Nghiên cứu tạo cây đậu xanh chuyển gen có khả năng kháng mọt

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HOÀNG THỊ THAO NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ĐẬU XANH CHUYỂN GEN CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – 5/ 2017 ii iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án công trình nghiên cứu thực hướng dẫn GS.TS Chu Hoàng Mậu PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh Các số liệu, kết luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học công nghệ, phần lại chưa công bố công trình khác Mọi trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Thái Nguyên, tháng năm 2017 Tác giả luận án Hoàng Thị Thao iv LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Chu Hoàng Mậu, PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh tận tình hướng dẫn bảo suốt trình nghiên cứu hoàn thành đề tài luận án Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn cán nghiên cứu Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện tốt để hoàn thành thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài luận án Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Sinh học đại & Giáo dục sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi có góp ý sâu sắc cho thời gian học tập, thực luận án Tôi xin cảm ơn thầy cô cán Khoa Sinh học, cán Bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành khoá học Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang, chân thành cảm ơn đồng nghiệp Khoa Nông học - Trường Đại học Nông Lâm Bắc Giang tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ trình học tập công tác Tôi biết ơn người thân gia đình, bạn bè động viên, khích lệ chia sẻ khó khăn suốt trình học tập nghiên cứu Thái Nguyên, ngày tháng năm 2017 TÁC GIẢ Hoàng Thị Thao v MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC .v DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Những đóng góp luận án Ý nghĩa khoa học thực tiễn .4 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU XANH, MỌT HẠI ĐẬU XANH VÀ SỰ THIỆT HẠI DO MỌT GÂY RA CHO ĐẬU XANH 1.1.1 Cây đậu xanh 1.1.2 Mọt đậu xanh ảnh hưởng mọt đến bảo quản hạt đậu xanh .8 1.1.3 Đánh giá khả kháng mọt đậu xanh .13 1.2 DEFENSIN THỰC VẬT 14 1.2.1 Các nhóm defensin thực vật .14 1.2.2 Cấu trúc defensin thực vật .16 1.2.3 Hoạt động ức chế defensin thực vật 19 1.2.4 Một số nghiên cứu biểu gen defensin thực vật 23 1.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ BIỂU HIỆN GEN DEFENSIN THỰC VẬT Ở MỘT SỐ LOÀI ĐẬU THUỘC CHI VIGNA 26 1.3.1 Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen số loài đậu thuộc chi Vigna .26 1.3.2 Hệ thống tái sinh in vitro tạo đậu xanh chuyển gen 30 vi 1.3.3 Một số thành tựu chuyển gen defensin thực vật .32 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 35 2.1.1 Vật liệu thực vật 35 2.1.2 Các chủng vi khuẩn loại vector 36 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .36 2.2.1 Hóa chất .36 2.2.2 Các loại thiết bị máy móc 36 2.2.3 Địa điểm nghiên cứu hoàn thành luận án 37 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.3.1 Phương pháp đánh giá khả kháng mọt giống đậu xanh nghiên cứu 37 2.3.2 Phương pháp phân lập, tách dòng xác định trình tự nucleotide 39 2.3.3 Thiết kế vector chuyển gen 45 2.3.4 Phương pháp tạo chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens 48 2.3.5 Nhóm phương pháp phân tích chuyển gen 53 2.3.6 Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu 56 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56 3.1 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT VÀ PHÂN LẬP GEN VrPDF1 CỦA CÂY ĐẬU XANH .57 3.1.1 Khả kháng mọt giống đậu xanh nghiên cứu 57 3.1.2 Khuế ch đa ̣i và tách dòng gen VrPDF1 từ giố ng đậu xanh Tằ m TH và ĐX22 61 3.1.3 Đă ̣c điể m của gen VrPDF1 phân lâ ̣p từ hai giố ng đâ ̣u xanh Tằm TH ĐX22 62 3.1.4 Thảo luận cấu trúc protein defensin 67 3.1.5 Sự đa dạng về trình tự nucleotide vùng mã hoá của gen VrPDF1 đậu xanh .68 3.2 THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN VrPDF1 VÀ PHÂN TÍCH HOẠT ĐỘNG CỦA VECTOR CHUYỂN GEN TRÊN CÂY THUỐC LÁ 71 3.2.1 Thiết kế vector biểu hạt thực vật mang gen VrPDF1 kỹ thuật Gateway 71 vii 3.2.2 Tạo thuốc chuyển gen in vitro mang gen VrPDF1 74 3.2.3 Kết phân tích có mặt gen chuyển VrPDF1 dòng thuố c lá chuyển gen kỹ thuật PCR Southern blot 77 3.2.4 Phân tích biểu protein VrPDF1 tái tổ hợp thuốc chuyển gen ở thế ̣ T1 .79 3.3 TẠO CÂY ĐẬU XANH CHUYỂN GEN VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP VrPDF1 Ở GIỐNG ĐẬU XANH ĐX22 .84 3.3.1 Chuyển cấu trúc pBetaPhaso-VrPDF1 tạo đậu xanh chuyển gen 84 3.3.2 Xác định có mặt hợp gen chuyển VrPDF1 hệ gen đậu xanh chuyển gen 87 3.3.3 Phân tích biểu gen chuyển VrPDF1 dòng đậu xanh chuyển gen T1 90 3.3.4 Kiểm tra hoạt động ức chế -amylase từ ấu trùng mọt protein tái tổ hợp rVrPDF1 hệ T1 92 3.3.5 Thảo luận kết tăng cường biểu protein VrPDF1 đậu xanh chuyển gen 95 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 100 Kết luận 100 Đề nghị .100 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 101 TÀI LIỆU THAM KHẢO 102 v DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT µg Microgam AS Acetylseringone BAP Benzylaminopurine bp Base pair cs Cặp bazơ nitơ Cộng CCM Cocultivation medium Môi trường đồng nuôi cấy cDNA Complementary DNA DNA bổ sung CTAB Hexadecyltrimethyl ammonium bromide Cys Cysteine DEPC Diethyl pyrocarbonate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate E coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Xét nghiệm ELISA GM Germination Medium Môi trường nảy mầm Gus β-Glucuronidase HRP Horseradish Peroxidase IAA Indole Acetic acid IPTG Isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside Kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria Bertani Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi khuẩn MS Murashige Skoog, 1962 Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô thực vật vi mRNA Messenger ribonucleic acid NAA Naphthaleneacetic acid NptII Neomycyn phosphatranferaseII Gen kháng kanamycine OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase PDF1 Plant defensin type Gen defensin đậu xanh RNA Ribonucleic acid RM Rooting medium Môi trường tạo rễ RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược rVrPDF1 Recombinant VrPDF1 protein Protein defensin tái tổ hợp VrPDF1 ScFv Single-chain variable fragment SDS Sodium dodecyl sulfate SEM Shoot Elongation Medium Môi trường kéo dài chồi SIM Shoot Induction Medium Môi trường tạo đa chồi TAE Tris Acetate EDTA Taq DNA polymerase Thermus aquaticus DNA polymerase T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA chuyển vào thực vật Ti-plasmid Tumor inducing – plasmid Plasmid gây khối u T0, T1 Các hệ chuyển gen T0 Cây chuyển gen tái sinh từ chồi ống nghiệm T1 Hạt chuyển gen T0 nảy mầm thành T1 TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine v/p Vòng /phút WT Wild type X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-Dgalacto-pyranoside Kiểu dại vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Một số thực vật chuyển gen defensin 33 Bảng 2.1 Nguồn gốc giống đậu xanh nghiên cứu 35 Bảng 2.2 Trình tự nucleotide cặp mồi đặc hiệu sử dụng PCR 39 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 41 Bảng 2.4 Các thành phần bổ sung phản ứng tổng hợp cDNA 41 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR nhân gen VrPDF1 42 Bảng 2.6 Chu trình nhiệt phản ứng nhân gen VrPDF1 42 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng ghép nối gen VrPDF1 vào vector tách dòng pBT 43 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng ghép nối gen VrPDF1 với vector pDON201SLHEP-HA 46 Bảng 2.9 Thành phần phản ứng LR 47 Bảng 2.10 Thành phần môi trường nuôi cấy in vitro đậu xanh 51 Bảng 3.1 Kết đánh giá khả kháng mọt giống đậu xanh qua thời gian nhiễm mọt 59 Bảng 3.2 Các vị trí nucleotide sai khác ba trình tự nucleotide gen VrPDF1 64 Bảng 3.3 Các vị trí amino acid sai khác ba trình tự amino acid suy diễn gen VrPDF1 65 Bảng 3.4 Thống kê số trình tự gen PDF1 sử dụng phân tích đa dạng di truyền 69 Bảng 3.5 Hê ̣ số tương đồ ng và ̣ số phân ly của các giố ng đâ ̣u xanh dựa triǹ h tự nucleotide của gen VrPDF1 69 Bảng 3.6 Hê ̣ số tương đồ ng và ̣ số phân ly của các giố ng đâ ̣u xanh dựa triǹ h tự amino acid suy diễn của gen VrPDF1 70 Bảng 3.7 Kết biến nạp cấu trúc pBetaPhaso -VrPDF1 vào mô thuốc 76 Bảng 3.8 Hoạt độ -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh mẫu ủ với dịch chiết protein từ hạt dòng thuốc chuyển gen từ hạt không chuyển gen 82 Bảng 3.9 Kết biến nạp cấu trúc pBetaPhaso-VrPDF1 vào giống đậu xanh ĐX22 86 Bảng 3.10 Hoạt độ -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh mẫu ủ với dịch chiết protein từ hạt dòng đậu xanh chuyển gen T1 từ hạt không chuyển gen 93 105 Tiếng Anh 28 Adesoye A., Machuka J., Togun A (2008), “CRY 1AB transgenic cowpea obtained by nodal electro-poration”, Afr J Biotech 7(18), pp 3200-3210 29 Ahmad M., Mohammed F., Maqbool K., Azamand A., Iqbal S (2003), “Genetic variability and traits correlation in wheat”, Sarhad J Agric., 19(3), pp 347-351 30 Allen A., Snyder A K., Preuss M., Nielsen E E., Shah D M., Smith T J (2008), "Plant defensins and virally encoded fungal toxin KP4 inhibit plant root growth", Planta, 227(2), pp 331-339 31 Amien S., Kliwer I., Marton M L., Debener T., Geiger D., Becker D., Dresselhaus T., (2010), “Defensin-like ZmES4 medi-ates pollen tube burst in maize via opening of the potassium channel KZM1”, PLoS Biology, (6), pp 1000388 32 Akella V., Lurquin P F (1993), “Expression in cowpea seedlings of chimeric transgenes after electroporation into seed-derived embryos”, Plant Cell Rep, 12, pp 110-117 33 Bui C H., Sidik M., Rejesus B M., Garcia R P., Champ B R., Bengston M., Dharmaputa O S., Halid H., (1997) “Effect of gamma radiation and bag packaging materials on the development of Callosobruchus chinensis (L.) (Coleoptera: Bruchidae) in grams (Vigna radiata (L.) Wilczek) Proceedings of the symposium on pest management for stored food and feed, held at Bogor, Indonesia, 5-7 September 1995” BIOTROP-Special-Publication 59, pp 225-230 34 Borikar P S., Pawar V M., (1996), “Life fecundity tables for pulse beetle, Callosobruchus chinensis (Linnaeus) infesting mung bean, Vigna radiata (L.) Wilczek”, Journal of Entomological Research, 20(1), pp 59-65 35 Beer A., Viver M A (2008), “Vv-AMP1: A ripening induced peptide from Vitis vinifera shows strong antifungal activity”, BMC Plant Biology, doi:10.1186/1471-2229-8-75 106 36 Berrocal-Lobo M, Segura A., Moreno M, Lopez G., Garci´a-Olmedo F., Molina A (2002), “Snakin-2, an antimicrobial peptide from potato whose gene is locally induced by wounding and responds to pathogen infection”, Plant Physiology, 128, pp 951-961 37 Bloch C J., Richardson M (1991), “A new family of small (5kDa) protein inhibitors of insect α-amylases from seeds of sorghum (Sorghum bicolor (L) Moench) have sequence homologies with wheat g-purothionins”, FEBS, 279(1), pp 101-104 38 Buscaglia C A., Campo V A., Frasch A C C., Noia J M D (2006), “Trypanosoma cruzi surface mucins: host-dependent coat diversity”, Nat Rev Microbiol, 4(3), pp 229-236 39 CAB International (2007), Callosobruchus Chinensis L., Crop Protection Compendium, Wallingford, Oxon, UK 40 Carvalho A O., Gomes V M., (2011), “Plant defensins and defensin-like peptides - biological activities and biotechnological applications”, Current Pharmaceutical Design, 17(38), pp 4270-4293 41 Carvalho A O., Gomesa V M., (2009), “Plant defensins-Prospects for the biological functions and biotechnological properties”, Peptides, 30(5), pp 1007-1020 42 Chavan P D., Singh Y., Singh S P., (1997), “Oviposi-tional preference of Callosobruchus chinensis for cowpea lines”, Indian J Ent, 59, pp 295-303 43 Chowrira G M., Akella V., Lurquin P F., (1995), “Electroporation-mediated gene transfer into intact nodal meristems in planta”, Mol Biotech 3, pp 17-23 44 Colilla F J., Rocher A., Mendez E (1990), "γ-Purothionins: amino acid sequence of two polypeptides of a new family of thionins from wheat endosperm", FEBS Lett, 270(1-2), pp 191-194 45 Chen G H., Hsu M P., Tan C H., Sung H Y., Kuo C G., Fan M J., Chen H M., Chen S., Chen C.S (2005), “Cloning and characterization of a plant 107 defensin VaD1 from azuki bean”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53(4), pp 982-988 46 Chen J J., Chen G H., Hsu H C., Li S S., Chen C S (2004), “Cloning and functional expression of a mungbean defensin VrD1 in Pichia pastoris”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52(8), pp 2256-2261 47 Chen K C., Lin C Y., Kuan C C., Sung H Y., Chen C S (2002) “A novel defensin encoded by a mungbean cDNA exhibits insecticidal activity against bruchid”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50(25), pp.7258-7263 48 Chyi Y S., Jorgense R A., Goldstein D., Tanksley S D., Figueroa L F (1986), “Locations and stability of Agrobacterim-mediated T-DNA insertions in the Lycopersicon genome”, Mol Gen Genet., 204(1), pp 64-69 49 Dick K M., Credland P.F., (1984), “Egg production and development of three strains of Callosobruchus maculatus (F.) (Coleoptera: Bruchidae)”, J Stored Prod Res,20(4), pp 221 - 227 50 Dongre T K., Pawar S E., Thakre R.G., Harwalker M R., (1996), “Identification of resistance sources to cowpea weevil (Callosobruchus maculartus (F.)) in Vigna sp and inheritance of their resistance in black gram (Vigna mungo Var mungo)”, J Stored Prod Res, 32(3), pp 201-204 51 Duraimurugan P., Aditya P., Singh S K., Sanjeev G., (2014), “Evaluation of Screening Methods for Bruchid Beetle (Callosobruchus chinensis) resistance in Greengram (Vigna radiata) and Blackgram (Vigna mungo) genotypes and influence of seed physical characteristics on its infestation”, VEGETOS, 27(1), pp 60-67 52 Dos S.I.S., Carvalho A O., de Souza-Filho G A., Nascimento V.V., Machado O L., Gomes V M., (2010), “Purification of a defensin isolated from Vigna unguiculata seeds, its functional expression in Escherichia coli, and assessment of its insect alpha-amylase inhibitory activity”, Protein Expr Purif, 71(1), pp 8-15 108 53 Elfstrand M., Fossdal C.G., Swedjemark G., Clapham D., Olsson O., Sitbon F., Sharma P., Lönneborg A., Arnold S (2001), "Identification of candidate genes for use in molecular breeding - A case study with the Norway spruce defensin-like gene, spi1", Silvae Genet, 50, pp 75-81 54 Emma W G., Jose C., Ade´.P.K´., Lamine M., Simeon O K (2012), “Structural characterization of plant defensin protein superfamily”, Mol Biol Rep, 39(4), pp 4461-4469 55 Evans D E., (1987), “The survival of immature grain beetles at low temperatures”, J Stored Prod Res 23 (2), pp 79-83 56 Farid A S., (2006), Integrated management of pulse beetle, Callosobruchus chinensis L (Coleoptera; Bruchidae) attacking stored Chickpea, the thesis submitted for doctor of phylosophy in entomology, 17, pp 192 57 Finkina E I., Shramova E I., Tagaev A A., Ovchinnikova T V (2008), “A novel defensin from the lentil Lens culinaris seeds”, Biochem Biophys Res Commun, 371 (4), pp 860-865 58 Ganz T (2004), “Defensins: antimicrobial peptides of vertebrates”, CR Biol, 327(6), pp 539-549 59 Gao A G., Hakimi S M., Mittanck C A., Wu Y., Woerner B M., Stark D M., Shah D M., Liang J., Rommens C M (2000), "Fungal pathogen protection in potato by expression of a plant defensin peptide", Nat Biotechnol, 18(12), pp 1307-1310 60 Gujar G T., Yadav, T D (1978), “Feeding of Callosobruchus maculatus F (Colepotera: Bruchidae) reared on different food and temperature”, Journal of Stored Products Research, 22(2), pp 71-75 61 Gwinner J., Harnisch R., Muck O (1996), Manual of the prevention of postharvest grain losses Deutsche Gesellschaft für Technische Zusammenarbeit (GTZ) GmbH pp 338 109 62 Hanks J N., Snyder A K., Graham M A., Shah R K., Blaylock L A., Harrison M J., Shah D M (2005), “Defensin gene family in Medicago truncatula: structure, expression and induction by signal molecules”, Plant Mol Biol, 58(3), pp 385-399 63 Howe R W., Currie J E (1964), “Some laboratory observations on the rates of development, mortality and oviposition of several species of Bruchidae breeding in stored pulses”, Bull Entomol Res., 55(3), pp 437-477 64 Ignacimuthu S., Franklin G (1998), “Regeneration of plantlets from cotyledon and embryonal axis explants of Vigna mungo L Hepper”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture., 55(1), pp 75-78 65 Ikea J., Ingelbrecht I., Uwaifo A., Thottapilly G (2003), “Stable gene transformation in cowpea (Vigna unguiculata L Walp) using particle gun method”, Afr J Biotechnol., 2(8), pp 211-218 66 Ivo N I., Nascimento C P., Vieira L S., Campos F A P., Arago F J L (2008), “Biolistic mediated genetic transformation of cowpea (Vigna unguiculata L.) and stable inheritance of transgenes”, Plant Cell Rep, 27(9), pp 14751483, doi: 10.1007/s00299-008-0573-2 67 Jaiwal P K., Kumari R., Ignacimuthu S., Potrykus I., Sautter C (2001) “Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer in mungbean (Vigna radiata L Wilczeck) -a recalcitrant grain legume”, Plant Sci., 161(2), pp 239-247 68 Jayanti Sen, Spra Guha Mukherjee (1998), “In vitro intoduction of multiple shoots and plant regeneration in Vigna”, In vitro Cell.Dev Biol plant, 34(4), pp 276-280 69 Jha S., Tank H.G., Prasad B.D., Chattoo B.B., (2009), "Expression of DmAMP1 in rice confers resistance to Magnaporthe oryzae and Rhizoctonia solani", Transgenic Res, 18(1), pp 59-69 70 Kanzaki H., Nirasawa S., Saitoh H., Ito M., Nishihara M., Terauchi R., Nakumura I (2002), "Overexpression of the wasabi defensin gene confers 110 enhanced resistance to blast fungus (Magnaporthe grisea) in transgenic rice", TAG Theor Appl Genet Theor Angew Genet, 105(6-7), pp 809-814 71 Karimi M., Inzé D., Depicker A (2002), “Gateway vectors for Agrobacterium - mediated plant transformation”, Trends Plant Sci., 7(5), pp 193-195 72 Kaviraj C.P., G Kiran, R.B Venugopan, P.B.Kavi Kishor, Srinath Rao (2006), “Somatic embryogenesis and plant regeneration from cotyredorary explants of green gram (Vigna radiata (L.) Wilczek)- A recalcitrant grain legume” In vitro Cell.Der Biol plant 42, pp 134 -138 73 Koichi fujii (1967), “Studies on interspecies competition between the azuki bean weevil,Callosobruchus chinensis, and the southern cowpea weevil,C maculatus II Competition under different environmental conditions”, Researches on Population Ecology, 9(2), pp 192-200 74 Koike M., Okamoto T., Tsuda S., Imai R (2002), "A novel plant defensin-like gene of winter wheat is specifically induced during cold acclimation", Biochem Biophys Res Commun, 298(1), pp 46-53 75 Kononowicz A K., Narasimhan M L., Reuveni M., Moclatchey G., Bressan P H., Zhang Y., Larosa P C., Murdock L L., Chrispeels M J., Bres-san R A., Hasegawa P M (1993),” Genetic trans-formation of cowpea (Vigna unguiculata) using microprojectile bombardment and Agrobacterium tumefaciens infection”, Plant Physiol 102, suppl Abstract no 945 76 Kononowicz A K., Cheah K T., Narsimha M L., Murdock L L., Shade R F., Chrispeels M J., Fillipone E., Monti L M., Bressan, R A., Hasegawa P M (1997), “Developing a transforma-tion system for cowpea (Vigna unguiculata L Walp) in Advances in Cowpea Research”, pp 361-371 77 Laemmli U K., (1970), “Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4”, Naturem., 227, pp 680-685 111 78 Lai F M., DeLong C., Mei K., Wignes T., Fobert P.R (2002), "Analysis of the DRR230 family of pea defensins: gene expression pattern and evidence of broad host-range antifungal activity", Plant Sci, 163(4), pp 855-864 79 Lan Y C., Horng S., (1999), “Effects of male interference on oviposition behavior of the adzuki bean weevil, Callosobruchus chinensis (L.), (Coleoptera: Bruchidae)” Chinese Journal of Entomology, 19(3), pp 249-256 80 Lay F T., Anderson M A (2005), “Defensin-Components of the innate Immmune System in Plants” Current protein and peptide science, (6), pp 85-101 81 Lin K F., Lee T R., Tsai P H., Hsu M P., Chen C S., Lyu P C (2007), “Structure-based protein engineering for alpha-amylase inhibitory activity of plant defensing”, Protein, 68, pp 530-540 82 Liu M S., Kuo T C Y., Ko C.Y., Wu D C., Li K Y., Lin W J., Lin C P., Wang Y.W., Schafleitner R., Lo H.F., Chen C Y., Chen L.F.O (2016), “Genomic and transcriptomic comparison of nucleotide variations for insights into bruchid resistance of mungbean (Vigna radiata [L.] R Wilczek)”, BMC Plant Biology, DOI 10.1186/s12870-016-0736 83 Liu Y J., Cheng C S., Lai S M., Hsu M P., Chen C S., Lyu P C (2006), “Solution structure of the plant defensin VrD1 from mung bean and its possible role in insecticidal activity against bruchids.”, Proteins, 63(4), pp 777-786 84 Mahalakshmi S L., Leela T., Manoj K S (2006), “Enhanced genetic efficiency of mungbean by use of primary leaf explants”, Curr Sci 91(1), pp 93-98 85 Mahroof R., Subramanyam B., Eustace D (2003a), “Temperature and relative humidity profiles during heat treatment of mills and its efficacy against Tribolium castaneum (Herbst) life stages”, J Stored Prod Res, 39, pp 555-569 86 Mahroof R., Bh Subramanyam J E., Throne A., Menon (2003b), “Timemortality relationships for Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae) 112 life stages exposed to elevated temperatures”, J Econ Entomol , 96 (4), pp 1345-1351 87 Manners J M., Penninckx I.A.M.A., Vermaere K., Kazan K., Brown R L., Morgan A., (1998), “The promoter of the plant defensin gene PDF1.2 from Arabidopsis is systemically activated by fungal pathogens and responds to methyl jasmo- nate but not to salicylic acid”, Plant Mol Biol, 38(6), pp 1071-1080 88 Melo F R., Rigden D J., Franco O L., Mello L V., Ary M B., Grossi de Sa´ M F (2002), “Inhibition of trypsin by cowpea thionin: characterization, molecular model-ing, and docking”, Proteins, 48(2), pp 311-319 89 Mendez E., Moreno A., Colilla F., Pelaez F., Limas G G., Mendez R., Soriano F., Salinas M (1990), "Primary structure and inhibition of protein synthesis in eukaryotic cell-free system of a novel thionin, γ-hordothionin, from barley endosperm", Eur J Biochem, 194(2), pp 533-539 90 Meyer B., Houlne´C., Pozueta-Romero´J, Schantz M L., Schantz R (1996), “Fruit-specific expression of a defensin-type gene family in bell pepper”, Plant Physiol, 11(2), pp 615-622 91 Mirouze M., Sels J., Richard O., Czernic P., Loubet S., Jacquier A (2006), “A putative novel role for plant defensins: a defensin from the zinc hyperaccumulating plant, Arabidopsis halleri, confers zinc tolerance”, Plant J, 47 (3), pp 329-342 92 Monk B C., Harding D R K (2005), “Peptide motifs for cell-surface intervention: application to anti-infective and biopharmaceutical development.”, Biodrugs, 19(4), pp 261-278 93 Muruganantham M., Amutha S., Selvaraj N., Vengadesan G., Ganapathi A (2007), “Efficient Agrobacterium- ediated transformation of Vigna mungo using immature cotyledonary-node explants and phosphinothricin as the selection agent” In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant, 43, pp 550-557 113 94 Murray M G., Thompson W F (1980), “Rapid isolation of high molecular weight plant DNA”, Nucleic Acid Res., 8(19), pp 4321-4325 95 Nahdy M S., Silim S N., Ellis R H., (1999), “Some aspects of pod characteristics predisposing pigeonpea (Cajanus cajan (L.) Millsp.) to infestation by Callosobruchus chinensis (L.)”, Journal of Stored Products Research, 35(4), pp 339-354 96 Nakakita H (1998), “Stored rice and stored product insects In: Rice Inspection Technology Manual” A.C.E Corporation, Tokyo, Japan, pp 49-65 97 Nicole L, Marilyn A (2013), “Plant defensins: Common fold, multiple functions”, fungal biology reviews, 26, pp 121-131 98 Noriha M A., Hamidun B., Norliza T A B., (2014), “Isolation and In Silico Characterization Of Plant Defensin, Ctd1, From The Tropical Forage Legume (Clitoria Ternatea L.), Advances inEnvironmental Biology, 8(4), pp 10091014 99 Oard S., Karki B., (2006), “Mechanism of b-purothionin antimicrobial peptide inhibi-tion by metal ions: molecular dynamics simulation study”, Biophys Chem, 121(1), pp 30-43 100 Olli S., Kirti P B., (2006), “Cloning, characterization and antifungal activity of defensin Tfgd1 from Trigonella foenum-graecum L”, J Biochem Mol Biol, 39 (3), pp 278-283 101 Osborn R W., De Samblanx G W., Thevissen K., Goderis I., Torrekens S., Van L F., (1995), “Isolation and characterisation of plant defensins from seeds of Asteraceae, Fabaceae, Hippocastanaceae and Saxifragaceae”, FEBS Lett, 368 (2), pp 257-262 102 Pal M., Ghosh U., Chandra M., Biswas B B (1991), “Transformation and regeneration of mung-bean (Vigna radiata)”, Indian J Biochem Biophys., 28(5-6), pp 449-455 114 103 Parr M J., Tran B M D., Simmonds M S J., Credland P F (1996), “Oviposition behaviour of the cowpea seed beetle, Callosobruchus maculatus”, Physiological Entomology, 21(2), pp 107-117 104 Park H C., Kang Y H., Chun H J., Koo J C., Cheong Y H., Kim C Y (2002), “Characterization of a stamen-specific cDNA encoding a novel plant defensin in Chinese cabbage’, Plant Mol Biol, 50(1), pp 57-68 105 Pelegrini P B., Lay F.T., Murad A M., Anderson M A., Franco O L., (2008), “Novel insights on the mechanism of action of α-amylase inhibitors from the plant defensin family”, Proteins, 73(3), pp 719-729 106 Penza R., Lurquin P F., Fillipone E (1991), “Gene transfer by cocultivation of mature embryos with Agrobacterium tumefaciens: Application to cowpea (Vigna unguiculata Walp.)”, Jour Plant Physiol., 138(1), pp 39-43 107 Prem R., Ganapathi A., Ramesh V., Anbazhagan, Gengadesan G., Selvaraj N., (2001), “High frequency plant regeneration via somatic embryogenesis in cell suspension cultures of cowpea, vigna unguiculata (L.) walp” In Vitro Cell Dev Biol-Plant, 36(6), pp 475-480 108 Phogat S K., Kathikeyan A S., Veluthambi (1999), “Generation of transformed calli of Vigna radiata by Agrobacterium mediated transformation”, J Plant Biol., 26, pp 77-82 109 Philips T.W (1994), Pheromones of stored products insects current status and future perspectives, In: Highley, E.; Wright, E.J.; Banks, H.J.; Champ, B.R (Eds.), Stored Product Protection, Proceedings of the 6th International Working Conference on Stored-Product Protection, pp 17-23 110 Ramakrishnan K., Gnanam R., Sivakumar P., Manickam A., (2005) “In vitro somatic embryogenesis from cell suspension cultures of cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp)”, Plant Cell Rep, 24(8), pp 449-461 111 Renato A A., Kazumi H., (1999), “Differences in shoot regeneration response from cotyledonary node explants in Asiatic Vigna species support genomic 115 grouping within subgenus Ceratotropis (Piper) Verdc.” Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 58(2), pp 99-110 112 Renato A A., Motoda J., Kazumi H., (2001), “Direct shoot regeneration from cotyledonary nodes as a marker for genomic groupings within the Asiatic Vigna (subgenus Ceratotropis Piper Verdc.) species”, Plant Growth Regulation, 35(1), pp 59-67 113 Rudrabhatla S., Siva C., Madasamy P., Shulu Z., Diaa A., Wissam A A., Stephen G., (2005), “Obpc symposium: Maize 2004 & beyond-plant regeneration, gene discovery, and genetic engineering of plants for crop improvement” In Vitro Cell Dev Biol.-Plant, 41(4), pp 411-423 114 Sambrook J., Russell D W (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press 115 Saini R., Jaiwal P K (2007), “Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of blackgram: an assessment of factors influencing the efficiency of uidA gene transfer”, Biologia Plantarum, 51(1), pp 69-74 116 Sibakwe C B., Donga T., (2015), “Laboratory Assessment of the Levels of Resistance in Some Bean Varieties Infested with Bean Weevils (Acanthoscelides obtectus and Zabrotes subfasciatus)”, International Journal of Plant & Soil Science, 4(2), pp 124-131 117 Singh S., (1997), Ovipositional behaviour and development of three species of bruchids under field condition 118 Singh S., Yadav T D (1996), “Respiration of Callosobruchus maculatus and C chinensis under airtight condition”, Indian Journal of Entomology, 58(4), pp 302-305 119 Sita L., Mahala T., Leela B., Kiran Kumar B., Naresh, Prathibha Devi (2006), “In vitro plant regeneration from the petioles of primary leaves of mungbean (Vigna radiata L.)”, Plant Biotechnology, 23, pp 409-411 116 120 Solis J., Medrano G., Ghislain M., (2007), “Inhibitory effect of a defensin gene from the Andean crop maca (Lepidium meyenii) against Phytophthora infestans”, J Plant Physiol, 164(8), pp 1071-1082 121 Sonia R S., Rana P S., Pawan K Jaiwal (2007), “Agrobacterium tumefaciens mediated transfer of Phaseolusvulgaris-amylase inhibitor-1 gene into mungbean (Vigna radiata (L.)Wilczek) using bar as selectable marker”, Plant Cell Rep, 26(2), pp 187-198 122 Southern E M (1975), “Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis”, J Mol Biol 98(3), pp 503-517 123 Sulehrie M A Q., Golob P., Tran B M D., Farrell G (2003), “The effect of attributes of Vigna spp on the bionomics of Callosobruchus maculatus”, Entomol Exp Appl 106(3), pp 159-168 124 Srivastava V., Vasil V., Vasil I K., (1996), “Molecular characterization of the face of transgenes in transformed wheat (Triticum aestivum L.)”, Theor Appl Genet., 92, pp 1031-1037 125 Stotz H.U., Spence B., Wang Y (2009), "A defensin from tomato with dual function in defense and development", Plant Mol Biol, 71(1-2), pp 1131-143 126 Stotz H.U., Thomson J G., Wang Y (2009), "Plant defensins: defense, development and application", Plant Signal Behav, 4(11), pp 1010-1012 127 Sugiarto H., Yu P L., (2004), “Avian antimicrobial peptides:the defense role of b-defensins”, Biochem Biophys Res Commun, 323(3), pp 721-727 128 Sun H J., Cui M., Ma B., Ezura H., (2006), Functional expression of the tastemodifying protein, miraculin, in transgenic lettuce”, FEBS Lett., 580(2), pp 620-626 129 Suraninpong P., (2002), “Introduction and expression of cholesterol oxidase gene in a bacterium (Escherichia coli M15 (pREP4) and mungbean [Vigna radiata (L.) Wilczek]” PhD Thesis, suranare university of Techonology, ISBN 974-533-213-5, pp: 162 117 130 Thevissen K., Warnecke D C., Francois I E J A., Leipelt M., Heinz E., Ott C (2004), “Defensins from insects and plants interact with fungal glucosylceramides”, J Biol Chem, 279(6), pp 3900-3905 131 Thomma B., Cammue B., Thevissen K (2002), "Plant defensins", Planta, 216(2), pp 193-202 132 Thi Xuan Thuy VI, Hoang Duc LE, Vu Thanh Thanh NGUYEN, Van Son LE, Hoang Mau CHU (2016), “Expression of ZmDEF1 gene and experiment the alpha-amylase inhibitory activity from maize weevils of recombinant defensin”, Turk J Biol Accepted 21.6.2016, Available online: 21.07.2016 133 Tam J P., Lu Y A., Yang J L (2002), “Correlations of cationic charges with salt sensitivity and microbial specificity of cystine-stabilized β-strand antimicrobial pep-tides”, The Journal of Biologycal Chemistry, 277(52), pp 50450-50456 134 Tazeen S., Mirza B (2004), “Factors affecting Agrobacterium tumefaciens mediatedd genetic transfermtion of Vigna radiata (L.) Wilczek”, Pak J Bot., 36(4), pp 887-896 135 Tavares L S., Santos Mde O., Viccini L F., Moreira J S., Miller R N., Franco O.L., (2008), “Biotechnological potential of antimicrobial peptides from flowers”, Peptides, 29(10), pp 51-142 136 Terras F.R., Eggermont K., Kovaleva V., Raikhel N.V., Osborn R.W., Kester A., Rees S.B., Torrekens S, Leuven F.V., Vanderleyden J (1995), "Small cysteine-rich antifungal proteins from radish: their role in host defense.", Plant Cell Online, 7(5), pp 573-588 137 Terras F.R., Schoofs H.M., De Bolle M.F., Van Leuven F., Rees S.B., Vanderleyden J., Cammue B.P., Broekaert W.F (1992), "Analysis of two novel classes of plant antifungal proteins from radish (Raphanus sativus L.) seeds", J Biol Chem, 267(22), pp 15301-15309 118 138 Tomooka N., Lairungeang C., Nakeeraks P., Egawa Y., Thavarasook C., (1992), “Development of Bruchid- Resistant Mungbean Line Using Wild Mungbean Germplasm in Thailand”, Plant Breeding, 109 (1), pp 60-66 139 Topping J F., (1998), “Tobacco transformation” Methods Mol Biol., pp 365-372 140 Topping J F., Wei W., Lindsey K., (1991), “Functional tagging of regulatory elements in plant genome”, Development, 112(4), pp 1009-1019 141 Vander W N L., Lay F.T., Anderson M A (2008), “The plant defensin, NaD1, enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae”, Journal of Agricultural and Food Chemistry , 283(21), pp 14445-14452 142 Veluthambi K., Gupta A K., Sharma A (2003), “The current status of plant transformation tech-nologies”, Curr Sci., 84, pp 368-380 143 Wang Y., Nowak G., Culley D., Hadwiger L.A., Fristensky B (1999), "Constitutive expression of pea defense gene DRR206 confers resistance to blackleg (Leptosphaeria maculans) disease in transgenic canola (Brassica napus)", Mol Plant Microbe Interact, 12(5), pp 410-418 144 Wijaya R., Neumann G M., Condron R., Hughes A B., Poly G M (2000), “Defense proteins from seed of Cassia fistula include a lipid transfer protein homologue and a protease inhibitory plant defensin”, Plant Science, 159, pp 243-55 145 Wisniewski M E., Bassett C L., Artlip T S., Webb R P., Janisiewicz W J., Norelli J L (2003), “Characterization of a defensin in bark and fruit tissues of peach and antimicrobial activity of a recombinant defensin in the yeast, Pichia pastoris”, Physiol Plant,119(4), pp 563-572 146 Wong J H., Zhang X Q., Wang H X., Ng T B (2006), “A mitogenic defensin from white cloud beans (Phaseolus vulgaris)” Peptides, 27 (9), pp 2075-2081 119 147 Wong J H., Ng T B (2005), “Sesquin, a potent defensin-like antimicrobial peptide from ground beans with inhibitory activities toward tumor cells and HIV-1 reverse transcriptase”, Peptides, 26 (7), pp 1120-1126 148 Ye F., Signer E R (1996), “RIGS (repeat-induced gene silencing) in Arabidopsis is transcriptional and alters chromatin configuration”, Proc Natl Acad Sci USA, 93, pp 10881-10886 149 Yin Z., Malepszy S (2003), “The transgenes are expressed with different level in plants”, Biotechnologia, (61), pp 236-260 150 Yongxue D., Shiyuan W., Longshu L (1998b), “Temperature effect on development and reproduction of Chinese cowpea weevil, Callosobruchus chinensis L (Coleoptera: Bruchidae)”, Proceedings of the 7th International Working Conference on Stored-product Protection, I, pp 125-127 151 Zainal Z., Marouf E., Ismail I., Fei C.K (2009), "Expression of the Capsicuum annum (chili) defensin gene in transgenic tomatoes confers enhanced resistance to fungal pathogens", Am J Plant Physiol, 4(2), pp 70-79 152 Zhao Q., Chae Y K., Markley J L (2002), “NMR solution structure of ATTp, an Arabidopsis thaliana trypsin inhibitor”, Biochemistry, 41 (41), pp 12284-12296 153 Zhu Y.J., Agbayani R., Moore P.H (2007), "Ectopic expression of Dahlia merckii defensin DmAMP1 improves papaya resistance to Phytophthora palmivora by reducing pathogen vigor",, Planta, 226(1), pp 87-97 Trang Web 154 http://www.avrdc org/LC/Mungbean/bruchids.html) 155 http://www.agri.ruh.ac.lk/biology/staff/academic 156 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ AB020613 157 Callosobruchus chinensis L http://www.scient.dost.gov.ph 158 Callosobruchus chinensis L http://www.journal database.org/artieles ... Bittle-98 có khả kháng mọt cao [158] 1.1.3 Đánh giá khả kháng mọt đậu xanh Có nhiều phương pháp để đánh giá khả kháng mọt đục hạt đậu xanh Liu cs năm 2016 nghiên cứu khả kháng mọt đục hạt đậu xanh phương... án là: Nghiên cứu tạo đậu xanh chuyển gen có khả kháng mọt Mục tiêu nghiên cứu (i) Phân tích đươ ̣c đặc điểm gen defensin (VrPDF1) phân lập từ giống đậu xanh Viê ̣t Nam có khả kháng mọt khác... GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT VÀ PHÂN LẬP GEN VrPDF1 CỦA CÂY ĐẬU XANH .57 3.1.1 Khả kháng mọt giống đậu xanh nghiên cứu 57 3.1.2 Khuế ch đa ̣i và tách dòng gen VrPDF1 từ giố ng đậu xanh