Nguồn thu nhận enzyme protease - Ứng dụng
TRƯỜNG :ĐẠI HỌC BÁCH KHOAKHOA :KĨ THUẬT HÓA HỌCBỘ MÔN :CÔNG NGHỆ THỰC PHẨMBÁO CÁO THUYẾT TRÌNH HÓA SINH THỰC PHẨMĐỀ TÀI:NGUỒN THU NHẬN EMZYM PROTEASE VÀ ỨNG DỤNGNhóm SVTH:Nguyễn Thái Duy :60800319 Phạm Nhật Minh Giang : Nguyễn Nhất Din : 60800282 Cao Nguyễn Ngọc Hoàng :60800697 Võ Thanh Liêm :60801083 Phạm Nhật Minh Giang :60800534 Nguyễn Trọng Oánh :60801510 GVHD:Ts :Trần Bích Lam 1 2 Mục LụcPhần 1:Giới thiệu về Enzym Protease………………4 Phần 2:Nguồn Thu Nhận Enzym Protease………….5Phần 3:Ứng dụng trong công nghiệp……………….123 I.Giới thiệu về enzyme protease:1.Giới thiệu chung về enzyme protease:- Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin.Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa .) và động vật (gan, dạ dày bê .). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất- Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vậtthường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.- Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.2.Phân loại:a. Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thànhhai loại:+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide.+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptideb. Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: + Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung 4 tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:- Protease acid : pH 2-4 - Protease trung tính : pH 7-8 - Protease kiềm : pH 9-11II.Nguồn thu enzym protease1.Vi khuẩn:Bacillus subtilis-Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm59% lượng enzyme được sử dụng.Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein.-Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998). Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu.-Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và cókhả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium.5 -Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7-12. 2.NấmAspergillus oryzae -Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum)… Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3 [2]. Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho mát.3.Xạ khuẩn Streptomyces grieus S. fradiae-Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn vànấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. trerimosus… Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách chiết từ S. grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid. Ở Liên Xô (cũ), người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ S. grieus có tên là protelin.6 -Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Ở Mỹ,chế phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da [2]. Protease từ S. fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiệp chế biến thịt. -Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết peptide định trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm carboxyl hoặc nhóm amine được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm, phản ứng trong hệ hai pha lỏng.4. Phương pháp thu nhận enzyme protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae7 a.Kỹ thuật nuôi cấy: Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay với chiều dài 2-3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những giá đỡ. Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng nuôi cấy phải có hệ 8Nuôi cấyThu nhận phế phẩm enzyme thôChế phẩm enzyme thô đem tinh chếNghiền mịnTrích lyLọcKết tủa enzymeThu nhận kết tủaSấy kế tủaTinh chế kết tủaThu nhận chế phẩm enzyme tinh khiếtEnzyme tinh khiếtChế phẩm ezyme thô đem sử dụngBãDùng trong chăn nuôiCồn hoặc Sulfat amonSử dụng chế phẩm ezyme tinh sạch thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí.Nhiệt độ thích hợp cho nấm sợi phát triển là 28-320C. Nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá đều ảnh hưởng không tốt cho nấm sợi phát triển.-Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH. Môi trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường.-Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. Điều này còn phụ thuộc vào chủng nấm mốc Asp.oryzae và điều kiện môi trường cũng như phụ thuộc vào điệu kiện nuôi cấy.-Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau:-Giai đoạn 1 : Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau:+ Nhiệt độ tăng rất chậm.+ Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa.+ Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi.+ Khối môi trường còn rời rạc.+ Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành.-Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ.-Giai đoạn 2 : Giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau: Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trường trong lòng môi trường.9 + Trong giai đoạn này ta có thể hoàn toàn nhìn rõ các sợi nấm có màu trắng xám bằng mắt thường.+ Môi trường được kết lại khá chặt.+ Độ ẩm môi trường giảm dần.+ Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-450C.+ Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi.+ Enzym protease được tổng hợp mạnh.+Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29-300C là tốt nhất.-Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có một số thay đổi cơ bản như sau:-Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại.-Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống 20-25 thể tích không khí /thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ. Nhiệt dộ nuôi duy trì ở 300C,trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó lượng Enzym protease tạo ra sẽ giảm xuống. Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất cần thiết.b.Thu nhận sản phẩm:-Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzym protease, chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzym thô (vì ngoài thành phần enzym ra, chúng còn chứa sinh khối VSV, thành phần môi trường và nước trong môi trường).10 [...]... cần dùng các protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng, muốn vậy người ta thường dùng phối hợp cả 3 loại protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ lệ tổng cộng 1- 2% khối lượng protein cần thu phân Ưu điểm của việc thu phân protease bởi enzyme là bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thu phân +Trong chế biến thu sản: Khi... chế biến thịt, protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị thịt (ngâm thịt vào dinh dưỡng protease ở pH và nhiệt độ xác định- phương pháp này phổ biến và thu n lợi nhất; Tẩm hỗn hợp làm mềm thịt (enzyme, muối, bột ngọt) Tiêm dung dịch enzyme vào thịt;... enzyn protease ở 40OC cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8 % W ( thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương – có thể xem ở phần phụ lục) -Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzym protease ở dạng kết tủa vẫn hoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đố còn chứa 1 số enzym ngoài enzym ta quan tâm III Ứng dụng trong công nghiệp: 12 -Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công... tẩy trắng Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác như: - Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng - Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm - Điều chế môi trường... dịch enzyme vào con vật trước khi giết mổ) Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: từ Streptomyces fradiae tách được chế phẩm keratineza thu phân được keratin rất có giá trị để sản xuất dịch đạm từ da, lông vũ Nếu dùng axit để thu phân sẽ mất đi hoàn toàn các axit amin chứa lưu huỳnh, nếu dùng kiềm để thu phân sẽ bị raxemic hoá (chuyển dạng L sang D làm giảm giá trị sinh học của axit amin) Để thu ... nghiệp da, protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thu c da Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật Hiện nay, việc đưa các protease tách... sulfat amon -Khi cho chất kết tủa vào dung dich enzym thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ, sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường từ 4-7 OC) theo thời gian, các enzym sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn và lọc thu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm lớn hơn 70%W) - trạng thái này enzym rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản người ta sấy kết tủa enzyn protease. .. đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩm gia súc ( chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súc ăn) +Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzym thô vì trong đó có chứa nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy Việc tiếp theo là làm sao tách enzym ra khỏi vật chất này c.Quá trình kết tủa enzym protease: - ể làm việc trên người ta.. .- ể đảm bảo cho chế phẩm enzym protease không bị mất hoạt tính nhanh người ta thường sấy khô chế phẩm enzym đến một độ ẩm thấp ( thiết bị sấy thường dùng ở đây là máy sấy chân không- có thể xem ở phần phụ lục) Độ ẩm cần đạt được sau khi qúa trình sấy kết thúc là nhỏ hơn10% độ ẩm Để đảm bảo hoạt tính enzym không thay đổi người ta thường sấy ở nhiệt độ 3 8-4 00C Enzym protease ở nấm mốc... suất thu phân (độ đạm) lại phụ thu c rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá Nên hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme thực vật (bromelain và papain) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm Tuy nhiên vẫn còn một số tồn tại cần phải hoàn thiện thêm về công nghệ +Trong công nghiệp sữa, protease . tác dụng của EDTA.Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm :- Protease acid : pH 2-4 - Protease trung tính : pH 7-8 - Protease. protease: 1.Giới thiệu chung về enzyme protease: - Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thu phân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein,