Nuôi cấy bacillus Subtilis thu nhận Amylase và ứng dụng trong sản xuất
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
Khóa luận được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh hóa trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh
Thời gian tiến hành: từ 19/03/2007 đến 19/07/2007.
VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Giống vi khuẩn Bacillus subtilis do công ty TNHH Gia Tường cung cấp
- Cám bắp, bã đậu nành, bột năng Vĩnh Thuận, bột nếp Vĩnh Thuận, bột gạo Vĩnh Thuận, bột bắp Tài Ký
Thiết bị và dụng cụ
- Tủ sấy - Bình định mức
- Máy ly tâm - Ống đong
- Máy đo mật độ quang - Khay nhựa…
Môi trường giữ giống được sử dụng là nước chiết giá đậu đường pepton agar, trong khi môi trường nhân giống là nước chiết giá đậu đường pepton Ngoài ra, môi trường nuôi cấy bán rắn cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình nghiên cứu và phát triển vi sinh vật.
Thành phần và tỷ lệ các loại môi trường được trình bày chi tiết ở mục 1 phần phụ lục.
PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.3.1.Xác định mật độ tế bào Bacillus subtilis trong dịch tăng sinh
Sử dụng que cấy để chuyển một vòng vi khuẩn B subtilis từ ống giống vào bình erlen chứa 20 ml môi trường tăng sinh đã được khử trùng, sau đó lắc đều và đặt trên máy lắc.
Sau 24 giờ kiểm tra số lƣợng tế bào vi khuẩn trong dịch tăng sinh bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (được trình bày ở mục 2.1 và 2.2 của phần phụ lục)
3.3.2 Khảo sát thời gian nuôi cấy tối ƣu
Môi trường nuôi cấy bán rắn được chuẩn bị với 35 g cho mỗi erlen, sau đó được khử trùng ở áp suất 1atm trong 45 phút và để nguội xuống khoảng 40 - 50 độ C Tiến hành cấy 5% dịch vi khuẩn đã được nuôi cấy trong 24 giờ vào môi trường này Quá trình ủ được thực hiện ở nhiệt độ phòng từ 30 đến 32 độ C trong các khoảng thời gian 24, 36, 48, 60 và 72 giờ Cuối cùng, canh trường sau khi nuôi cấy được sấy khô ở nhiệt độ 50 độ C.
Cân 1 g canh trường đã sấy khô hòa trong 100 ml nước cất, đem ly tâm
Để xác định hoạt tính α-amylase theo phương pháp Heinkel, đầu tiên cần thực hiện quá trình quay 3000 vòng/phút trong 10 phút để tạo ra dịch enzyme pha loãng 100 lần Sau đó, từ dịch pha loãng này, tiếp tục tiến hành pha loãng đến mức độ phù hợp.
3.3.3 Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn 96%
Trong thí nghiệm này dùng phương pháp tủa enzyme bằng cồn 96% lạnh (xem mục 2.3 phần phụ lục)
Cân 5 g canh trường đã sấy khô và nghiền nhỏ hòa trong 80 ml nước cất, lắc đều trong 15 phút Ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch chiết enzyme
Hoạt độ α-amylase sau tủa
Lấy 10 ml dịch chiết enzyme trên đem tủa với cồn 96% đã để lạnh khoảng
Để thực hiện quy trình, trộn các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 và 1:5 ở nhiệt độ 4 độ C, lắc đều và để lạnh trong 15 phút Sau đó, ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ cồn và thu cặn lắng Cuối cùng, hòa cặn trong 5 ml đệm acetate pH = 5,0 và định mức với nước cất thành 100 ml.
Hút 1 ml dịch enzyme này đem định lượng protein theo phương pháp Lowry (xem mục 2.6 phần phụ lục) và xác định hoạt tính theo phương pháp Heinkel
Hiệu suất thu hồi hoạt độ amylase từ 10 ml DCE đƣợc tính theo công thức:
Hiệu suất thu hồi protein từ 10 ml DCE đƣợc tính theo công thức:
3.3.4 Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng (NH 4 ) 2 SO 4
Tương tự, chuẩn bị dịch chiết enzyme từ canh trường giống như phần tủa bằng cồn 96%
Cân chính xác lượng muối (NH4)2SO4 và cho vào các erlen chứa 10 ml dịch enzyme đã được làm lạnh Lắc đều trong 10 phút và sau đó để lạnh Sau 10 phút, tiến hành ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút Các bước tiếp theo thực hiện tương tự như quy trình tủa bằng cồn 96%.
3.3.5 Khảo sát thời gian tủa cồn 96%
Các bước thực hiện tương tự như trong khảo sát tỷ lệ cồn, nhưng thể tích cồn trong thí nghiệm này giữ nguyên Tỷ lệ cồn 96% kết hợp với enzyme đã được xác định là tỷ lệ thích hợp ở mục 3.3.3.
Kiểm tra hoạt tính α-amylase và định lƣợng protein với thời gian tủa là 15,
Hoạt độ α-amylase trước tủa
3.3.6 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng năng thủy phân tinh bột của chế phẩm α-amylase
Cân 0,03 g chế phẩm α-amylase tinh sạch đã được sấy khô bằng cồn 96%, sau đó hòa tan trong 50 ml nước cất và pha loãng thêm 100 lần Tiến hành đo hoạt tính α-amylase theo phương pháp Heinkel ở các nhiệt độ 30, 40, 45, 50, 55, 60 và 65 oC.
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các giá trị pH: 5,8; 6,0; 6,2; 6,4 và 6,6 lên hoạt độ α-amylase ở nhiệt độ thích hợp
Kiểm tra hoạt tính α-amylase ở mỗi giá trị pH theo phương pháp Heinkel
3.3.7 Khảo sát tỷ lệ cồn 96% thích hợp để thu dextrin
Sau khi hồ hóa, tinh bột được làm nguội đến nhiệt độ thích hợp và thêm chế phẩm enzyme (CPE) đã pha loãng Sau 30 phút, tiến hành ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ tinh bột thừa.
Dịch ly tâm được cho vào các erlen chứa cồn với các tỷ lệ 1:2, 1:3 và 1:4 Sau đó, ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút để tách dịch cồn và cân lượng dextrin thu được.
3.3.8 Khảo sát khả năng thủy phân tinh bột của chế phẩm α-amylase
3.3.8.1 Khảo sát khả năng thủy phân với các nguồn tinh bột
Thực hiện phản ứng thủy phân với các nguồn tinh bột khác nhau: bột gạo, bột năng, bột nếp, bột bắp ở nồng độ 10%
Tiến hành hồ hóa 2g tinh bột trong 18ml dung dịch đệm với pH tối ưu, sau đó làm nguội đến nhiệt độ thích hợp Tiếp theo, thêm 0,5ml chế phẩm α-amylase đã được pha loãng với tỷ lệ 200, 400, 600 lần và khuấy đều liên tục.
Sau 10 phút, cho 5 ml HCl 5% để dừng phản ứng Ly tâm loại bỏ tinh bột thừa, dịch ly tâm đƣợc tủa cồn để thu dextrin Cân lƣợng dextrin tạo thành và so sánh khối lƣợng dextrin có đƣợc giữa các nguồn tinh bột
Dextrin thu đƣợc (g) Tinh bột ban đầu (g)
Hiệu suất thu dextrin tính theo công thức:
3.3.8.2 Khảo sát nồng độ tinh bột thích hợp
Sau khi chọn đƣợc nguồn tinh bột thích hợp, tiến hành khảo sát lƣợng dextrin tạo thành ở các nồng độ tinh bột là 10%, 15% và 20%
Cho thể tích và độ pha loãng CPE thích hợp vào 20 g hồ tinh bột với nồng độ tinh bột 10% và 15% và 20% Thời gian khảo sát là 10, 20, 30 và 40 phút.
PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu đƣợc xử lý sai số và vẽ đồ thị, biểu đồ bằng phần mềm Microsoft Excel