NGUỒN THU NHẬN EMZYM PROTEASE VÀ ỨNG DỤNG

Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng

TRƯỜNG :ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA :KĨ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN :CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO THUYẾT TRÌNH HÓA SINH THỰC PHẨM ĐỀ TÀI:NGUỒN THU NHẬN EMZYM PROTEASE VÀ ỨNG DỤNG Nhóm SVTH:Nguyễn Thái Duy :60800319 Phạm Nhật Minh Giang : Nguyễn Nhất Din : 60800282 Cao Nguyễn Ngọc Hoàng :60800697 Võ Thanh Liêm :60801083 Phạm Nhật Minh Giang :60800534 Nguyễn Trọng Oánh :60801510 GVHD:Ts :Trần Bích Lam 1 2 Mục Lục Phần 1:Giới thiệu về Enzym Protease………………4 Phần 2:Nguồn Thu Nhận Enzym Protease………….5 Phần 3:Ứng dụng trong công nghiệp……………….12 3 I.Giới thiệu về enzyme protease: 1.Giới thiệu chung về enzyme protease: - Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO- NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa .) và động vật (gan, dạ dày bê .). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất - Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng. - Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase. 2.Phân loại: a. Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase đươ ̣ c phân chia tha ̀ nh hai loa ̣ i: + Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide. + Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide b. Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: + Serin proteinase: là những proteinase chư ́ a nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động va ̀ có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. + Cysteine proteinase: Các proteinase chư ́ a nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung 4 tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. + Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. + Metallo proteinase: Metallo proteinase la ̀ nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA. Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm: - Protease acid : pH 2-4 - Protease trung tính : pH 7-8 - Protease kiềm : pH 9-11 II.Nguồn thu enzym protease 1.Vi khuẩn: Bacillus subtilis -Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng. Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein. -Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998). Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoa ̣ t động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu. -Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đă ́ ng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dươ ̃ ng. Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. 5 -Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ 20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7-12. 2.Nấm Aspergillus oryzae -Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum)… Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3 [2]. Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho ma ́ t. 3.Xạ khuẩn Streptomyces grieus S. fradiae -Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. trerimosus… Các chế phẩm protease tư ̀ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách chiết từ S. grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid. Ở Liên Xô (cũ), người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ S. grieus có tên là protelin. 6 -Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Ở Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da [2]. Protease từ S. fradiae cũng có hoa ̣ t tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiệp chế biến thịt. -Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết peptide định trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm carboxyl hoặc nhóm amine được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm, phản ứng trong hệ hai pha lỏng. 4. Phương pháp thu nhận enzyme protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae 7 a.Kỹ thuật nuôi cấy: Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay với chiều dài 2-3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những giá đỡ. Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng nuôi cấy phải có hệ 8 Nuôi cấy Thu nhận phế phẩm enzyme thô Chế phẩm enzyme thô đem tinh chế Nghiền mịn Trích ly Lọc Kết tủa enzyme Thu nhận kết tủa Sấy kế tủa Tinh chế kết tủa Thu nhận chế phẩm enzyme tinh khiết Enzyme tinh khiết Chế phẩm ezyme thô đem sử dụng Bã Dùng trong chăn nuôi Cồn hoặc Sulfat amon Sử dụng chế phẩm ezyme tinh sạch thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí.Nhiệt độ thích hợp cho nấm sợi phát triển là 28-32 0 C. Nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá đều ảnh hưởng không tốt cho nấm sợi phát triển. -Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH. Môi trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường. -Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. Điều này còn phụ thuộc vào chủng nấm mốc Asp.oryzae và điều kiện môi trường cũng như phụ thuộc vào điệu kiện nuôi cấy. -Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau: -Giai đoạn 1 : Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau: + Nhiệt độ tăng rất chậm. + Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa. + Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi. + Khối môi trường còn rời rạc. + Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành. -Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá 30 0 C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ. -Giai đoạn 2 : Giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau: Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trường trong lòng môi trường. 9 + Trong giai đoạn này ta có thể hoàn toàn nhìn rõ các sợi nấm có màu trắng xám bằng mắt thường. + Môi trường được kết lại khá chặt. + Độ ẩm môi trường giảm dần. + Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45 0 C. + Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi. + Enzym protease được tổng hợp mạnh. +Lượng O 2 trong không khí giảm và CO 2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29-30 0 C là tốt nhất. -Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có một số thay đổi cơ bản như sau: -Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại. -Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống 20-25 thể tích không khí /thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ. Nhiệt dộ nuôi duy trì ở 30 0 C,trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó lượng Enzym protease tạo ra sẽ giảm xuống. Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất cần thiết. b.Thu nhận sản phẩm: -Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzym protease, chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzym thô (vì ngoài thành phần enzym ra, chúng còn chứa sinh khối VSV, thành phần môi trường và nước trong môi trường). 10 [...]... làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị thịt (ngâm thịt vào dinh dưỡng protease ở pH và nhiệt độ xác định- phương pháp này phổ biến và thu n lợi nhất; Tẩm hỗn hợp làm mềm thịt (enzyme, muối, bột ngọt) Tiêm dung dịch enzyme vào thịt; tiêm dung dịch enzyme vào con vật trước khi giết mổ) Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: từ Streptomyces... tế bào Phần lớn enzym protease ngoại bào khi được tổng hợp và thoát khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường Khi ta nghiền nhỏ, enzym thoát ra khỏi các thành phần này dễ dàng hơn -Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền trong trường hợp này đượcdùng là cát thạch anh và bột thủy tinh Các chất này là những chất vô cơ không tham gia vào phản ứng và khả năng tăng mức... keratineza thu phân được keratin rất có giá trị để sản xuất dịch đạm từ da, lông vũ Nếu dùng axit để thu phân sẽ mất đi hoàn toàn các axit amin chứa lưu huỳnh, nếu dùng kiềm để thu phân sẽ bị raxemic hoá (chuyển dạng L sang D làm giảm giá trị sinh học của axit amin) Để thu phân sâu sắc và triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng các protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng. .. 3 loại protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ lệ tổng cộng 1- 2% khối lượng protein cần thu phân Ưu điểm của việc thu phân protease bởi enzyme là bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thu phân +Trong chế biến thu sản: Khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm) thường thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thu phân... -Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzym protease ở dạng kết tủa vẫn hoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đố còn chứa 1 số enzym ngoài enzym ta quan tâm III Ứng dụng trong công nghiệp: 12 -Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công nghiêp thực ̣ phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp… +Trong công nghiệp chế biến thịt, protease được dùng làm mềm thịt nhờ... tụ sữa của chúng Protease từ một số vi sinh vật như A candidus, P roquerti, B mesentericus,… được dùng trong sản xuất pho mát Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn +Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc Protease của A oryzae... nghiệp da, protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thu c da Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật Hiện nay, việc đưa các protease tách... nấm mốc (A oryzae, A flavus) và xạ khuẩn (S fradiae, S griseus, S rimosus ) vào công nghiệp thu ̣c da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng +Trong công nghiêp dệt: Proteinase vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm, 13 tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được bằng các dung dịch cazein, gelatin) để sợi được được bóng, dể nhuộm Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin... protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác như: - Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng - Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme... cho chất kết tủa vào dung dich enzym thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ, sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường từ 4-7OC) theo thời gian, các enzym sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn và lọc thu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm lớn hơn 70%W) -Ở trạng thái này enzym rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản người ta sấy kết tủa enzyn protease ở 40OC cho