Đang tải... (xem toàn văn)
Papain là một enzym được lấy ra từ mủ của các quả đu đủ xanh
Cơng nghệ enzyme T.s Nguyễn Hồi Hương MỤC LỤC CHƯƠNG I : LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG II: GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN 2.1 Giới thiệu đu đủ 2.1.1 Giới thiệu 2.1.2 Phân bố sinh thái đu đủ 2.1.3.Hoạt tính sinh học cơng dụng số chất có đu đủ 2.2 Giới thiệu enzyme papain 2.2.1 Cysteine protease .5 2.2.2 Nguồn gốc 2.2.3 Tính chất papain .5 2.2.3.1 Tính chất vật lý 2.2.3.2 Tính chất hóa học a) Cấu tạo hóa học: b) Cấu trúc không gian c) Cấu trúc tâm hoạt động papain d) Phản ứng papain 11 e) Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác papain 13 CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PAPAIN 14 3.1 Phương pháp thu nhận papain .14 3.1.1 Thu nhận nhựa đu đủ 14 3.1.2 Thu nhận papain 14 3.2 Phương pháp tinh papain .15 3.2.1 Điện di 15 3.2.2 Lọc qua Sephadex G-75 15 CHƯƠNG IV: ỨNG DỤNG ENZYM PAPAIN THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 17 4.1 Ứng dụng enzyme papain thủy phân bánh dầu đậu phộng .17 4.1.1 Sơ đồ thực phản ứng thủy phân 17 a/ Nguyên lý chung: .17 b/ Thuyết minh quy trình chung: .18 4.1.2 Các thay đổi hóa sinh q trình thủy phân .18 Nhóm _08DSH2 -1- Cơng nghệ enzyme T.s Nguyễn Hồi Hương 4.1.3 Tính chất sản phẩm sau thủy phân .19 4.1.4 Chỉ tiêu theo dõi papain thủy phân bánh dầu đậu nành 19 4.1.5 Phương pháp xác định hoạt tính 20 a Cơ chất: 20 b Điều kiện: 20 c Phương pháp xác định hoạt độ enzyme: 20 c.1 Khái quát 20 c.2 Phương pháp xác định hoạt tính papain 21 4.2 Một số ứng dụng enzyme papain 25 4.2.1 Trong y học 25 4.2.2 Trong công nghiệp thực phẩm: 25 4.2.3 Trong ngành công nghiệp khác: .26 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN 28 Tài lệu tham khảo 29 Nhóm _08DSH2 -2- Cơng nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương CHƯƠNG I : LỜI MỞ ĐẦU Trong mủ đu đủ có ba enzyme bao gồm: papain, chymopapain peptidase Papain enzym lấy từ mủ đu đủ xanh Ngồi ra, papain cịn loại men phân giải protein tồn đu đủ Enzym papain tốt cho hệ tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn giàu protein cách dễ dàng Nó giúp phân giải loại bỏ lớp da chết bề mặt thể Papain có tác dụng tiêu hóa protid, biến đổi chất có albumin thành pepton, có tác dụng mỡ, hydrat carbon mơi trường kiềm hay trung tính Ở nhiệt độ thường cho tiếp xúc papain với lòng trắng trứng lịng trắng trứng bị tính sánh sền sệt Trung bình trái đu đủ cho 12g mủ, từ 4kg mủ đu đủ tươi cho 1kg papain khô trồng đu đủ để khai thác lấy mủ hiệu vòng - năm vòng đời đu đủ khoảng 20 năm Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ Công nghệ sinh học , chế phẩm enzyme sản xuất ngày nhiều sử dụng hầu hết lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Khoảng 75% chế phẩm enzyme thủy phân sử dụng cho việc thủy phân chất tự nhiên Với lợi ích giá trị mà enzyme papain đem lại , ứng dụng rộng rãi thường dùng lĩnh vực chế biến mỹ phẩm Ngoài ra, Papain cần cho nhiều lĩnh vực cơng nghiệp: dược phẩm, hóa chất, kỹ nghệ tơ sợi dệt may, thuộc da, thực phẩm Vì tầm quan trọng enzyme papain nhiều lĩnh vực nên nhóm chúng tơi thực đề tài: Ứng dụng enzyme papain thủy phân bánh dầu đậu phộng nhằm tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao ứng dụng chăn nuôi CHƯƠNG II: GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN Nhóm _08DSH2 -3- Cơng nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương 2.1 Giới thiệu đu đủ 2.1.1 Giới thiệu Tên khoa học: Carica papaya L., thuộc họ đu đủ - Caricac Cây đu đủ gọi thù đủ Huế, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan qua thụ, lô hong phlê (Campuchia), mắc (Lào), má hống (Thái) Đu đủ thường đồng chu, đu đủ xếp thành loại phương diện giới tính: đực, lưỡng tính Vài đu đủ trổ ba loại hoa nói Ngồi có hoa khơng hẳn hồn tồn đực, hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều đặc tính ba loại hoa Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn thời tiết gây tỉ khô hạn thay đổi nhiệt độ 2.1.2 Phân bố sinh thái đu đủ Chi Carica L có nguồn gốc vùng nhiệt đới châu Mỹ Ở vùng núi cao (1500-3000m), từ Panama đến Bolivia, đu đủ trồng giống lai tự nhiên loài C peltata Hook & Ann Vào khoảng kỷ 16, người Tây Ban Nha đưa đu đủ vào trồng vùng Caribê số nước Đông Nam Á Từ địa điểm này, tiếp tục trồng rộng rãi Ấn Độ, Srilanca, châu Đại Dương châu Phi 2.1.3 Hoạt tính sinh học cơng dụng số chất có đu đủ Nhựa đu đủ gây viêm da Nhóm _08DSH2 -4- Cơng nghệ enzyme T.s Nguyễn Hồi Hương Ở Trung Mỹ, dân gian, người ta sử dụng đu đủ để điều trị bệnh lỵamip (Entamoeba histolytica), loại ký sinh trùng gây tiêu chảy dạng lỵ biến chứng áp- xe gan Ở Samoa, người dân dùng phần vỏ thân đu đủ để chữa chứng nhức Nhựa đu đủ có chứa papain, hai loại men tiêu hủy protein (proteolytic enzymes) có tác dụng làm mềm thịt bắp Chính tác dụng này, dùng đu đủ hầm chung với thịt, thịt mềm Người dân vùng Ca-ri-bê, Trung Mỹ cho biết họ dùng phần với số lượng lớn thịt cá không ăn đu đủ xanh sau Phần cơm đu đủ thành phần loại mỹ phẩm kem (mặt), kem đánh răng, xà gội đầu Các ứng dụng quan trọng y học nhựa đu đủ chiết xuất papain để dùng phẫu thuật cột sống (là loại "dao phẫu thuật tự nhiên" để mở đĩa đệm) Nghiên cứu cho thấy chiết xuất papain có hoạt tính kháng sinh (antibioticactivity) với tác dụng chống vi khuẩn gram dương (gram-positive bacteria) Nó cịn dùng để điều trị lở loét, làm tiêu giả mạc bệnh bạch hầu, chống kết dính sau phẫu thuật, làm thuốc giúp tiêu hóa Trong công nghiệp, papain dùng để tinh chế bia; xử lý len lụa trước nhuộm; phụ gia công nghệ chế biến cao su; tinh chế dầu gan cá tuna, người ta tiêm papain vào gan trước chiết xuất, làm cho thành phẩm giàu Vitamin A D Khoảng 1,500 đu đủ xanh cỡ vừa cho khoảng 650g papain 2.2 Giới thiệu enzyme papain 2.2.1 Cysteine protease - Cysteine proteases (EC.3.4.22) nhóm protein có trọng lượng phân tử khoảng 21-30kDa, protein có khả xúc tác để thủy phân loại liên kết: peptide, amide, esterthiol Đây enzyme có nhóm –SH tâm hoạt động - Người ta tìm thấy 20 họ cysteine proteases (Barrett, 1994) nhiều enzyme số (papain, bromelain, ficain, animal cathepsins) ứng dụng rộng rãi cơng nghiệp - Có loại cysteine proteases exopeptidase ( cathepsin X, carboxypeptidase B) endopeptidases ( bromelain, ficain, cathepsin…) Exopeptidase thủy phân liên kết peptide Nhóm _08DSH2 -5- Cơng nghệ enzyme T.s Nguyễn Hồi Hương đầu N đầu C tự endopepetidase cắt đứt liên kết peptide chuỗi polypeptide 2.2.2 Nguồn gốc Papain (EC 3.4.22.3) cysteine protease biết đến nhiều phân lập lần vào năm 1879 từ nhựa trái đu đủ (Carica papaya) Đây enzyme xác định cấu trúc tinh thể (Drenth et al., 1968; Kamphuis et al., 1894) Trong nhựa đu đủ enzyme papain cịn có loại protease khác chymopapain, caricain, glycyl endopeptidase số enzyme khác (Baines and Brock-lehurst, 1979) Nhựa đu đủ có hàm lượng hoạt tính papain cao tập trung vùng có nắng nóng độ ẩm ổn định quanh năm 2.2.3 Tính chất papain 2.2.3.1 Tính chất vật lý Bảng 2.1: Tính chất vật lý papain Tính chất vật lý Giá trị Điểm đẳng điện pI = 8.75 Hằng số sa lắng S20 2.42 ± 0.04 Hằng số phân tán D20 (10-7giây.cm2) 10.27 ± 0.13 Phân tử lượng 20,700 Độ triền quang [α]D -66.70 Độ xoắn 17% Vòng hiệu ứng cotton 290nm Thể tích riêng phần V(mL/g) 0.724 Trị số ma sát f/fo 1.16 Bột màu vàng hay màu nâu nhạt, tùy thuộc phương pháp sấy, không tan hầu hết chất hữu tan phần H2O hay glycerine Bền nhiệt 2.2.3.2 Tính chất hóa học a) Cấu tạo hóa học: Nhóm _08DSH2 -6- Cơng nghệ enzyme T.s Nguyễn Hồi Hương Papain endoprotease có chứa 16% N 1.2% S Papain protease thiol, theo nghiên cứu R L Hill E L Smith, papain chuỗi polypeptide gồm 185 amino acid, trọng lượng phân tử 20.900 Dalton Bảng 2.2: Thành phần hóa học: Amino acid Số lượng Amino acid Số lượng Alanine 13 Lyeine Arginine 10 Proline Aspartic acid 17 Serine Half – Cysteine Threonie 11 Glutamid acid 17 Tryptophan Glycine 23 Tyrosine Histidine Valine 17 Isoleucine 10 Methionine 15 Leucine 10 Tổng cộng: 185 Theo kết phân tích tia X, phân tử papain cấu tạo 212 acid amin khơng có chứa methionine Phân tử lượng khoảng 23,350 Da, phân tử mạch polypeptide với đầu N isoleucine, đầu C asparagine, có gốc cysteine tạo thành cầu disulfur vị trí 22-63, 56-95, 153-200 khơng có chức sinh học, làm tăng tính bền vững cấu trúc nhóm –SH tự vị trí 25 b) Cấu trúc khơng gian Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước 36x48x36Ao mạch bị gấp thành hai phần riêng biệt khe Trung tâm hoạt động nằm bề mặt khe này, nhóm -SH hoạt động cysteine 25 nằm bên trái khe nhóm histidine 159 nằm bên phải khe Phần xoắn chiếm 20% tồn amino acid có phân tử Nhóm _08DSH2 -7- Cơng nghệ enzyme T.s Nguyễn Hồi Hương Hoạt tính papain dựa hai tâm hoạt động Cys25 His159 Khoảng pH hoạt động papain rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào chất Khi chất casein hoạt tính tối ưu papain vùng pH từ 5.7 – 7.0 nhiệt độ thích hợp 50 – 570C c) Cấu trúc tâm hoạt động papain - Tâm hoạt động papain gồm có nhóm –SH cysteine 25 nitrogen bậc histidine 159 Bên cạnh nhóm imidazole His 159 liên kết với Asp 175 liên kết hydrogen - Vùng tâm hoạt động papain chứa mạch polypeptide với amino acid là: Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys - Theo nghiên cứu Lowe, chuỗi polypeptide trung tâm hoạt động papain gần giống ficin hay trypsin, chúng có nguồn gốc khác Ficin: Arg-Glu-Glu-Gly-Glu-Cys-Gly-Ser-Cys Trypsin: Lys-Asp-Ser-Cys-Glu-Gly-Gly-Asp-Ser Nhóm _08DSH2 -8- Cơng nghệ enzyme T.s Nguyễn Hồi Hương Hoạt tính enzyme chất tác dụng: - Papain thủy phân peotein thành polypeptide polypeptide amino acid, đóng vai trị vừa endopeptidase vừa exopeptidase - Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu thành peptid: (-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)n + HOH (-NH-CH(R)-COOH)I + (H2N- CH(R)CO-)k i+k=n - Các exopeptidase thủy phân peptide thành amino acid (H2N-CH(R )-CO-NH-CH(R )-CO-)n + HOH (H2N-CH(R)-COOH)n` + (H2N-CH(R)CO-)k n`+k = n - So với protease có nguồn gốc động vật vi sinh vật khác papain có khả thủy phân sâu Tính đặc hiệu chất papain rộng có khả phân hủy hầu hết liên kết peptide trừ liên kết với proline glutamic acid có nhóm carboxy tự Papain nhận biết chuỗi gồm amino aicd chất peptide ưu tiên cắt liên kết peptide chuỗi có phenylamine sau: peptide có dạng X-Phe-Y-Z (X, Y, Z gốc amino acid) papainsex cắt vị trí Y Z, Nhóm _08DSH2 -9- Cơng nghệ enzyme T.s Nguyễn Hồi Hương peptide có dạng X-Phe-Y ( có Phe nằm vị trí thứ trước đầu tận cùng) khơng thủy phân papain - Ngồi papain cịn có hoạt tính esterase, thiolesterase trafnerase Hoạt hóa papain: Papain thể hoạt tính xác tác nhóm –SH dạng tự Vì ta sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động trung tâm hoạt động papain có tính khử nên chất hoạt hóa chất có tính khử cysteine, glytation aicd, hdrocyanic… cysteine chất hay dùng hki có mặt chất nhóm –SH papain phục hồi làm tăng hoạt tính papain Để thu hoạt tính cao thích hợp dùng hỗn hợp cysteine EDTA, cysteine đóng vai trị chất hoạt hóa papain, cịn EDTA đóng vai trị chất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có nhựa đu đủ Bất hoạt: - Papain bị kìm hãm ( ức chế bất thuận nghịch) chất oxy hóa như: O2, O3, H2O2, iodur acetate, cysteine hợp chất disufur khác Các chất phản ứng với nhóm –SH tring tâm hoạt động papain làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động - Papain bị bất hoạt thuận nghịch khơng khí, cysteine nồng độ thấp papain tác dụng với chloromethul cetone Phe Lys hồn tồn hoạt tính Tuy nhiên papain lại bền với tác nhân biến tính dung mơi hữu ( độ quay cực papain không biến đổi ethanol 70% hay urea 6-8m) d) Phản ứng papain Papain thủy phân protein thành polypeptide acid amin, đóng vai trị vừa endopeptidase vừa exopeptidase Nhóm _08DSH2 - 10 - Công nghệ enzyme 60g NaCl rắn T.s Nguyễn Hoài Hương Kết tủa phân đoạn pH : 7-7.5 thời gian: Ly tâm Kết tinh Dịch lỏng pH: 6.5 Thời gian: 30phút dd NaCl bão hịa Tái kết tinh Sấy chân khơng t: 370C t: 400C Papain 3.1.1 Thu nhận nhựa đu đủ: Nhựa đu đủ nằm ống dẫn nhựa trải rộng khắp toàn cây, ngoại trừ rễ nhựa hỗn hợp enzyme chứa protease sau: papain, chymopapain A( gốc amino acid cuối glutamic acid), chymopapain B(gốc amino aicd tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thilprotesase, papain chiếm tới 95% 3.1.2 Thu nhận papain: Chuẩn bị: Do nhựa đu đủ ngồi papain, chymopapain cịn có số enzyme, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo tạp chất khác để có quy trình tách làm papain từ nhựa đu đủ có hiệu có quy trình hịa tan nhựa đu đủ nhằm loại bỏ tạp chất cách làm sau: Trộn 180g nhựa đu đủ với 100g cetile 150g cát sạch, nghiền kĩ cối nhiệt độ phòng với 200-300mL dung dịch cysteine 0.04M (hòa tan 6.3g cysteine hydrochloride 1000mL dung dịch NaOH 0.054M, kiềm sử dụng để đư pH dịch chiết tới 5.7) Nhóm _08DSH2 - 15 - Cơng nghệ enzyme T.s Nguyễn Hồi Hương Khi nhựa tạo thành thể huyền phù gạn bỏ lớp Quá trình nghiền trích lặp lại với 300mL dung dịch cysteine Rửa cối với dung dịch cysteine để điều chỉnh thể tích chiết lên 11 Dịch huyền phù sau lọc lạnh (có thể hút nhẹ) giấy lọc Whatman số 1, thời gian lọc dài Nước lọc có màu trắng sữa vàng xanh, pH gần 5.7 Các bước cịn lại q trình tinh enzyme tiến hành điều kiện lạnh Loại bỏ chất không tan pH9: Thêm từ từ khuấy lượng khoảng 110ml dung dịch NaOH 1M để điều chỉnh pH dịch chiết thu lên pH Lọc ly tâm 2600 vòng/phút để loại bỏ tủa xám tạo thành (tủa gây biến tính protein), thu dịch trích Quá trình phân đoạn (NH4)2SO4: Cho (NH4)2SO4 vào dịch enzyme đến 40% độ bão hòa, sau 1-2 giờ, ly tâm 2500 vòng/ phút Thu nhận tủa, bỏ dịch lỏng giữ lại lấy chymopapain Tủa rửa lại lần với 400-500ml dung dịch (NH4)2SO4 40% độ bão hịa Q trình phân đoạn NaCl: Hòa tan 600mL dung dịch cysteine 0.02M, dung dịch thu có pH 7- 7.5 sau thêm từ từ 60g NaCl rắn Sau giờ, ly tâm 2500 vòng/phút để thu tủa, bỏ dich lỏng Kết tinh Hòa tan tủa với 400mL dung dịch cysteine 0.002M nhiệt độ phòng dung dịch huyền phù có pH = 6.5 Giữ nhiệt độ phòng 30 phút để tinh thể tạo thành, trì 40C qua đêm, sau ly tâm lạnh 2500 vòng/ phút 4-5 để thu nhận tinh thể Tái kết tinh: Hòa tan tinh thể thu bước nước cất nhiệt độ phịng tạo dung dịch có nồng độ protein khoảng 1% Sau cho vào từ từ ( đồng thời khuấy đều) dung dich NaCl bão hào ( 10mL/ 300mL dung dịch protein) Khi 75% thể tích dung dịch NaCl cho vào, papain bắt đầu kết tinh nhiệt độ phòng Dịch huyền phù giữ 0C qua đêm, sau ly tâm lạnh 2500 vịng/ phút 4-5 thu nhận tinh thể Hoạt động riêng enzyme tăng nhẹ tiến hành tái kết tinh thêm lần Nhóm _08DSH2 - 16 - Cơng nghệ enzyme T.s Nguyễn Hồi Hương Để tăng hoạt tính enzyme, trước tái kết tinh hịa tan tinh thể papain dung dịch đệm phosphate chứa cysteine, sau tiến hành siêu lọc với màng lọc 4000A0 đem kết tinh dịch lỏng thu sau siêu lọc Sấy chân không Sấy chân không nhiệt độ 400C thu nhận papain tinh chế 3.2 Phương pháp tinh papain 3.2.1 Điện di: Sử dụng gel polyacrylamide 12%, dung dịch đệm beta-alanine 34mM, pH = 4.3 cường độ dòng điện không đổi 4mM mẫu chuẩn bị Tris-glycerol-betamercatoethanol cho vào nước sôi 40 giây Gel màu thuốc thử Coomassie-Blue R-250 Brilliant Blue G-colloidal 3.2.2 Lọc qua Sephadex G-75: Để xác định phân tử lượng papain, ta dùng cột Sephadex G-75 có kích thước cột 1.1x100 cm cột cân trước dung dịch đệm gồm sodium phosphate 0.1M dung dịch EDTA ( ethylenediamine-tetraacetic aicd) pH=7 Nhóm _08DSH2 - 17 - Cơng nghệ enzyme T.s Nguyễn Hồi Hương CHƯƠNG IV: ỨNG DỤNG ENZYM PAPAIN THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 4.1 Ứng dụng enzyme papain thủy phân bánh dầu đậu phộng 4.1.1 Sơ đồ thực phản ứng thủy phân Enzyme papain (khô) Bánh dầu đậu phộng xay nhuyễn Thủy giải dd đệm phosphate 0.1M t: 1500C pH : 8-8.5 thời gian: Lọc ly tâm Dịch lọc Sản phẩm thu dạng dung dịch lỗng Nhóm _08DSH2 Bã sau lọc Bất hoạt enzym O2, O3, H2O2, iodur acetate - 18 - Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hồi Hương Cơ đặc Sản phẩm đậm đặc khô Sơ đồ thủy phân a/ Nguyên lý chung: Quá trình chuyển từ protein bánh đậu phộng thành acid amin trình phức tạp Dưới điều kiện thích hợp cho q trình thủy phân, enzyme tham gia phản ứng theo sơ đồ sau: E + S ESS + P - Người ta cho ban đầu enzyme liên kết với chất (bánh dầu đậu phộng), sau diễn thủy giải tạo sản phẩm acid amin đoạn peptid ngắn - Ở E enzyme papain S protein đậu phộng, ES phức hợp trung gian enzyme chất, P sản phẩm (chủ yếu acid amin peptid cấp thấp) Sự tạo thành chuyển biến hợp chất trung gian ES xảy qua bước: Bước 1: Enzyme kết hợp với protein tạo thành phức enzyme – protein (ES) Bước 2: Có thay đổi mật độ điện tử biến dạng hình học mối liên kết đồng hóa trị phân tử chất S trung tâm hoạt động E Bước 3: Giai đoạn tạo thành acid amin hay peptid cấp thấp giải phóng enzyme b/ Thuyết minh quy trình chung: Bánh dầu đậu phộng sau xay nhuyễn ta bổ sung enzyme khô papain dd đệm phosphate 0.1M để trình phân giải bánh dầu nhanh hơn, trình thủy phân thực nhiệt độ 1500C với pH = 8-8.5, thời gian thủy phân 1- Sau trình thủy giải ta đem ly tâm nhằm thu dịch lỏng ( loại bỏ bã ) đồng thời ta bổ sung chất O2,O3,H2O2, iodur acetate … Làm cho enzyme không hoạt động để thu sản phẩm loãng Nhưng nhà sản xuất muốn sản phẩm đạt chất lượng Nhóm _08DSH2 - 19 - Cơng nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương cao bảo quản dễ dàng người ta thường cô đặc sản phẩm tao sản phẩm khô ta kết thúc trình thủy phân enzyme papain Mục đích người ta dùng enzyme papain dể thủy phân bánh dầu đậu phộng nhằm cung cấp them acid amin có enzyme vào bánh dầu, để bổ sung vào thức ăn cho gia súc cho người 4.1.2 Các thay đổi hóa sinh q trình thủy phân: - Những nghiên cứu liên kết enzyme chất đề giả thuyết: phần lớn enzyme trở nên hấp thụ với bề mặt protein đậu phộng theo tiến trình tương đối nhanh, sau khuếch tán phân tử enzyme vào thành phần xảy chậm Sự thủy phân nối peptid protein đậu phộng chia làm hai pha: + Pha nhanh (pha động): xảy giai đoạn đầu Trong suốt pha này, số lớp peptid bị phá hủy đơn vị thời gian phần chất hịa tan phóng thích vào dung dịch + Pha chậm (pha tĩnh): tốc độ thủy phân sau giảm, tiến trình có thay đổi phản ứng thủy phân kết thúc 4.1.3 Tính chất sản phẩm sau thủy phân - Tính chất quan trọng sản phẩm tính dinh dưỡng Chiều dài chuỗi peptid sản phẩm thủy phân có tầm quan trọng đặc biệt Khả hòa tan, khả nhũ tương, vị đắng …đều phụ thuộc nhiều vào kích thước trọng lượng phân tử loại proteint có sản phẩm Tất sản phẩm thủy phân có vị đắng mức độ khác làm hạn chế nhiều tính cảm quan sản phẩm Vị đắng nhược điểm chung sản phẩm thủy phân với xúc tác enzyme cho có liên quan đến peptid có trọng lượng phân tử thấp (khoảng 6,000 Da) Ta khử vị đắng giảm bớt cách kiểm soát mức độ thủy phân peptid có phân tử lượng lớn chiếm ưu Nhóm _08DSH2 - 20 - Cơng nghệ enzyme T.s Nguyễn Hồi Hương - Việc sử dụng enzyme làm xúc tác có nhược điểm thủy phân không triệt để, sau thủy phân cịn khoảng 20% nitơ tổng số khơng tan, người ta thường phối hợp thủy phân hóa chất để nâng cao hiệu suất thủy phân 4.1.4 Chỉ tiêu theo dõi papain thủy phân bánh dầu đậu nành Chúng điều chế enzyme papain để thủy phân protein bánh dầu đậu phộng với nội dung sau: Thu nhận enzyme papain từ nhựa trái đu đủ - Khảo sát điều kiện thu nhận enzyme papain - Định lượng hoạt tính enzyme papain sau giai đoạn tinh chế - Khảo sát biến đổi lượng hoạt tính enzyme papain theo thời gian - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain Khảo sát phản ứng thủy phân bánh dầu đậu phộng - Xác định hàm lượng đạm formol đạm amoniac theo thời gian phản ứng - Khảo sát thay đổi hàm lượng xúc tác, pH nhiệt độ ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng thủy phân 4.1.5 Phương pháp xác định hoạt tính a Cơ chất: - Protease nhựa đu đủ - Cơ chất casein từ sừa b Điều kiện: - Papain dùng để thủy phân casein nhiệt độ tối ưu 50 đến 570C - Ngồi papain hoạt động tốt phải tạo môi trường pH tối ưu 7.0 đến 7.5 hợp chất dung mơi phù hợp cho q trình phản ứng c Phương pháp xác định hoạt độ enzyme: c.1 Khái quát: - Để xác định hoạt độ enzyme dịch chiết chế phẩm người ta thường dùng phương pháp vật lý hóa học Các phương pháp, so màu, đo khí, đo độ phân Nhóm _08DSH2 - 21 - Cơng nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương cực, đo độ nhớt, chuẩn độ dùng phổ biến nghiên cứu định lượng phản ứng enzyme - Có thể chia ba nhóm phương pháp sau: Đo lượng chất bị hay lượng sản phẩm tạo thành thời gian định ứng với nồng độ enzyme xác định Đo thời gian cần thiết để thu lượng biến thiên định chất hay sản phẩm với nồng độ enzyme định Chọn nồng độ enzyme để thời gian định thu biến thiên định chất hay sản phẩm - Đơn vị đo hoạt độ enzyme: Hội nghị quốc tế hóa sinh enzyme đưa khái niệm đơn vị enzyme quốc tế (hoặc đơn vị enzyme tiêu chuẩn) vào năm 1961 Đơn vị hoạt độ enzyme (U) lượng enzyme có khả xúc tác làm chuyển hóa micromole (1mmol) chất sau phút điều kiện tiêu chuẩn U = 1mmol chất (10-6 mol)/ phút Từ năm 1972 người ta lại đưa thêm khái niệm Katal (Kat): - Katal (Kat) lượng enzyme có khả xúc tác làm chuyển hóa mol chất sau giây điều kiện tiêu chuẩn Kat = 6.107 U Và U 60= microkatal Đối với chế phẩm enzyme, việc xác định mức độ hoạt động cần phải đánh giá độ Đại lượng đặc trưng cho độ chế phẩm enzyme hoạt độ riêng - Hoạt độ riêng chế phẩm enzyme số đơn vị enzyme/ 1mg protein (U/mg) 1g chế phẩm ml dung dịch enzyme - Thông thường hàm lượng protein xác định phương pháp Lowry Khi biết khối lượng phân tử enzyme tính hoạt độ phân tử - Hoạt độ phân tử số phân tử chất chuyển hóa phân tử enzyme đơn vị thời gian c.2 Phương pháp xác định hoạt tính papain: Nhóm _08DSH2 - 22 - Cơng nghệ enzyme T.s Nguyễn Hồi Hương Để xác định hoạt tính protease nhóm chúng em sử dụng phương pháp Anson cải tiến Phương pháp thực sau: Nguyên lý phương pháp Casein bị phân giải môi trường kiềm tác dụng protease tạo sản phẩm đoạn peptide ngắn hòa tan tricloroacetic acid (TCA), xác định lượng tyrosine tryptophan hòa tan thuốc thử Folin Đối tượng áp dụng phương pháp Phương pháp áp dụng để xác định hoạt độ enzyme thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, chế phẩm sinh học Dụng cụ hoá chất Dụng cụ, thiết bị - Máy lắc - Máy đo mật độ quang - Bếp ổn nhiệt - Bình tam giác 250 ml - Bình định mức 10 ml, 100 ml, 500ml - Ống nghiệm - Pipet ml, ml, 10 ml Hoá chất - Dung dịch Na2HPO4 1/15M: hòa tan 5,9690g Na2HPO4.12H2O nước vừa đủ 250 ml Nhóm _08DSH2 - 23 - Cơng nghệ enzyme T.s Nguyễn Hồi Hương - Dung dịch KH2PO4 1/15M : hịa tan 0,9072 g KH2PO4 nước vừa đủ 100 - Dung dịch đệm Sorensen pH 7,6: trộn chung 88,5 ml dung dịch Na 2HPO4 ml 1/15M với 11,5 ml dung dịch KH2PO4 1/15M đến pH đạt 7,6 - Dung dịch casein 1%: pha 1g Casein 100 ml dung dịch đệm Sorensen - Dung dịch TCA 5%: hòa tan g TCA nước cho đủ 100 ml - Dung dich NaOH 0,5N: hòa tan 10 g NaOH nước cho đủ 500 ml - Thuốc thử Folin ( pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1:4) - Dung dich HCl 0,2N: trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 250 ml - Dung dịch Tyrosine 20 µM/l : khuấy nghiền 1,8119 g Tyrosin dung dịch HCl 0,2N vừa đủ 500 ml - Dung dịch Tyrosin chuẩn µM/l dung dịch HCl 0,2N: pha lỗng ml dung dịch Tyrosine 20 µM/l dung dịch HCl 0,2N thành 100 ml Chuẩn bị đường chuẩn Chuẩn bị dung dịch tyrosin chuẩn - Từ dung dịch tyrosin chuẩn µM/l , xây dựng đường chuẩn với dung dịch tyrosin có nồng độ từ 0,2 - 1,0 µM/l Dung dịch hóa chất Ống nghiệm Dung dịch tyrosine chuẩn (ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Lượng tyrosine tương ứng (µM) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 5,0 Dung dịch HCl 0,2N (ml) 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 5,0 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 10 10 10 10 10 10 Nhóm _08DSH2 - 24 - Cơng nghệ enzyme T.s Nguyễn Hồi Hương Thuốc thử Folin (ml) 3 3 3 Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD bước sóng 660nm Ống số ống kiểm chứng (KC), ống cịn lại ống thí nghiệm (TN) Vẽ đường chuẩn tyrosine tương quan tương quan lượng tyrosine (µM) ΔOD (ΔOD = ODTN ODKC ) Phương pháp tiến hành Chiết mẫu Mẫu cân xác 10g ( mẫu rắn) 10 ml (đối với mẫu lỏng) cho vào becher, định mức vừa đủ 100ml nước cất đem lắc máy lắc vòng 15 phút Đem ly tâm lạnh với 4000 vòng/ phút 10 phút, thu dịch, bỏ bã (đối với mẫu lỏng không cần ly tâm, lắc để đồng mẫu) Tiến hành Lấy ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm ống thử thật, ống thử không ống nghiệm Dung dịch Thử thật Thử không Dung dịch casein 1%(ml) 5 Dung dịch TCA 5%(ml) 0 Dung dịch enzyme mẫu (ml) 1 Lắc giữ 35,50C 20 phút Dung dịch TCA 5% (ml) 10 Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên Nhóm _08DSH2 - 25 - Cơng nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương Lấy ống nghiệm khác,cho vào ống thứ 5ml dịch lọc ống thử thật cho vào ống thứ hai 5ml dịch lọc cùa ống thử không Tiếp tục thêm vào ống 10ml NaOH 0,5N 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút đo OD bước sóng 660nm ΔOD = ODTT – ODTK, sau dựa vào đồ thị chuẩn suy µM tyrosine Tính kết quả: Định nghĩa đơn vị Anson: đơn vị Anson lượng enzyme tối thiểu điều kiện thí nghiệm ( 35,5oC: pH 7,6 … ) thủy phân casein phút tạo thành sản phẩm hòa tan TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD bước sóng 660nm tương ứng với µM tyrosine đường chuẩn Hđ Protease (UI/g)= Hđ Protease (UI/g)/ t * m * v Với: Hđ Protease : hoạt độ enzyme protease ( UI/g) V : tổng thể tích hỗn hợp ống thử thật ống thử khơng (ml) v : thể tích dịch lọc đem phân tích (ml) 4.2 Một số ứng dụng enzyme papain 4.2.1 Trong y học: • Chữa bệnh giun kim, gium đũa • Dùng tiêu diệt dị vật thừa, protein chết thể Hỗn hợp papainbromelin-celluloza sử dụng hiệu để phá sỏi thận • Làm thành phần loại thuốc trị bệnh biếng ăn, ăn khơng tiêu • Làm sổ vi trùng gram (+) gram (-) ngưng phát triển, vi trùng thương hàn, Staphylococus nhạy cảm với papain • Papain có tác dụng giảm độc tố với toxin toxabumin: • Dung dịch papain cysteine salicilate có cơng dụng chữa bỏng Nhóm _08DSH2 - 26 - Cơng nghệ enzyme T.s Nguyễn Hồi Hương • Papain có tác dụng lên hệ mạch dùng trị bệnh bạch cầu, viêm họng… 4.2.2 Trong cơng nghiệp thực phẩm: - Protease, có papain sử dụng rộng rãi chế biến thịt, cá mang lại hiệu kinh tế cao Với phương pháp này, người ta biến đổi loại thịt cá rẻ tiền, khô cứng, phần khơng ngon thành chế phẩm có tính chất tốt - Papain dùng để thủy phân protein ngăn ngừa vi khuẩn gây thối, nhiệt độ tối ưu 700C - Papain dùng để làm mềm thịt, dùng để thủy phân gan cá ngừ làm thuốc bổ Papain dùng sản xuất bia giúp tiêu hóa protein cịn hịa tan bia 4.2.3 Trong ngành cơng nghiệp khác: - Papain dùng làm mềm da ngành công nghiệp thuộc da, dùng tẩy vết máu quần áo - Trong công nghiệp mỹ phẩm, papain dùng để tẩy vết nám, tàn nhang da, làm cho da mềm mại Nhóm _08DSH2 - 27 - Cơng nghệ enzyme T.s Nguyễn Hồi Hương Loại mặt nạ dưỡng da có chứa enzyme papain dưỡng chất đu đủ CHƯƠNG V: KẾT LUẬN Việc sản xuất chế phẩm enzyme loại phát triễn mạnh mẽ qui mô công nghiệp Hiện có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán thị trường giới, Các chế phẩm enzyme phổ biến amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, glucoseoxydase… Chế phẩm enzyme không ứng dụng y học mà ứng dụng nhiều lãnh vực công nghiệp khác nhau, nơng nghiệp, hóa học… “ý nghĩa việc sử dụng enzyme lãnh vực thực tế không so với ý nghĩa việc sử dụng lượng nguyên tử” Đã có nghiên cứu ứng dụng enzyme papain thủy phân đậu nành, chế biến thịt, sản xuất mỹ phẩm… Nhóm _08DSH2 - 28 - Cơng nghệ enzyme T.s Nguyễn Hồi Hương Tài liệu tham khảo [1] Đồng Thị Thanh Thu, Sinh hóa ứng dụng, NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh, 2003 [2] Lê Mỹ Hồng, Giáo trình Cơng nghệ chế biến thực phẩm đóng hộp, Đại học Cần Thơ, 2005, trang 19, 101-102 [3] Mai Xuân Lương, Giáo trình Enzym, Đại học Đà Lạt, 2005, trang 65-66, 75 [4] Trần Xuân Hiển, Giáo trình điện tử Nguyên liệu bảo quản chế biến nông sản thực phẩm, Đại học An Giang, 2005, chương 2, mục 2.5.3 [5] TS Nguyễn Tiến Thắng, Giáo trình Cơng Nghệ Enzym Một số website: 5.http://en.wikipedia.org/wiki/Papain 6.http://tamleftcseminar.googlepages.com/Banhmi.Doc 7.http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=1094 Nhóm _08DSH2 - 29 - ... thực phẩm Vì tầm quan trọng enzyme papain nhiều lĩnh vực nên nhóm chúng tơi thực đề tài: Ứng dụng enzyme papain thủy phân bánh dầu đậu phộng nhằm tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao ứng dụng chăn. .. enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương CHƯƠNG IV: ỨNG DỤNG ENZYM PAPAIN THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 4.1 Ứng dụng enzyme papain thủy phân bánh dầu đậu phộng 4.1.1 Sơ đồ thực phản ứng thủy phân Enzyme papain. .. phối hợp thủy phân hóa chất để nâng cao hiệu suất thủy phân 4.1.4 Chỉ tiêu theo dõi papain thủy phân bánh dầu đậu nành Chúng điều chế enzyme papain để thủy phân protein bánh dầu đậu phộng với