trong những ngày có nhiệt độ và ẩm độ vượt ngưỡng giới hạn

của cây in vitro sẽ chủ động bảo đảm thành công trong những điều kiện diễn

biến phức tạo của thời tiết

Trang 11

V.3.4 Khai thác bồn mạ:

ở những vùng mát mẻ, có 12 giờ chiếu sáng/ngày như Đà Lạt có khả năng nhận cây nuôi cấy mô ở trong bồn mạ bằng cắt ngọn liên tục nhiều lần

để giảm giá thành sản phẩm Tuy nhiên, ở các tỉnh phía Bắc, khoai tây được trồng trong vụ Đông nhiệt độ thấp và ngày ngắn nên việc cắt ngọn nhiều lần khó đảm bảo những điều kiện tối ưu Để khai thác bồn mạ hợp lý cần thực hiện

- Xác định thời gian và số lần cắt ngọn:

+ Sau khi trồng ở bồn mạ 15 ngày, cây có 5 lá trở lên có thể tiến hành cắt ngọn

+ Mỗi ngọn cắt phải có 2 lá hoàn chỉnh và phần gốc còn lại của cây phải

có 2 đốt và 2 lá hoàn chỉnh Dùng dao lam đã khử trùng (nhúng vào cồn và hơ lên ngọn lửa đèn cồn) để cắt ngọn Sau mỗi lần cắt 1 lần khử trùng dao lam

+ Sau cắt lần 1 khoảng 15 ngày có thể cắt ngọn 2 lần, sau 15 ngày nữa thì cắt lần 3

+ Chỉ nên cắt ngọn 3 lần

- Giá thể giâm ngọn cắt:

Giá thể thích hợp nhất là trấu hun trộn đều với mùn theo tỷ lệ 1: 1 Sau

đó phun nước đủ ẩm 75% để giâm ngọn cắt

Cần giữ ẩm cho bộ lá trong 5 ngày kể từ giâm ngọn bằng cách dùng bình phun để phun mù bên trên không gian mặt giá thể, không được phun vào giá thể

- Xác định tuổi cây để cắt ngọn:

+ Không cắt ngọn quá muộn khi cây đã có lá kép, như vậy dễ hình thành củ ngay sau khi giâm ngọn cắt

+ Chỉ cắt ngọn khi cây có lá đơn

- Tăng số ngọn trồng trực tiếp cây in vitro ra đất sau khi cắt ngọn:

Khi cây ở bồn mạ được 2 tuần tuổi có thể trồng trực tiếp trong nhà màn cách ly với mật độ 20 cây/m2 Trước khi trồng phải phun ẩm 75% cho giá thể

và phải dùng lưới đen che nắng 1 tuần Khi cây được 20 - 25 ngày sau trồng

có thể khai thác ngọn như đã trình bày trên đây

Trang 12

VI Sản xuất củ nhỏ giống khoai tây:

Việc nhân nhanh giống khoai tây sạch bệnh bằng phương pháp nuôi cấy mô đã sản xuất ra những củ siêu nhỏ (còn gọi là siêu bi) Những củ giống này

được tiếp tục nhân giống trong các nhà màn cách ly côn trùng để sản xuất củ nhỏ (còn gọi là củ mini) để làm giống thương phẩm khoai tây theo quy trình sản xuất củ nhỏ và củ giống thương phẩm

Ngày đăng: 05/04/2015, 17:49

TỪ KHÓA LIÊN QUAN

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w