Phương pháp thu nhận Enzyme Protease

LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chếphẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong cáclĩnh vực như: chế biến thực

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chếphẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong cáclĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng nămlượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trịtrên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau [4]

Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loạienzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy Khoảng 75% chế phẩm làenzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên

Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngànhsản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổsung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩmtrong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…

Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấpprotease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiềuhơn Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc

sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất Các chế phẩm thu được sau quá trìnhnuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì proteinchỉ chiếm 20-30% [6] Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinhchế enzyme nhằm thu được chế phẩm có độ tinh khiết cao rất cần thiết Để tách vàtinh chế enzyme nói riêng và protein nói chung thường có một loạt phương pháphóa-lý và hóa học khác nhau Có thể chia làm ba nhóm phương pháp sau:

- Phương pháp kết tủa

- Phương pháp sắc ký

- Phương pháp phân tách hê ê hai pha nước

Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật Tuy nhiên nguồn enzyme

ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc

và xạ khuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sảnxuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống

Trang: 2

Chương 1:

TỔNG QUAN VỀ ENZYM PROTEASE

1.1 Tình hình nghiên cứu enzyme.

1.1.1 Vấn đề nghiên cứu enzyme ở nước ta

Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống đều cần phải có vai tròxúc tác của enzyme - chất xúc tác sinh học Chính vì vậy, các nghiên cứu vềenzyme đã thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực nghiệm

và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác Các nghiên cứu nhằm theohướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứucấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năngứng dụng enzyme trong thực tế Nghiên cứu về công nghệ enzyme đã được tiếnhành bởi nhiều tác giả như sử dụng phủ tạng của lò mổ để sản xuất pancrease,pepsin, trypsin sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase Đã có những thử nghiệmcông nghệ như sản xuất amino acid từ nhộng tằm bằng protease, bột protein thịtbằng bromelain từ đọt dứa, lên men rượu bằng enzyme cố định trên cột Cũng đã

có những nghiên cứu sử dụng peroxydase, cyt-P450 trong chế tạo biosensor vàthuốc phát hiện chất độc Trong lĩnh vực y dược, việc nghiên cứu sâu về cơ chếtác dụng của một số enzyme nhằm mục đích kiến tạo nên một số thuốc dùng điềutrị một số bệnh đặc biệt là tạo ra một số chế phẩm thuốc chống suy dinh dưỡng ởtrẻ em, đồng thời đã tiến hành sản xuất đại trà Đây là một đóng góp rất thiết thực

và kịp thời trong việc phòng chống suy dinh dưỡng ở nước ta

1.1.2 Công nghệ sản xuất enzyme trên thế giới.

Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệptrên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân(75%), và protease là mô êt trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong côngnghiệp (60%) [4]

1.2 Tổng quan về enzyme Protease.

1.2.1 Giới thiệu chung.

Nhóm enzyme protease (peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phânliên kết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩmcuối cùng là các axit amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phânliên kết este và vận chuyển axit amin

ﾧ

Hình 1.1 Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein.

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức

độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng

từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật(gan, dạ dày bê ) So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có

Trang: 4

những đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rấtphức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hìnhdạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.

Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vậtthường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng

Exopeptidase

(E.C 3.4.11-17)

Endopeptidase (E.C 3.4.21-99)

Hình 1.3 Sơ đồ phân loại protease

Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase

* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phânchia thành hai loại:

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do củachuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc mộttripeptide

+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗipolypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốnnhóm:

+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serinetrong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúctác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin.Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin,elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisinCarlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùngkiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạtđộng Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin,một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng Các cystein proteinasethường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

Trang: 6

+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin,renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động

và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở

vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinasethường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng củaEDTA

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

- Protease acid: pH 2-4

- Protease trung tính: pH 7-8

- Protease kiềm: pH 9-11

đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepxin) thì khả năng đông

tụ sữa kém đi

Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như

ở các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus

2.2 Nguồn thực vật:

Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin Papain thuđược từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả,chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant) Các enzyme này được sử dụng để chống lạihiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein.Những ứng dụng khác của protease thực vật này là trong công nghệ làm mềm thịt

và trong mục tiêu tiêu hoá Ficin thu được từ nhựa cây cọ (Ficus carica) Enzymeđược sử dụng thuỷ phân protein tự nhiên

Trang: 8

Hình 2.1 Nguồn thu enzyme

Protease từ thực vật

2.3 Nguồn vi sinh vật:

Enzyme Protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm

nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và

Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là

Bacillus subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium Trong đó, B subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất

(Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998) Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạtđộng thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu

Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8)

và có khả năng chịu nhiệt thấp Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phânprotein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng.Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và

thơm Chúng được sinh ra nhiều bởi B subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium.

Hình 2.2 Clostridium

Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân

tử từ 20.000-30.000 Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng

phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A terricola, A fumigatus, A saitoi,Penicillium chysogenum)… Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả baloại protease: acid, kiềm và trung tính Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu cácprotease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3

Một số nấm mốc khác như: A candidatus, P cameberti, P roqueforti… cũng

có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuấtpho mát

Trang: 12

ﾧ

Hình 2.5 Xạ khuẩn

Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được

tách chiết từ S grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy

phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid Ở Liên Xô (cũ),người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ S grieus có tên là protelin

Từ S fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin Ở

Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da Protease từ

S fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công

nghiệp chế biến thịt

Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể

sử dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kếtpeptide định trước Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhómcarboxyl hoặc nhóm amine được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm,phản ứng trong hệ hai pha lỏng

Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuấtenzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống Dùng nguồn vi sinh vật

có những lợi ích chính như sau:

 Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật

 Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16÷ 100 giờ nên có thể thu hoặcnhiều lần quanh năm

 Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (địnhhướng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi)

 Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dể tổ chứcsản xuất

Tuy nhiên trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc,gây bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp.

Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinhvật có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất,chỉ tổng hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó

Chương 3:

THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH ENZYM PROTEASE TỪ

VI SINH VẬT VÀ THỰC VẬT

3.1 Thu nhận và làm sạch enzyme Protease từ vi sinh vật.

Nguồn thu protease vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn, nấm mốc và xạkhuẩn

Quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme vi sinh vật bao gồm các giaiđoạn chủ yếu

Hình 3.1 Các công đoạn sản xuất chế phẩm enzyme

3.1.1 Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật cho enzyme có hoạt lực cao.

Để chọn giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao, người ta

có thể phân lập từ môi trường tự nhiên hoặc có thể dùng các tác nhân gây đột biếntác động lên bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền để tạo thànhcác biến chủng có khẳ năng tổng hợp đặc biệt hữu hiệu một loại enzyme nào đó,cao hơn hẳn chủng gốc ban đầu

3.1.1.1 Phương pháp gây đột biến.

Đây là phương pháp hay được dùng nhất nhằm để:

 Tạo những đột biến bị giảm khả năng sinh tổng hợp repressor hoặc tổnghợp repressor có ái lực thấp với gene opertor

 Tạo những đột biến tổng hợp enzyme có cấu trúc bậc 1 thay đổi do đó cóthể giảm độ thay đổi với kiểu kìm hãm theo cơ chế liên hệ ngược

Nếu sự thay đổi cấu trúc bậc 1 xảy ra ở vùng trung tâm hoạt động hoặc ở gần đóthì có thể làm thay đổi rõ rệt hoạt tính của enzyme

 Gây đột biến ở đoạn gene hoạt hóa promotor để làm tăng áp lực của nó đốivới ARN-polymerase do đó làm tăng tốc độ sao chép mã…Dùng biện pháp này cóthể làm tăng lượng glucoza-6-phosphatdehydrogenaza lên 6 lần

Hiện tượng đột biến thường liên hệ với sự thay đổi một gene, chẳng hạn bị “lồi”một bazo khi tái tạo phân tử ADN

Để tạo một đột biến gene có thể dùng tác nhân vật lý (tia tử ngoại, tiaphóng xạ) hay hóa học (các hóa chất) tác dụng lên tế bào sinh vật.

3.1.1.2 Phương pháp biến nạp.

Là sự biến đổi tính trạng di truyền của một nòi vi sinh vật dưới ảnh hưởngcủa ADN trong dịch chiết nhận nhận được từ tế bào của vi sinh vật khác Ở đâyyếu tố biến nạp là AND Sự chuyển vật liệu di truyền (ADN) từ tế bào cho đến tếbào nhận có thể xảy ra trong ống nghiệm (invitro) khi cho tế bào nhận tiếp xúcvới dịch chiết từ tế bào cho mà không có sự tiếp xúc giữa các tế bào

Các tế bào có thể nhận bất kỳ loại ADN nào chớ không đòi hỏi phải là ADN

từ các giống họ hàng Tuy nhiên tế bào chỉ có thể nhận một số đoạn ADN nhấtđịnh, thường không quá 10 đoạn Các đoạn ADN được di truyền trong biến nạp cóM=106-107 và phải có cấu trúc xoắn kép Hiện tượng biến nạp phổ biến ở nhiều

loài vi khuẩn như: Diplococus, Staphylocus, Hemophilus, Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Xantomonas.

3.1.1.3 Phương pháp tiếp hợp gene.

Khác với biến nạp, ở đây vật liệu di truyền chỉ được truyền từ tế bào chođến tế bào nhận khi hai tế bào tiếp xúc với nhau Do vậy các vi sinh vật có khảnăng biến nạp thì sẽ không có khả năng tham gia tiếp hợp gene nữa Hiện nay quá

trình tiếp hợp gene đã được nghiên cứu ở một số loài vi khuẩn như E.coli, salmonella, Pseudomonas aeruginosa.

3.1.1.4 Phương pháp tải nạp

Vật liệu di truyền (ADN) được chuyển từ tế bào cho sang tế bào nhận nhờvai trò trung gian của thực khuẩn thể (phage) Trong quá trình tải nạp, các đoạnAND được chuyển từ tế bào cho đến tế bào tiếp hợp với AND của tế bào nhận Do

đó làm biến đổi tính chất di truyền của tế bào nhận

3.1.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật.

Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme cần chọn giống thuần chủng, đãđược kiểm tra đầy đủ về các đặc tính hóa sinh, vi sinh, nuôi cấy và cần đặc biệtlưu ý đến điều kiện bảo quản giống Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một

Trang: 16

thời gian có thể tạo ra các biến dị ngẫu nhiên không mong muốn do đó định kỳphải cấy chuyền và kiểm tra lại các đặc tính ban đầu.

 Phương pháp cấy chuyền

Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trênmôi trường thạch (thạch nghiêng, hộp petri,…) với thành phần môi trường nuôicấy và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho giống vi sinh vật đó Sau khi giống đãmọc tốt cần bảo quản ở nhiệt độ lạnh 3-40C và sau mỗi tuần phải cấy chuyền lại.Khi cấy chuyền chỉ lấy bào tử hoặc khuẩn lạc mà không nên lấy cả môi trườngdinh dưỡng để đảm bảo không chuyền các sản phẩm trao đổi chất vào môi trườngmới (có thể gây biến đổi bất lợi không thể lường hết được) Nếu là xạ khuẩn thìkhông nên bảo quản giống trên môi trường thạch mà nên giữ trong đất để khửtrùng

Để kéo dài thời gian bảo quản giống từ hàng tháng đến 1 năm, người ta phủ

1 lớp paraphin lỏng để tiệt trùng trên bề mặt giống để hạn chế sự phát triển của nó.Cần lưu ý chỉ phủ lớp dầu sau khi cấy vi sinh vật đạt đến độ chín sinh lý

Phương pháp cấy chuyền rất có hiệu quả để bảo quản các giống nấm men, vikhuẩn và rất hữu hiệu, dễ dàng triễn khai giống ra sản xuất lớn, hạn chế các taibiến có thể dẫn đến hư hỏng giống gốc

Bằng cách giữ

silicagen trong điều kiện khô ráo (tất cả đều được khử trùng cẩn thận) Trongđiều kiện như vậy sẽ hạn chế sự phát triển tiếp tục của giống khi bảo quản.Phươg pháp này rất hay được sử dụng để bảo quản nấm mốc, xạ khuẩn, mộtvài loại nấm men, vi khuẩn thời gian giữu giống có thể được 1 năm.

Phương pháp làm khô cũng thực hiện đơn giản, không cần dụng cụ đắt tiền.Tuy nhiên giống như phương pháp cấy chuyền thời gian bảo quản tương đốingắn

 Phương pháp đông khô

ﾧ

Hình 3.3 Đông khô vi sinh vật.

Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ởtrạng thái lạnh sâu Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp

và được làm lạnh trong môi trường chân không Thiết bị đông khô sẽ hút nước vàcuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định Mẫu được hàn kín để cho môitrường chứa mẫu là chân không Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả caocho bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn

và một số virut Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, độngvật nguyên sinh và tế bào động vật

 Phương pháp bảo quản lạnh sâu:

Trang: 18

Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trongmôi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt

Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phươngpháp vạn năng hơn cả Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vậtkhác nhau như vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo và cả các dòng tế bào độngvật Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm như đầu tư kinhphí cho thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro như cháy nổ Đặc biệt phương pháp

này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến Nói chungphương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tínhquí mà không thích hợp với phương pháp đông khô.

Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiệntượng cảm ứng Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thìchất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toảcủa chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bịcản trở Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là

cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp

Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O Ngoài ra các chất vô cơ:

Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác

3.1.3.1 Nguồn cacbon.

Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit, tùy thuộc vào đặctính của enzyme và nòi vi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp

Trang: 20

Có nhiều chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn cacbon thíchhợp đối với nấm mốc sinh ra enzyme protease có hoạt lực cao Các nguồn cacbon

có tác dụng đến sinh tổng hợp proteinase của nấm mốc có thể theo thứ tự:

Đối với Asp flavus 74: fructoza→ glucoza→ sacaroza→ ramnoza→

manoza→ galactoza→ arabinora→ lactoza

Đối với Asp awamori 200: fructoza→ manit→ sacaroza→ arabinoza→

manoza→ galactoza→ lactoza

Đối với Asp oryzae 79: fructoza→ sacaroza→ maltoza→ glucoza→

manit→ arabinoza→ galactoza

Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme

Protease Ví dụ: Vi khuẩn Bac Subtilis có khả năng sinh tổng hợp Protease ở môi

trường tinh bột >8%

Nhiều xạ khuẩn ưa nhiệt, trong đó Micromonospora vulgaris 42, mọc tốt và

sinh tổng hợp protease cao ở môi trường có tinh bột Tăng nồng độ tinh bột từ0,25- 1,5% sinh khối cũng tăng đồng thời với hiệu xuất tổng hợp enzyme.Nếu tăngnồng độ tinh bột hơn nữa sẽ không thu được kết quả dương tính Tỷ số giữacacbon và nitơ cần phải là 4: 1 Trên môi trường có maltoza (0,5- 2%) vi sinh vậtphát triển bình thường, nhưng tổng hợp protease ngoại bào bị ức chế Xạ khuẩnkhông phát triển được ở trên môi trường có các nguồn cacbon duy nhất làsacaroza, lactoza hoặc arabinoza Glucoza, manoza, fructoza, xyloza có trong môitrường (0,2- 5%) làm ức chế sinh trưởng của xạ khuẩn và sinh tổng hợp enzyme Ngoài ra một số loại hydrocacbon cũng có nguồn cacbon có 125 chủng vi

sinh vật Chẳng hạn chủng Ps Seruginosa có thể đồng hoá hydrocacbon và có khả

năng sinh tổng hợp protease có hoạt lực cao trên môi trường n- parafin với 12, 14

và 16 nguyên tử cacbon, dầu nặng hoặc propylenglycol Chúng không chỉ đồnghoá được cả hydrocacbon béo mà còn đồng hoá cả hydrocacbon thơm

3.1.3.2 Nguồn nito.

Nguồn nito sử dụng rất phong phú, bao gồm 2 nhóm: vô cơ và hữu cơ

Đối với một số loài nấm mốc thuộc họ (A oryzae, A awamori, A niger, A flavus) trên môi trường có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp protease axit cao.

Trên môi trường kzapek NaNO3 được thay bằng cả cazein hoạt lực protease củanấm mốc được tăng lên 3,5 lần, còn khi thay tinh bột bằng glucoza và bổ sungpepton hoạt lực enzyme tăng 6 lần Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổnghợp enzyme được nâng cao khi trong môi trường có đồng thời cả nguồn nitơ hữu

cơ và nitơ vô cơ Cho thêm vào môi trường có cám mì, bột đậu tương đã tách chấtbéo, các nguồn nitơ và hữu cơ hoạt lực enzyme protease tăng 22- 74% Còn trườnghợp dùng các nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ dẫn đến ngừng sinhtổng hợp protease nói chung

Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn, trong đó có B subtilis và B mesentericus, các hợp chất nitơ vô cơ và hữu cơ được dùng phối hợp trong môi

trường sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sinh tổng hợp protease Trong số các nguồnnitơ vô cơ thì NH4, H2PO4 là tốt hơn cả Những muối khác NH4Cl, (NH4)2SO4,

NH4NO3, NaNO3, KNO3, Ca(NO3)2 làm giảm hoạt lực protease tới 30- 50% , cònamylaza giảm 7- 10 lần Còn trong môi trường chỉ có nguồn nitơ hữu cơ hoạt lựcprotease và amylaza cũng thấp hơn trong môi trường đối chứng (NH4)2HPO4 vànước chiết đậu tương

Đối với xạ khuẩn ưa nhiệt Actynomyces Vulgaris U2 thì pepton là chất

cảm ứng để sinh tổng hợp enzyme protease là tốt nhất

Các axit amin có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme bằng vi sinhvật Glyxin, alanin, metionin và lơxin có tác dụng làm tăng hoạt lực protease củachủng đột biến A oryzae 251- 90 đến 6- 9% và nguyên chủng A oryzae 132- 63tới 7- 24% Nhiều axit amin có tác dụng ức chế đến sinh tổng hợp enzyme, Valin,axit glutamic, izolơxin và valin ức chế tổng hợp enzyme ở B megaterium 60%

Còn đối với B subtilis các axit amin ức chế trong quá trình này là glyxin,

metionin, axit glutamic, alanin, lơxin,…

Trang: 22