Ứng dụng enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng nhằm tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao ứng dụng trong chăn nuôi

Papain là một enzym được lấy ra từ mủ của các quả đu đủ xanh

MỤC LỤC

CHƯƠNG I : LỜI MỞ ĐẦU 3

CHƯƠNG II: GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN 4

2.1 Giới thiệu về cây đu đủ 4

2.1.1 Giới thiệu 4

2.1.2 Phân bố sinh thái của cây đu đủ 5

2.1.3.Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ 5

2.2 Giới thiệu về enzyme papain 5

2.2.1 Cysteine protease 5

2.2.2 Nguồn gốc 5

2.2.3 Tính chất của papain 5

2.2.3.1 Tính chất vật lý 6

2.2.3.2 Tính chất hóa học 7

a) Cấu tạo hóa học: 7

b) Cấu trúc không gian 8

c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain 9

d) Phản ứng của papain 11

e) Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain 13

CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PAPAIN 14

3.1 Phương pháp thu nhận papain 14

3.1.1 Thu nhận nhựa đu đủ 14

3.1.2 Thu nhận papain 14

3.2 Phương pháp tinh sạch papain 15

3.2.1 Điện di 15

3.2.2 Lọc qua Sephadex G-75 15

CHƯƠNG IV: ỨNG DỤNG ENZYM PAPAIN THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 17

4.1 Ứng dụng của enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng 17

4.1.1 Sơ đồ thực hiện phản ứng thủy phân 17

a/ Nguyên lý chung: 17

b/ Thuyết minh quy trình chung: 18

4.1.2 Các thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân 18

4.1.3 Tính chất của sản phẩm sau thủy phân 19

4.1.4 Chỉ tiêu theo dõi papain thủy phân bánh dầu đậu nành 19

4.1.5 Phương pháp xác định hoạt tính 20

a Cơ chất: 20

b Điều kiện: 20

c Phương pháp xác định hoạt độ enzyme: 20

c.1 Khái quát 20

c.2 Phương pháp xác định hoạt tính của papain 21

4.2 Một số ứng dụng của enzyme papain 25

4.2.1 Trong y học 25

4.2.2 Trong công nghiệp thực phẩm: 25

4.2.3 Trong các ngành công nghiệp khác: 26

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN 28

Tài lệu tham khảo 29

CHƯƠNG I : LỜI MỞ ĐẦU

Trong mủ đu đủ có ba enzyme chính bao gồm: papain, chymopapain và peptidase.Papain là một enzym được lấy ra từ mủ của các quả đu đủ xanh Ngoài ra, papain còn làmột loại men phân giải protein tồn tại trong đu đủ Enzym papain rất tốt cho hệ tiêu hóa,giúp tiêu hóa các thức ăn giàu protein một cách dễ dàng hơn Nó có thể giúp phân giải vàloại bỏ những lớp da chết trên bề mặt cơ thể Papain có tác dụng tiêu hóa protid, biến đổicác chất có albumin thành pepton, có tác dụng trên mỡ, trên các hydrat carbon trong môitrường hơi kiềm hay trung tính Ở nhiệt độ thường khi cho tiếp xúc papain với lòng trắngtrứng thì lòng trắng trứng bị mất tính sánh sền sệt Trung bình một trái đu đủ cho được12g mủ, từ 4kg mủ đu đủ tươi cho 1kg papain khô và trồng đu đủ để khai thác lấy mủ chỉhiệu quả trong vòng 3 - 4 năm tuy vòng đời của một cây đu đủ khoảng 20 năm

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học , các chế phẩmenzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực như:chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Khoảng 75% chế phẩm là enzymethủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên Với những lợi ích và giá trị

mà enzyme papain đem lại , nó được ứng dụng rộng rãi và thường được dùng trong lĩnhvực chế biến mỹ phẩm Ngoài ra, Papain rất cần cho nhiều lĩnh vực công nghiệp: dượcphẩm, hóa chất, kỹ nghệ tơ sợi dệt may, thuộc da, thực phẩm

Vì tầm quan trọng của enzyme papain trong nhiều lĩnh vực nên nhóm chúng tôi thựchiện đề tài: Ứng dụng enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng nhằm tạo sảnphẩm có giá trị dinh dưỡng cao ứng dụng trong chăn nuôi

CHƯƠNG II: GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN

2.1 Giới thiệu về cây đu đủ

2.1.1 Giới thiệu

Tên khoa học: Carica papaya L., thuộc họ đu đủ - Caricac

Cây đu đủ còn được gọi thù đủ ở Huế, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan qua thụ, lôhong phlê (Campuchia), mắc hung (Lào), má hống (Thái) Đu đủ thường là cây đồng chu,nhưng đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính

và cây cái Vài cây đu đủ cũng có thể trổ cả ba loại hoa nói trên Ngoài ra cũng có cây rahoa không hẳn hoàn toàn đực, cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của baloại hoa Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra tỉ như khô hạn vàthay đổi nhiệt độ

2.1.2 Phân bố sinh thái của cây đu đủ.

Chi Carica L có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ Ở vùng núi cao (1500-3000m),

từ Panama đến Bolivia, cây đu đủ trồng hiện nay rất có thể là giống lai tự nhiên của loài

C peltata Hook & Ann Vào khoảng thế kỷ 16, người Tây Ban Nha đã đưa đu đủ vàotrồng ở vùng Caribê và một số nước Đông Nam Á Từ các địa điểm này, cây tiếp tụcđược trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Srilanca, châu Đại Dương và châu Phi

2.1.3 Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ

1 Nhựa đu đủ có thể gây viêm da

2 Ở Trung Mỹ, trong dân gian, người ta sử dụng đu đủ để điều trị bệnh lỵamip(Entamoeba histolytica), một loại ký sinh trùng gây tiêu chảy dạng lỵ và biến chứng áp-

xe gan

3 Ở Samoa, người dân dùng phần dưới vỏ thân cây đu đủ để chữa chứng nhức răng

4 Nhựa đu đủ có chứa papain, là một trong hai loại men tiêu hủy protein (proteolyticenzymes) có tác dụng làm mềm thịt bắp Chính do tác dụng này, khi dùng đu đủ hầmchung với thịt, thịt sẽ mềm hơn Người dân vùng Ca-ri-bê, Trung Mỹ cho biết họ có thểdùng khẩu phần với số lượng lớn thịt cá nhưng vẫn không hề gì nếu ăn đu đủ xanh sauđó

5 Phần cơm đu đủ là thành phần chính của các loại mỹ phẩm như kem nền (mặt),kem đánh răng, xà bông gội đầu

6 Các ứng dụng quan trọng trong y học của nhựa đu đủ là chiết xuất papain để dùngtrong phẫu thuật cột sống (là một loại "dao phẫu thuật tự nhiên" để mở đĩa đệm) Nghiêncứu cho thấy chiết xuất papain có hoạt tính kháng sinh (antibioticactivity) với tác dụngchống vi khuẩn gram dương (gram-positive bacteria) Nó còn được dùng để điều trị lởloét, làm tiêu giả mạc trong bệnh bạch hầu, chống kết dính sau phẫu thuật, làm thuốc giúptiêu hóa Trong công nghiệp, papain được dùng để tinh chế bia; xử lý len và lụa trước khinhuộm; là phụ gia trong công nghệ chế biến cao su; khi tinh chế dầu gan cá tuna, người tatiêm papain vào gan trước khi chiết xuất, làm cho thành phẩm giàu Vitamin A và D hơn.Khoảng 1,500 quả đu đủ xanh cỡ vừa cho được khoảng 650g papain

2.2 Giới thiệu về enzyme papain

2.2.1 Cysteine protease

- Cysteine proteases (EC.3.4.22) là nhóm các protein có trọng lượng phân tử trongkhoảng 21-30kDa, các protein này có khả năng xúc tác để thủy phân các loại liên kết:peptide, amide, esterthiol Đây cũng là những enzyme có nhóm –SH trong tâm hoạt động

- Người ta đã tìm thấy hơn 20 họ cysteine proteases (Barrett, 1994) và nhiều enzymetrong số này (papain, bromelain, ficain, animal cathepsins) được ứng dụng rộng rãi trongcông nghiệp.

- Có 2 loại cysteine proteases là exopeptidase ( cathepsin X, carboxypeptidase B) vàendopeptidases ( bromelain, ficain, cathepsin…) Exopeptidase thủy phân liên kết peptide

ở đầu N hoặc đầu C tự do trong khi đó endopepetidase cắt đứt các liên kết peptide ở giữachuỗi polypeptide

2.2.2 Nguồn gốc

Papain (EC 3.4.22.3) là cysteine protease được biết đến nhiều nhất và được phân lậplần đầu tiên vào năm 1879 từ nhựa trái đu đủ (Carica papaya) Đây cũng là enzyme đầutiên được xác định cấu trúc tinh thể (Drenth et al., 1968; Kamphuis et al., 1894) Trongnhựa đu đủ ngoài enzyme papain còn có các loại protease khác như chymopapain,caricain, glycyl endopeptidase và một số enzyme khác (Baines and Brock-lehurst, 1979).Nhựa đu đủ có hàm lượng và hoạt tính papain cao nhất tập trung ở vùng có nắng nóng và

chất hữu cơ nhưng tan một phần trong H2O hay glycerine Bền nhiệt.

2.2.3.2 Tính chất hóa học

a) Cấu tạo hóa học:

Papain là 1 endoprotease có chứa 16% N và 1.2% S Papain là 1 protease thiol, theo nghiên cứu của R L Hill và E L Smith, papain là 1 chuỗi polypeptide gồm 185 amino acid, trọng lượng phân tử là 20.900 Dalton

Bảng 2.2: Thành phần hóa học:

b) Cấu trúc không gian

Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước 36x48x36Ao và mạch chính bị gấpthành hai phần riêng biệt bởi một khe Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt của khe này,nhóm -SH hoạt động của cysteine 25 nằm bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bênphải khe Phần xoắn chiếm 20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử.

Hoạt tính của papain dựa trên hai tâm hoạt động là Cys25 và His159 Khoảng pH hoạtđộng của papain khá rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào cơ chất Khi cơ chất là casein thì hoạttính tối ưu của papain trong vùng pH từ 5.7 – 7.0 và nhiệt độ thích hợp là 50 – 570C

c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain

- Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 củahistidine 159 Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởiliên kết hydrogen

- Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là: Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys

- Theo các nghiên cứu của Lowe, chuỗi polypeptide trong trung tâm hoạt động củapapain gần giống như của ficin hay trypsin, mặc dù chúng có nguồn gốc khác nhau.Ficin: Arg-Glu-Glu-Gly-Glu-Cys-Gly-Ser-Cys

Trypsin: Lys-Asp-Ser-Cys-Glu-Gly-Gly-Asp-Ser.

 Hoạt tính enzyme và cơ chất tác dụng:

- Papain thủy phân peotein thành các polypeptide và các polypeptide và các aminoacid, đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase

- Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu thành các peptid:

(-NH-CO-NH-CO-)n + HOH  (-NH-COOH)I + (H2N- CO-)k

CH(R)-i+k=n

- Các exopeptidase thủy phân các peptide thành các amino acid

(H2N-CH(R)-CO-)k

n`+k = n

- So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain có khảnăng thủy phân sâu hơn Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nó có khả năngphân hủy hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các glutamic acid cónhóm carboxy tự do Papain có thể nhận biết 1 chuỗi gồm 7 amino aicd trên cơ chấtpeptide của mình và sẽ ưu tiên cắt liên kết peptide trên 1 chuỗi có phenylamine như sau:

nếu peptide có dạng X-Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì papainsex cắt tại vịtrí giữa Y và Z, nhưng nếu peptide có dạng X-Phe-Y ( có Phe nằm ở vị trí thứ 2 trước đầutận cùng) thì không được thủy phân bởi papain.

- Ngoài ra papain còn có hoạt tính esterase, thiolesterase và trafnerase

Papain chỉ thể hiện hoạt tính xác tác của mình khi nhóm –SH ở dạng tự do Vì vậy ta

sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạtđộng do trung tâm hoạt động của papain có tính khử nên các chất hoạt hóa là các chất cótính khử như cysteine, glytation aicd, hdrocyanic… trong đó cysteine là chất hay dùngnhất hki có mặt các chất này thì nhóm –SH của papain được phục hồi và làm tăng hoạttính papain Để thu được hoạt tính cao nhất thì thích hợp là dùng hỗn hợp cysteine vàEDTA, trong đó cysteine đóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai tròchất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ

- Papain bị kìm hãm ( ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hóa như: O2, O3,H2O2, iodur acetate, cysteine và các hợp chất disufur khác Các chất này phản ứng vớinhóm –SH ở tring tâm hoạt động của papain làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó

- Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp papain tácdụng với chloromethul cetone của Phe và Lys thì mất hoàn toàn hoạt tính Tuy nhiênpapain lại rất bền với các tác nhân biến tính là dung môi hữu cơ ( độ quay cực của papainhầu như không biến đổi trong ethanol 70% hay urea 6-8m)

d) Phản ứng của papain

Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các acid amin, nó đóng vai trò vừanhư endopeptidase vừa như exopeptidase

e Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain Nhiệt độ: Papain là enzyme chịu được nhiệt độ tương đối cao Ở dạng nhựa khô

papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 1000C Còn ở dạng dung dịch papain bị mất hoạttính sau 30 phút ở 82.50C và nếu nhiệt độ tăng cao hơn (>1000C) thì nó sẽ bị mất hoàntoàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch

Điều này là do ở dạng dung dịch khi tăng lên đến nhiệt độ lớn hơn 1000C thì cấu trúctâm hoạt động của papain bị phá hủy hoàn toàn Điều đáng lưu ý là sau khi đã được tinhsạch và ở trạng thái tinh thể thì papain có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong nhựa, dotrong nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ papain

Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 40C bền trong nhiều tháng Trong dung dịch dẫnxuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng Trong khi đó hầu hếtcác enzyme mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự phân hủy hoặc oxy Khi thủy phân cácprotein khác nhau, thì tùy thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ thích hợp cho papain cũng khácnhau chẳng hạn đối với cơ chất là casein thì nhiệt độ tối ưu cho phản ứng là 370C Papaindạng ổn định ở trạng thái khô có thể chịu nhiệt độ sấy ở 1150C trong thời gian 2 giờ màhoạt tính vẫn duy trì được 90%

pH

: Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4.5-8.5 nhưng lại dễ biến

tính trong môi trường acid có pH < 4.5 hoặc trong môi trường kiềm mạnh có pH > 12.Khi phản ứng với cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu sẽ khácnhau Chẳng hạn, papain phản ứng với casein ở pH tối ưu là 7-7.5 Papain dạng ổn địnhtức là dạng mà cấu trúc không gian của enzyme được ổn định, có thể chịu được các pH =1.5 và pH = 8.5 trong 90 phút

Dung môi: Papain không thay đổi độ quay quang học trong dung môi là methanol

70% và không thay đổi độ nhớt trong dung môi methanol 50% Trong dung dịchdimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M không làm giảm hoạt tính

cũng như thay đổi cấu hình của papain Các chất gây biến tính mạnh như TCA 10%,guanidine hydrochloride 6M làm biến đổi bất thuận nghịch về độ quay quang học và hoạttính của papain.

CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PAPAIN3.1 Phương pháp thu nhận papain

pH: 6.5Thời gian: 30phút

Ly tâm 1

Kết tủa phân đoạn 2

Ly tâm 2Kết tinhTái kết tinh

Dịch lỏng

Dịch lỏng

60g NaCl rắn

dd NaCl bão hòa

Sơ đồ quy trình công nghệ:

t: 400C

3.1.1 Thu nhận nhựa đu đủ:

Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trải rộng khắp toàn bộ cây, ngoại trừ rễ.nhựa là hỗn hợp enzyme chứa các protease sau: papain, chymopapain A( gốc amino acidcuối là glutamic acid), chymopapain B(gốc amino aicd là tyrosine), proteinase III,proteinase IV, thilprotesase, trong đó papain chiếm tới 95%

3.1.2 Thu nhận papain:

Do trong nhựa đu đủ ngoài papain, chymopapain còn có 1 số enzyme, protein, chấtnhựa, chất cao su, chất béo và các tạp chất khác để có được quy trình tách và làm sạchpapain từ nhựa đu đủ có hiệu quả thì có quy trình hòa tan nhựa đu đủ nhằm loại bỏ tạpchất cách làm như sau:

Trộn 180g nhựa đu đủ với 100g cetile và 150g cát sạch, nghiền kĩ trong cối ở nhiệt độphòng với 200-300mL dung dịch cysteine 0.04M (hòa tan 6.3g cysteine hydrochloridetrong 1000mL dung dịch NaOH 0.054M, kiềm được sử dụng để đư pH dịch chiết tới 5.7)Khi nhựa tạo thành thể huyền phù thì gạn bỏ lớp nổi ở trên Quá trình nghiền và trích được lặp lại với 300mL dung dịch cysteine Rửa cối với dung dịch cysteine để điều chỉnh thể tích chiết lên 11

Dịch huyền phù sau cùng được lọc lạnh (có thể hút nhẹ) trên giấy lọc Whatman số 1,thời gian lọc có thể rất dài Nước lọc có màu trắng sữa hoặc vàng xanh, pH gần 5.7.Các bước còn lại của quá trình tinh sạch enzyme được tiến hành trong điều kiện lạnh

 Loại bỏ các chất không tan pH9:

Thêm từ từ và khuấy đều 1 lượng khoảng 110ml dung dịch NaOH 1M để điều chỉnh

pH của dịch chiết thu được ở trên lên pH 9 Lọc hoặc ly tâm ở 2600 vòng/phút trong 1giờ để loại bỏ tủa xám tạo thành (tủa gây biến tính protein), thu dịch trích trong

Papain