Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá

Sử dụng dung môi kết tủa là ethanol với tỷ lệ dịch trích ly và ethanol theo thểtích là 50 : 50 cho tủa có hoạt tính riêng của lipase cao nhất là 7,5187 µmol/h.mg.Trong quá trình bảo quản

Lời cảm ơn

Để hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ từ rất nhiềuphía Trước hết, tôi xin cảm ơn Bộ môn Kỹ thuật Thực phẩm, Khoa Kỹthuật Hoá học, trường Đại học Bách khoa Tp HCM đã tạo môi trường chotôi học tập và nghiên cứu trong thời gian thực hiện luận văn

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quí thầy cô đã truyền đạtnhững kiến thức và kinh nghiệm làm việc quý báu trong gần năm năm ngồighế giảng đường

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến cô Trần BíchLam đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo cho em trong thời gian làm luận vănvừa qua

Con xin cảm ơn ba mẹ đã hết lòng yêu thương, chăm sóc và cổ vũtinh thần cho con

Cuối cùng tôi xin gửi lòng biết ơn đến tất cả các bạn trong khoa đãgiúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn này

Ngày tháng năm Phạm Thị Hồng Nga

Tóm tắt luận văn

Đề tài “Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá” nhằm khảo sát hoạt tính

của các enzyme trong nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus) và nghiên cứu thu

nhận chế phẩm enzyme thô

Các số liệu thực nghiệm về việc so sánh giữa mẫu nội tạng có mật và bỏ mậtcho thấy ở mẫu có mật hoạt tính riêng của enzyme amylase thấp hơn; hoạt tínhriêng enzyme protease cao hơn; và hoạt tính riêng của enzyme lipase thì cao hơnmẫu bỏ mật

Đáng chú ý là hoạt tính riêng lipase cao nên việc thu nhận chế phẩm tập trungtheo hướng tối ưu hóa điều kiện trích ly enzyme này

Quá trình trích ly tiến hành ở nhiệt độ 300C; thời gian trích ly là 2,5 h; pH dungmôi trích ly (dung dịch Na2CO3) là 9; tỷ lệ nội tạng và dung môi trích ly là 1 : 2,5(theo khối lượng) thu được dịch trích ly có hoạt tính riêng của lipase cao nhất1,4257 µmol/h.mg

Sử dụng dung môi kết tủa là ethanol với tỷ lệ dịch trích ly và ethanol (theo thểtích) là 50 : 50 cho tủa có hoạt tính riêng của lipase cao nhất là 7,5187 µmol/h.mg.Trong quá trình bảo quản lạnh đông, hoạt tính riêng của enzyme lipase giảmtheo hàm số mũ Error: Reference source not found (với y là

hoạt tính riêng lipase, x là ngày bảo quản)

MỤC LỤC

TRANG BÌA I

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN

LỜI CẢM ƠN I TÓM TẮT LUẬN VĂN II MỤC LỤC III DANH SÁCH HÌNH VẼ VI DANH SÁCH BẢNG BIỂU VII CHƯƠNG 1 LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Nguyên liệu 4

2.1.1 Cá da trơn 4

2.1.2 Cá tra 5

2.1.3 Tình hình sản xuất tại Việt Nam 7

2.1.4 Lượng phế liệu và tận dụng phế liệu 8

2.2 Enzyme hệ tiêu hóa 10

2.2.1 Đặc điểm chung của enzyme hệ tiêu hóa 10

2.2.2 Sự sản sinh enzyme hệ tiêu hóa 11

2.2.3 Đặc điểm và tính chất của một số enzyme hệ tiêu hóa 12

2.2.4 Enzyme trong hệ tiêu hóa của cá và hoạt động của chúng 20

2.3 Ứng dụng của chế phẩm enzyme hệ tiêu hóa 24

2.4 Các phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme [3] 25

2.4.1 Phương pháp trích ly và kết tủa bằng muối 25

2.4.2 Phương pháp trích ly và kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ 26

2.4.3 Phương pháp sử dụng pH 27

2.4.4 Các quy trình thu nhận chế phẩm enzyme 27

2.4.5 Phương pháp tách và làm sạch enzyme 30

2.4.6 Một số chế phẩm enzyme từ động vật [3] 32

2.5 Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme 34

2.5.1 Một số điểm cần lưu ý khi xác định hoạt tính enzyme [3] 34

2.5.2 Enzyme amylase 34

2.5.3 Enzyme protease 36

2.5.4 Enzyme lipase [11] 36

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47

3.1 Nguyên liệu 48

3.2 Hóa chất 48 3.3 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 48

3.4 Phương pháp nghiên cứu 50

3.4.1 Sơ đồ nghiên cứu 50

3.4.2 Quy trình và thuyết minh 51

3.5 Phương pháp xác định hàm lượng protein 53

3.6 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 54

3.6.1 Hoạt tính enzyme amylase [2, 4] 54

3.6.2 Hoạt tính enzyme protease [1] 55

3.6.3 Hoạt tính enzyme lipase 57

3.6.4 Hoạt tính riêng của enzyme 58

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 60

4.1 Xây dựng đường chuẩn 61

4.2 So sánh mẫu có mật và không có mật 62

4.3 Tối ưu quá trình trích ly 74

4.3.1 Khảo sát thời gian trích ly 74

4.3.2 Khảo sát tỷ lệ dung môi trích ly 77

4.3.3 Khảo sát pH dung môi trích ly 80

4.3.4 Khảo sát nhiệt độ trích ly 84

4.3.5 Tối ưu quá trình trích ly 86

4.4 Khảo sát quá trình kết tủa thu enzyme thô 91

4.5 Sự giảm hoạt tính của enzyme theo thời gian 96

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 99

5.1 Kết luận 100 5.2 Kiến nghị 100

TÀI LIỆU THAM KHẢO 101

DANH SÁCH HÌNH VẼ

HÌNH 2 ﾧ.1 CÁ TRA 5

HÌNH 2 ﾧ.2 MỘT SỐ ENZYME TRONG HỆ TIÊU HÓA CỦA ĐỘNG VẬT .12 HÌNH 2 ﾧ.3 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ LÊN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME AMYLASE 13

HÌNH 2 ﾧ.4 ẢNH HƯỞNG CỦA KETENE LÊN HOẠT TÍNH CỦA ENZYM AMYLASE 14

HÌNH 2 ﾧ.5 HOẠT TÍNH AMYLASE Ở CÁ DA TRƠN RĂNG NHỌN 21

HÌNH 2 ﾧ.6 HOẠT TÍNH PROTEASE Ở CÁ DA TRƠN RĂNG NHỌN 21

HÌNH 2 ﾧ.7 HOẠT TÍNH CỦA ENZYME HỆ TIÊU HÓA CỦA CÁ DA TRƠN Ở BRAZIN 23

HÌNH 2 ﾧ.8 SƠ ĐỒ THU NHẬN ENZYME BẰNG PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VỚI ACETON 28

HÌNH 2 ﾧ.9 SƠ ĐỒ TÁCH CHIẾT ENZYME BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA BẰNG MUỐI (NH4)2SO4 29

HÌNH 3 ﾧ.10 CẤU TẠO CÁ 48

HÌNH 4 ﾧ.11 ĐƯỜNG CHUẨN PROTEIN 61

HÌNH 4 ﾧ.12 ĐƯỜNG CHUẨN TYROSIN 62

HÌNH 4 ﾧ.13 SỰ TÁCH LỚP CỦA MẪU SAU TRÍCH LY THỰC HIỆN QUÁ TRÌNH LY TÂM (1-LỚP BÃ, 2-LỚP DỊCH TRÍCH LY, 3-LỚP MỠ, 4-LỚP DẦU) 63

HÌNH 4 ﾧ.14 NỒNG ĐỘ PROTEIN TRONG MẪU M VÀ MẪU BM 64

HÌNH 4 ﾧ.15 SO SÁNH HOẠT TÍNH ENZYME AMYLASE CỦA MẪU M, VÀ MẪU BM 67

HÌNH 4 ﾧ.16 SO SÁNH HOẠT TÍNH ENZYME PROTEASE CỦA MẪU M, VÀ MẪU BM 68

HÌNH 4 ﾧ.17 SO SÁNH HOẠT TÍNH ENZYME LIPASE CỦA MẪU M, VÀ MẪU BM 69 HÌNH 4 ﾧ.18 SO SÁNH HOẠT TÍNH RIÊNG ENZYME CỦA MẪU M, VÀ MẪU BM 72 HÌNH 4 ﾧ.19 SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH PROTEASE KIỀM Ở MỘT SỐ LOÀI CÁ [19] 73 HÌNH 4 ﾧ.20 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN TRÍCH LY ĐẾN HOẠT TÍNH RIÊNG ENZYME LIPASE 76 HÌNH 4 ﾧ.21 ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ NỘI TẠNG VÀ DUNG MÔI TRÍCH

LY ĐẾN HOẠT TÍNH RIÊNG ENZYME LIPASE 80 HÌNH 4 ﾧ.22 ẢNH HƯỞNG CỦA PH DUNG MÔI TRÍCH LY ĐẾN HOẠT TÍNH RIÊNG ENZYME LIPASE 83 HÌNH 4 ﾧ.23 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ TRÍCH LY ĐẾN HOẠT TÍNH RIÊNG ENZYME 86 HÌNH 4.24 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN TRÍCH LY, TỶ LỆ DUNG MÔI TRÍCH LY VÀ NỘI TẠNG LÊN HOẠT TÍNH ENZYME LIPASE 91 HÌNH 4 ﾧ.25 ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ DỊCH TRÍCH LY VÀ ETHANOL LÊN NỒNG ĐỘ PROTEIN TAN 93 HÌNH 4 ﾧ.26 ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ DỊCH TRÍCH LY VÀ ETHANOL LÊN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME LIPASE 94 HÌNH 4 ﾧ.27 ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ DỊCH TRÍCH LY VÀ ETHANOL LÊN HOẠT TÍNH RIÊNG CỦA ENZYME LIPASE 95

DANH SÁCH BẢNG BIỂU

B NG 2 Ả ﾧ.1 THÀNH PHẦN THỨC ĂN TRONG RUỘT CÁ TRA NGOÀI TỰ NHIÊN 7

B NG 2 Ả ﾧ.2 KHỐI LƯỢNG CÁC PHẦN KHÁC NHAU CỦA CÁ TRA 7

B NG 2 Ả ﾧ.3 LƯỢNG ENZYME CỦA TUYẾN TỤY 33

B NG 4 Ả ﾧ.4 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN PROTEIN 61

B NG 4 Ả ﾧ.5 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN TYROSIN 62

B NG 4 Ả ﾧ.6 NỒNG ĐỘ PROTEIN TRONG DỊCH TRÍCH LY CỦA MẪU CÓ MẬT (M) VÀ MẪU BỎ MẬT (BM) 64

B NG 4 Ả ﾧ.7 HOẠT TÍNH ENZYME AMYLASE TRONG NỘI TẠNG CÁ, SO SÁNH GIỮA MẪU M VÀ MẪU BM 66

B NG 4 Ả ﾧ.8 HOẠT TÍNH ENZYME PROTEASE TRONG NỘI TẠNG CÁ, SO SÁNH GIỮA MẪU M VÀ MẪU BM 67

B NG 4 Ả ﾧ.9 HOẠT TÍNH ENZYME LIPASE TRONG NỘI TẠNG CÁ, SO SÁNH GIỮA MẪU M VÀ MẪU BM 68

B NG 4 Ả ﾧ.10 HOẠT TÍNH RIÊNG CỦA CÁC ENZYME TRONG NỘI TẠNG CÁ, SO SÁNH GIỮA MẪU M VÀ MẪU BM 70

B NG 4 Ả ﾧ.11 SỰ THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ PROTEIN THEO THỜI GIAN

TRÍCH LY 82

B NG 4 Ả ﾧ.19 SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH RIÊNG LIPASE THEO PH DUNG MÔI TRÍCH LY 83

B NG 4 Ả ﾧ.20 SỰ THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ PROTEIN THEO NHIỆT ĐỘ TRÍCH LY (T) 84

B NG 4 Ả ﾧ.21 SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH LIPASE THEO NHIỆT ĐỘ TRÍCH LY 85

B NG 4 Ả ﾧ.22 SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH RIÊNG LIPASE THEO NHIỆT ĐỘ TRÍCH LY 85

B NG 4 Ả ﾧ.23 BỐ TRÍ QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM 87

B NG 4 Ả ﾧ.24 NỒNG ĐỘ PROTEIN 87

B NG 4 Ả ﾧ.25 HOẠT TÍNH LIPASE 87

B NG 4 Ả ﾧ.26 HOẠT TÍNH RIÊNG LIPASE 88

B NG 4 Ả ﾧ.27 MA TRẬN QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM 88

B NG 4 Ả ﾧ.28 Ý NGHĨA CỦA CÁC HỆ SỐ ĐƯỢC KIỂM ĐỊNH THEO TIÊU CHUẨN T 89

B NG 4 Ả ﾧ.29 SỰ THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ PROTEIN THEO TỶ LỆ DỊCH TRÍCH LY VÀ ETHANOL 92

B NG 4 Ả ﾧ.30 SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH LIPASE THEO TỶ LỆ DỊCH TRÍCH LY VÀ ETHANOL 94

B NG 4 Ả ﾧ.31 SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH RIÊNG LIPASE THEO TỶ LỆ DỊCH TRÍCH LY VÀ ETHANOL 95

Chương 1 Lời mở đầu

Hàng năm, sản lượng khai thác thủy hải sản trên thế giới đạt tới hàng trăm triệutấn, 50% trong số đó được dùng để chế biến làm thức ăn cho con người Nhưng chỉkhoảng 30% của sản lượng này thật sự được con người tiêu thụ, phần còn lại là phế

phụ phẩm [23]

Trong những năm gần đây diện tích và sản lượng nuôi trồng thủy sản ở nước tatăng cao, đặc biệt là nuôi cá tra và cá basa đạt một doanh thu đáng kể, đem lạinhiều lợi nhuận cho các doanh nghiệp Trong năm 2006, sản lượng cá tra cả nướctăng, đạt hơn 1,5triệu tấn Sản lượng tăng cao thì mối quan tâm về nguồn phế liệucũng tăng cao Theo thống kê, mỗi ngày các nhà máy chế biến tung ra thị trườnghơn 2000 tấn phế phụ phẩm gồm xương, đầu, mỡ, da cá ; trong đó nội tạng chiếm12,04% về khối lượng, khoảng 240 tấn

Phụ phẩm từ ngành công nghiệp chế biến cá bao gồm đầu, nội tạng, da, vây vàxương cá Chúng được tận dụng để chế biến bột cá, dầu cá và một số dưỡng chấtcó giá trị khác Bột cá là thường dùng làm thức ăn gia súc, gia cầm, trong khi dầucá và các dưỡng chất khác có những ứng dụng to lớn trong nhiều lĩnh vực khácnhau như công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và y học Vì vậy, việc tận thu phụphẩm cá là một việc làm đúng đắn và cần thiết nhằm nâng cao hiệu quả sử dụngnguồn nguyên liệu cũng như góp phần giảm thiểu nguồn chất thải từ ngành côngnghiệp chế biến cá

Một sản phẩm thương phẩm có giá trị cao trong nội tạng cá chưa được quan tâmđó là enzyme tiêu hóa của cá gồm có enzyme protease như pepsin, trypsin …,enzyme amylase, và enzyme lipase … , Nếu tận thu được nguồn nguyên liệu dồidào và rẻ tiền này sẽ mang lại một giá trị kinh tế lớn đồng thời giảm thiểu ônhiễm môi trường vốn là vấn đề bức xúc tại các khu vực chế biến cá

Xuất phát từ thực tế này chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứuthu nhận enzyme từ phế liệu cá” Trong khuôn khổ luận văn, chúng tôi đã tiếnhành nghiên cứu các nội dung sau:

- Khảo sát hoạt tính của các enzyme trong nội tạng cá tra (Pangasius

hypophthalmus).

- Khảo sát các thông số của quá trình trích ly enzyme.

- Tối ưu hóa quá trình trích ly

- Thu nhận chế phẩm enzyme thô

Chöông 2 Toån

g quan

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Cá da trơn

Phân loại khoa học

Ngành (phylum) : Chordata

Lớp (class) : Actinopterygii

Siêu bộ (superordo) : Ostariophysi

Bộ Cá da trơn hay bộ Cá nheo (danh pháp khoa học: Siluriformes) là một bộ

cá rất đa dạng trong nhóm cá xương Các loài cá trong bộ này đa dạng về kích thướcvà cách thức sinh sống, gồm loài nặng nhất như cá tra dầu (Pangasius gigas) ở Đông Nam Á, loài dài nhất như cá nheo châu Âu (Silurus glanis), những loài chỉ ăn xác các sinh vật chết ở lớp nước đáy, hay các loài cá ký sinh nhỏ bé như Vandellia cirrhosa.

Về cấu tạo nói chung, chúng không có vảy, có hoặc không có tấm xương bảo vệ,và chỉ có một số loài cá da trơn có râu Các đặc trưng để xác định bộ cá da trơntrên thực tế là các đặc điểm chung của hộp sọ và bong bóng [38]

Bộ cá này có tầm quan trọng kinh tế đáng kể; nhiều loài được nuôi ở quymô lớn để cung cấp cá thực phẩm, một vài loài được nuôi thả như là cá câu thểthao Nhiều loài cá nhỏ, cụ thể là các loài trong chi Corydoras, được nuôi làm cácảnh trong các bể cá [38]

Cá da trơn thuộc về siêu bộ gọi là Ostariophysi Tại thời điểm năm 2007,người ta công nhận khoảng 36 họ cá da trơn còn tồn tại với khoảng 3.023 loài Điềunày làm cho bộ cá da trơn trở thành bộ động vật có xương sống đứng hàng thứ hai,thứ ba về sự đa dạng; trên thực tế, khoảng 1 trên 20 loài động vật có xương sống làcá da trơn

2.1.2 Cá tra

Hình 2ﾧ.1 Cá traCá tra là mộttrong số 11 loàithuộc họ cá tra

(Pangasiidae) đã được xác định ở sông Cửu long Tài liệu phân loại gần đây nhất

của tác giả W.Rainboth xếp cá tra nằm trong giống cá tra dầu Cá tra dầu rất ít gặp

ở nước ta và còn sống sót rất ít ở Thái lan và Campuchia, đã được xếp vào danhsách cá cần được bảo vệ nghiêm ngặt (sách đỏ) Cá tra của ta cũng khác hoàn toàn

với loài cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) thuộc họ Ictaluridae

 Phân bố

Cá tra phân bố ở lưu vực sông Mê kông, có mặt ở cả 4 nước Lào, Việt Nam,Campuchia và Thái lan Ở Thái Lan còn gặp cá tra ở lưu vực sông Mê kông vàChao Phraya Ở nước ta những năm trước đây khi chưa có cá sinh sản nhân tạo, cábột và cá tra giống được vớt trên sông Tiền và sông Hậu Cá trưởng thành chỉ thấytrong ao nuôi, rất ít gặp trong tự nhiên địa phận Việt Nam, do cá có tập tính di cưngược dòng sông Mê kông để sinh sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên Khảo sát chukỳ di cư của cá tra ở địa phận Campuchia cho thấy cá ngược dòng từ tháng 10 đếntháng 5 và di cư về hạ lưu từ tháng 5 đến tháng 9 hàng năm

 Hình thái, sinh lý

Cá tra là cá da trơn (không vẩy), thân dài, lưng xám đen, bụng hơi bạc, miệngrộng, có 2 đôi râu dài Cá tra sống chủ yếu trong nước ngọt, có thể sống được ởvùng nước hơi lợ (nồng độ muối 7-10 ), có thể chịu đựng được nước phèn với pH>5,dễ chết ở nhiệt độ thấp dưới 15oC, nhưng chịu nóng tới 39 oC Cá tra có số lượnghồng cầu trong máu nhiều hơn các loài cá khác Cá có cơ quan hô hấp phụ và còncó thể hô hấp bằng bóng khí và da nên chịu đựng được môi trường nước thiếu oxy

Phân loại khoa học [ 41 ]

Bộ cá da trơn : Siluriformes

Họ cá tra : Pangasiidae

Giống cá tra dầu : Pangasius

Loài cá tra : Pangasius hypophthalmus (Sauvage 1878)

hòa tan Tiêu hao oxy và ngưỡng oxy của cá tra thấp hơn 3 lần so với cá mè trắng.[2]

Cá tra có ngưỡng oxi thấp hơn cá basa (do cá basa không có cơ quan hô hấpphụ), nên chịu đựng tốt hơn cá basa ở môi trường nước có hàm lượng oxy hòa tanthấp Nhìn chung cá tra chịu đựng được với môi trường khắc nghiệt hơn cá basa.Cá tra ở ĐBSCL, chúng sống ở sông rạch, mương, ao, hồ vùng nước ngọt, sống

ở thuỷ vực nước tĩnh và nước chảy Cá cũng sống được ở nước lợ với nồng độ muốithấp pH thích hợp cho cá tra từ 6,5 – 8, cá có thể sống được pH 4,5 Cá tra sốngđược ở môi trường chật hẹp, nước giàu các chất hữu cơ, cá sống được ở nơi có oxihoà tan rất thấp (có khi bằng 0), cá tra có cơ quan hô hấp là bóng khí, thở được khítrời Nhiệt độ thích hợp cho cá tra 26 – 300C

Cơ quan tiêu hoá của cá tra gồm miệng, răng hàm, gai mang, dạ dày to hình chữ

U, cơ rất phát triển Túi mật lớn, ruột ngắn Cá tra là loài cá ăn tạp, song có nhiềuđặc điểm của loài cá ăn thịt, nhưng cá tra là loài cá hiền, chúng không đuổi bắtmồi, mồi ăn chủ yếu là những loài động vật yếu vận động

 Đặc điểm dinh dưỡng:

Cá tra khi hết noãn hoàng thì thích ăn mồi tươi sống, vì vậy chúng ăn thịt lẫnnhau ngay trong bể ấp và chúng vẫn tiếp tục ăn nhau nếu cá ương không được choăn đầy đủ, thậm chí cá vớt trên sông vẫn thấy chúng ăn nhau trong đáy vớt cá bột.Ngoài ra khi khảo sát cá bột vớt trên sông, còn thấy trong dạ dày của chúng có rấtnhiều phần cơ thể và mắt cá loài cá khác Dạ dày của cá phình to hình chữ U và cogiãn được, ruột cá tra ngắn, không gấp khúc lên nhau mà dính vào màng treo ruộtngay dưới bóng khí và tuyến sinh dục Dạ dày to và ruột ngắn là đặc điểm của cáthiên về ăn thịt Ngay khi vừa hết noãn hoàng cá thể hiện rõ tính ăn thịt và ăn lẫnnhau Trong quá trình ương nuôi thành cá giống trong ao, chúng ăn các loại phù duđộng vật có kích thước vừa cỡ miệng của chúng và các thức ăn nhân tạo Khi cálớn thể hiện tính ăn rộng, ăn đáy và ăn tạp thiên về động vật nhưng dễ chuyển đổiloại thức ăn Trong điều kiện thiếu thức ăn, cá có thể sử dụng các loại thức ăn bắtbuộc khác như mùn bã hữu cơ, thức ăn có nguồn gốc động vật Trong ao nuôi cá tracó khả năng thích nghi với nhiều loại thức ăn khác nhau như cám, rau, động vậtđáy

Khi phân tích thức ăn trong ruột cá đánh bắt ngoài tự nhiên, cho thấy thànhphần thức ăn khá đa dạng, trong đó cá tra ăn tạp thiên về động vật

B ng ả 2ﾧ.1 Thành phần thức ăn trong ruột cá tra ngoài tự nhiên

Cá tra (Theo D.Menon và P.I.Cheko (1955))

Đầu, xương,vây, đuôi550-700

4.44.84.94.94.95.05.15.15.25.5

9.89.910.110.110.210.410.510.510.911.0

1.21.31.52.03.14.14.44.95.15.2

5.1 5.2 5.4 6.0 6.1 6.2 6.2 6.6 6.7 6.7

39.338.838.337.436.835.335.134.633.632.5

2.1.3 Tình hình sản xuất tại Việt Nam

Với tiềm năng to lớn, ĐBSCL có diện tích nuôi thủy sản chiếm 71,4%, sảnlượng thủy sản chiếm 69,86% và kim ngạch xuất khẩu mặt hàng này chiếm đến61,4% so với cả nước Nổi bật nhất là con cá tra đang phát triển nhanh trong nhữngnăm gần đây [40]

Tính từ năm 2006, sản lượng cá tra nuôi ở ĐBSCL đạt 800.000 tấn, xuất khẩuđược 292.800 tấn, thu về kim ngạch xuất khẩu 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% sovới xuất khẩu thủy sản của cả nước Trong 6 tháng đầu năm 2007, diện tích nuôi cátra toàn vùng ĐBSCL đã lên đến 3.642 ha, tăng 1.256 ha so với năm trước Từ đó,

kim ngạch xuất khẩu 462,4 triệu USD, tăng 32% về lượng và 38,9% kim ngạch sovới cùng kỳ năm 2006 Cá tra, ba sa của Việt Nam đã được xuất khẩu sang 76 quốcgia và vùng lãnh thổ, tăng 6 thị trường so cùng kỳ Đã có 209 doanh nghiệp củaViệt Nam có hoạt động xuất khẩu cá tra, ba sa Riêng ĐBSCL năm 2006 có 136nhà máy chế biến thủy sản, thì trong đó có 70 nhà máy chế biến cá tra xuất khẩu,công suất 1,5 triệu tấn/năm Chỉ tại TP Cần Thơ cũng đã có 15 nhà máy chế biếncá tra xuất khẩu, công suất chế biến khoảng 400.000 tấn cá tra nguyên liệu.

2.1.4 Lượng phế liệu và tận dụng phế liệu

Hiện nay, ĐBSCL đang có 70 nhà máy chế biến mặt hàng phi-lê cá tra với khảnăng tiêu thụ khoảng 4000 tấn nguyên liệu/ngày Với sản lượng này, mỗi ngày cácnhà máy chế biến tung ra thị trường hơn 2000 tấn xương, đầu, mỡ, da cá Năm

2006, với 800.000 tấn cá nguyên liệu được đưa vào chế biến, các nhà máy chỉ thuđược chưa đầy 300.000 tấn phi-lê và loại ra hơn 500.000 tấn phế phẩm Năm 2007,nếu sản lượng cá nguyên liệu đạt 1 triệu tấn như dự báo của VASEP thì các nhàmáy chế biến phải thải ra thị trường hơn 600.000 tấn phế phẩm cá tra Theo giớichuyên môn, hiện nay một kg phi-lê cá xuất khẩu có giá hơn 3 USD thì giá cá tramất phi-lê chỉ dao động ở mức từ 2.000 - 4.000 đồng/kg Đây sẽ là một nguồnnguyên liệu cho các ngành công nghiệp tận dụng

 Cá tra sau khi lấy phi lê xuất khẩu thì phần còn lại gồm có da cá, mỡ cá,đầu, xương, nội tạng … Hiện nay chúng đã và đang được nghiên cứu tận dụng gầnnhư toàn bộ

Da cá đang được nghiên cứu chế biến gelatin để sử dụng trong ngànhcông nghiệp dược (làm vỏ thuốc con nhộng thay thế nguyên liệu da heo) và mỹphẩm

Mỡ cá - chiếm từ 15 - 20% trọng lượng – ban đầu được các cơ sở chếbiến nấu thành mỡ nước cung ứng cho thị trường, sau đó được các doanh nghiệpnghiên cứu để sản xuất 2 loại dầu: loại nhẹ có thể trích ly DHA (omega 3) sử dụngtrong công nghệ dược phẩm, thực phẩm; loại nặng sản xuất dầu biodiesel sử dụngcho động cơ Phải nhìn nhận là việc nghiên cứu sản xuất dầu biodiesel từ mỡ cá có

triển vọng rất lớn, phù hợp với xu thế thời đại bởi càng ngày nguồn nhiên liệu hoáthạch (dầu mỏ, than đá ) càng cạn kiệt, nhu cầu sử dụng nhiên liệu tái tạo, khônggây ô nhiễm như dầu biodiesel là rất lớn Thêm nữa, nghề nuôi cá tra, basa ởĐBSCL đang phát triển mạnh nên nguồn nguyên liệu phục vụ chế biến dầubiodiesel rất dồi dào, các quốc gia lân cận không thể có được ưu thế này

Đầu, xương sống, ruột … chế biến thành thức ăn công nghiệp phục vụchăn nuôi sau khi đã nấu lấy mỡ Theo ông Trần Hữu Thích, giám đốc Công tySTECG, với sản lượng nguyên liệu cá ước tính khoảng 700.000 tấn/năm, nhữngphụ phẩm của công nghệ chế biến cá (đầu, vi, bụng, xương) sẽ lên đến khoảng450.000 - 480.000 tấn/năm Từ 480.000 tấn phụ phẩm thô, chúng ta có thể làm rakhoảng 96.000 tấn bột cá

Bong bóng cá bán cho những đại lý chuyên thu mua sấy khô cung cấpcho các nhà hàng nấu súp Bao tử cá làm sạch bán cho các quán ăn đặc sản Ngoài

ra, con cá tra còn một nguồn protein rất quan trọng mà lâu nay người ta bỏ phí làmáu cá

 Một số công ty nghiên cứu tận dụng nguồn phế liệu:

Tại An Giang, Agifish là công ty nghiên cứu sản xuất thành công dầubiodiesel từ mỡ cá tra, basa Trong quy trình sản xuất còn thu được glycerol vàmuối kali dùng sản xuất phân bón và mỡ bôi trơn động cơ

Ở Phước Thới, Ô Môn (TP Cần Thơ), ông Trịnh Minh Tú - giám đốccông ty TNHH Minh Tú cho biết từ cuối năm 2004, công ty ông đã nghiên cứu quytrình sản xuất biodiesel từ mỡ cá, có thể sản xuất 300 lít dầu biodiesel mỗi giờ

Từ phụ phẩm thô, Công ty CP ứng dụng công nghệ thích hợp (STECGJ.S.C) làm ra bột cá đạt > 45o đạm, sản xuất ra mỡ sạch, và đã tiếp tục nghiên cứulàm ra các sản phẩm có giá trị cao hơn như dầu biodiesel (giá thành khoảng6.500đ/l) hoặc các chất nền dùng trong mỹ phẩm, và đang xem xét nghiên cứuchiết suất DHA từ mỡ cá để sử dụng trong chế biến thực phẩm và chăn nuôi …

 Phần còn lại cá tra sau khi lấy phi lê được sử dụng hầu như toàn bộ, nhưngphần nội tạng cá (ngoại trừ dạ dày) thì vẫn chưa được nghiên cứu sử dụng Đây làbộ phận tiêu hóa chính của cá tra, chứa nhiều enzyme tiêu hóa, nên cần thiếtnghiên cứu và tận thu nguồn enzyme này

2.2 Enzyme hệ tiêu hóa

2.2.1 Đặc điểm chung của enzyme hệ tiêu hóa

Sự tiêu hóa thức ăn ở động vật gồm chủ yếu là một chuỗi những quá trình hóasinh học xảy ra ở miệng, dạ dày, ruột làm giảm kích thước phân tử và làm hòa tancác thành phần thức ăn bằng các enzyme tiêu hóa [36,28]

Thực phẩm của chúng ta bao gồm thành phần chính là protein, cacbonhydrat,chất béo, nước, khoáng, và một lượng nhỏ những nguyên tố khác Cơ chế chính xáccủa sự tiêu hóa chúng (sự tiêu hóa, hấp thụ, và sử dụng) rất phức tạp, và enzymetiêu hóa góp phần cần thiết vào trong quá trình này Một vài enzyme tiêu hóa: [15]

 Enzyme pepsin được tiết dạng pepsinogen không hoạt động trong môitrường HCl, nó được hoạt hóa thành pepsin Pepsin tác động lên các proteintrong thức ăn tạo chuỗi peptit ngắn chứa khoảng 4-12 axit amin

 Enzyme trypsin được bài tiết dưới dạng tiền enzyme trypsinogen, tiềnenzyme này gặp enzyme enterokinase của ruột thì biến thành trypsin hoạt động(trypsinogen bị cắt mất 6 đoạn peptit sau cùng biến thành trypsin) Trypsin lạicó tác dụng tự xúc tác

 Enzyme chymotrypsin của tụy cũng được bài tiết dưới dạng tiền enzymechymotrypsinogen Tiền enzyme này gặp trypsin sẽ biến thành chymotrypsin

o Cả hai enzyme trypsin và chymotrypsin đều có tác dụng giống nhau, tứclà ở môi trường có độ pH gần bằng 8 thì hai men này thủy phân proteinthành các loại peptit Riêng chymotrypsin còn có tác dụng gây đông sữa

o Trong phần trên của tá tràng độ pH gần bằng 5 tức là không thuận lợilắm cho tác dụng của trypsin và chymotrypsin đối với protein, nhưng ở đóhai enzyme này bền vững hơn là môi trường kiềm (môi trường kiềm dễlàm phân hủy trypsin và chymotrypsin)

 Enzyme cacboxypeptidase có tác dụng cắt các axit amin sau cùng cómang - COOH của các chất peptit

 Enzyme aminopeptidase cắt các axitamin có mang -NH2 tự do ở cuốimạch của các polipeptit

 Enzyme lipase của tụy là một enzyme tiêu hóa mỡ rất mạnh Tác dụngcủa lipase là thủy phân mỡ thành một hỗn hợp glyxerit và axit béo (glyxeritđơn giản: monoglyxerit)

 Enzyme amylase của tụy tác động lên tinh bột giống như enzyme ptyalin

của nước bọt, nhưng tác dụng của men amylase tụy mạnh hơn, và enzyme nàycó thể tiêu hóa tinh bột sống Cũng như ptyalin nước bọt, amylase tụy cần cónhiều ion Cl- để phát huy tác dụng Độ pH tối thiểu cho enzyme này là 6,5 đến

7 Một phần nhỏ amilase tụy bài tiết ra được chuyển sang máu, làm cho máucũng có một tác dụng là tiêu hóa tinh bột

 Enzyme mantase của tụy biến mantose thành glucose

 Enzyme nuclease của tụy phân hủy các axit nucleic, giải phóng nhữngđoạn nucleotit đơn giản

2.2.2 Sự sản sinh enzyme hệ tiêu hóa

Enzyme tiêu hóa được sản sinh ra bởi những tuyến khác nhau như: tuyến nướcbọt, tuyến trong dạ dày, tụy tạng, và những tuyến trong ruột non [16,17,18]

Tuyến nước bọt ở động vật có vú tiết ra enzyme α-amylase, giúp thủy phân tinhbột

Enzyme được tiết ra từ dạ dày gồm có: pepsin Từ tuyến tụy có enzyme trypsin,chymotrypsin, amylase Trong ruột non thì có enzyme lipase, maltase, isomaltase,lactase …

Hình 2ﾧ.2 Một số enzyme trong hệ tiêu hóa của động vậtNhững enzyme chính trong hệ tiêu hóa là lipase, amylase, protease.

2.2.3 Đặc điểm và tính chất của một số enzyme hệ tiêu hóa

Dạ dày

Dịch dạ dày

Tế bào đỉnhTế bào vách

Pepsin

Tụy tạng

Dịch tụy tạng

LipaseAmylaseTrypsinChymotrypsinAminopeptidaseCarboxypeptidase

Hình 2ﾧ.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme amylase

Trục tung: 200-T (phút) Với T là thời gian phản ứng đến khi dung dịchkhông còn cho màu xanh với thuốc thử iot

x : amylase trong tuyến nước bọt của con người; ∆ : amylase trong tuyếntụy của rùa nước ngọt; °: amylase trong tuyến tụy của cá mòi dầu

Dưới cùng điều kiện phản ứng thì nhiệt độ tối ưu của enzyme amylase ở tuyếnnước bọt của người cao hơn trong tuyến tụy của rùa biển và cá mòi dầu

Những yếu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ tối ưu của enzyme amylase trong hệ tiêuhóa của động vật: tỉ lệ enzyme và cơ chất càng cao thì nhiệt độ tối ưu càng cao,thời gian thủy phân càng lâu thì nhiệt độ tối ưu càng thấp

Hình 2ﾧ.4 Ảnh hưởng của ketene lên hoạt tính của enzym amylase

Chất vô hoạt: [21, 22]

Enzyme amylase bị vô hoạt khi acetyl hóa với keten

Amylase bị vô hoạt khi xử lý với formaldehyde Formaldehyte tác dụngvới enzyme trong 30 phút ở pH 8,2; nhiệt độ 250C, với nồng độ 1%

Đặc điểm và tính chất của enzyme amylase từ giun sán ký sinh trên heo [35]α-amylase (EC 3.2.1.1) được tách ra từ giun sán Ascaris suum ký sinh trên

heo Dùng phương pháp đẳng điện để loại một dạng α-amylase ra khỏi cơ với pI 5,

và 2 dạng ra khỏi ruột với pI 4.7 và 4.5 Khối lượng phân tử của isoenzyme trongruột lần lượt là 83 và 73 kDa, và enzyme amylase từ cơ là 59kDa α-amylase từruột có pH tối ưu là 7,4 và từ cơ có pH tối ưu là 8,2 Enzyme từ cơ chịu nhiệt đượchơn enzyme từ ruột Cả amylase từ cơ và từ ruột đều giảm nửa hoạt tính sau 15phút tương ứng ở 700C và 500C

Amylase từ cơ là: 0,22 g/ml glycogen, và 3,33 g/ml tinh bột.

Amylase từ ruột là: 1,77 g/ml glycogen, và 0,48 g/ml tinh bột

Cả hai đều được hoạt hóa bởi Ca2+, và bị ức chế bởi EDTA, axit iođoaxetic,

p-chloromercuribenzoate, và chất ức chế α-amylase từ bột mì Không có sự khác

nhau đáng kể về tính chất của α-amylase ở động vật ký sinh và vật chủ của nó

2.2.3.2 Enzyme protease [3]

Trypsin:

Trypsin có trong dịch tụy của người và động vật Trypsin được Kiihne khámphá và chiết tách vào năm 1884 Năm 1931 Northrop và Knuzt thu được trypsin vàtrypsinogen ở dạng tinh thể

Trong cơ thể sinh vật, trypsin hoạt động trong môi trường kiềm ở ruột nênđược gọi là protease kiềm tính Vai trò của trypsin là tiếp tục thủy phân các proteincòn lại sau khi đã bị thủy phân một phần ở dạ dày Ở trong máu cũng có một íttrypsin hoạt động

Trong tuyến tụy, đầu tiên trypsin được tiết ra ở dạng không hoạt động làtrypsinogen, sau đó trypsinogen được chuyển hóa thành trypsin hoạt động dưới tácdụng của enzyme đường ruột enterokinase và bởi chính trysin do nó có tác dụng tựxúc tác

Trypsin là một chuỗi polypeptide có 249 axit amin, trọng lượng phân tử22680-23400

pH tối ưu cho hoạt động của trypsin là 8 và pH thích hợp của trypsin là 7,8 –9,5 Tuy nhiên hoạt tính của dung dịch trypsin vẫn có thể ổn định ở pH 3 – 5

Các kim loại có tác dụng hoạt hóa trypsin là Ca, Co, Mn

Các kim loại có tác dụng ức chế là Cu, Ag, Hg

Chymotrysin:

Chymotrypsin là một protease được tiết ra từ tuyến tụy Đây là một proteasekiềm tính quan trọng sau trypsin Chymotrypsin được thu nhận ở dạng tinh thể vàonăm 1933 bởi Kunitz và Northrop

Chymotrypsin được tụy tiết ra dưới dạng không hoạt động đó làchymotrypsinogen, sau đó chymotrypsinogen được chuyển sang dạng hoạt động làchymotrypsin nhờ tác dụng của trypsin

Chymotrypsin được cấu tạo từ 3 sợi polypeptide: sợi A (axit amin từ 1 -13),sợi B (các axit amin từ 16 -146), sợi C (axit amin từ 149-245) Các sợi này liên kếtvới nhau bởi cầu nối disulfite.

Chymotrypsin là một protease hoạt động trong điều kiện môi trường có pHkiềm nên được xếp vào nhóm protease kiềm tính tương tự như trypsin.Chymotrypsin hoạt động trong điều kiện pH 7- 9 và pH tối ưu là 8-9, điểm đẳngđiện pI=5,4 pH 5 không thuận tiện cho hoạt động của chymotrypsin nhưng ở pHnày chymotrypsin lại bền vững hơn trong môi trường pH 8 (môi trường kiềm dễ làmphân hủy trypsin và chymotrypsin) Chymotrypsin là một chuỗi polypeptide có 245axit amin, trọng lượng phân tử 22500

2.2.3.3 Enzyme lipase [12, 14, 27, 11]

 Định nghĩa:

Lipase (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3): là enzymexúc tác cho phản ứng thủy phân triacylglycerol (dầu thực vật, mỡ động vật) tạothành glixerin và axit béo tương ứng Lipase xúc tác phản ứng thuỷ phân lần lượt

từng liên kết - ester trong phân tử chứ không phải cắt đứt cả 3 liên kết ester cùng

lúc

Có hoạt tính mạnh đối với cơ chất không tan trong nước, thể hiện hoạt tínhbề mặt

Hoạt động mạnh trong hệ nhũ hóa, đặc biệt là hệ nhũ đảo (nước trong dầu)

 Cấu trúc của lipase từ động vật :

Cấu tạo lipase tuyến tụy từ người gồm hai tiểu phần, phần lớn hơn chứa đuôi

N, phần nhỏ hơn chứa đuôi C

Nhân của tiểu phần đuôi N hình thành bởi 9 sợi xếp song song trên mặtphẳng gấp nếp β

Tiểu phần C hình thành bởi hai lớp mặt phẳng không song song

Tiểu phần N chứa trung tâm hoạt động, liên kết với nhóm glycosyl, liên kếtvới Ca2+ và có thể liên kết với heparin

Trung tâm hoạt động bị che dưới các vòng xoắn α mạch ngắn gọi là các nắphay nút đậy

α

 Tính chất của enzyme lipase:

Lipase có hoạt tính bề mặt ở phân pha nước – lipit và chỉ thủy phân chất béođã nhũ hóa

Lipase có thể thủy phân cả 3 liên kết ester trong TAG hoặc chỉ thủy phânmột số liên kết ester nhất định giữa gốc – OH và các gốc acyl trong phân tử acyllipit Lipase tuyến tụy động vật đặc hiệu với gốc acyl ở vị trí 1, 3

Kích thước của giọt dầu trong hệ nhũ tương cáng nhỏ thì tổng diện tích bềmặt phân pha dầu – nước càng lớn dẫn đến hoạt tính lipase càng cao

Lipase có nhiều trong hệ thống tiêu hóa của động vật Lipase trong tụy heođược nghiên cứu đầy đủ nhất Nó có MW 48kDa, khả năng thủy phân giảm dầntrong dãy cơ chất: TAG > DAG > MAG

Phân tử lipase tuyến tụy có đầu kị nước liên kết với giọt dầu, còn tâm hoạtđộng của enzyme thì gắn với phân tử cơ chất, tại tâm hoạt động có các axit aminSer, His, và Asp có vai trò tham gia vào việc cắt các liên kết ester Tâm hoạt độngcủa lipase còn chứa nhóm Leucine có tác dụng tạo ra liên kết kị nước với cơ chấtlipit và đặt cơ chất đúng vào vị trí tâm hoạt động của enzyme Hoạt tính của lipaseđược tăng cường bởi ion Ca2+, các axit béo tự do tạo ra sẽ kết hợp với Ca2+ để tạothành muối không tan

 Cơ chế tác dụng của lipase:

Thông thường, trong phản ứng có xúc tác enzyme, nhờ sự tạo thành phứchợp trung gian enzyme – cơ chất mà cơ chất được hoạt hoá, bởi lẽ khi cơ chất kếthợp vào enzyme do kết quả của sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron và sựbiến dạng của các liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới làm thay đổiđộng năng cũng như thế năng, kết quả làm cho phân tử cơ chất trởø nên hoạt độnghơn, nhờ đó tham gia phản ứng dễ dàng

Quá trình tạo thành phức enzyme – cơ chất (ES) và biến đổi phức này thànhsản phẩm, giải phóng enzyme tự do thường trải qua 3 giai đoạn :

E + S ES P + E

- Giai đoạn 1: Enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạothành phức ES không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏinăng lượng hoạt hoá thấp

- Giai đoạn 2: Khi cơ chất tạo phức với E sẽ bị thay đổi cả cấu hìnhkhông gian, cả về mức độ bền vững của các liên kết Kết quả là cácliên kết bị phá vỡ

- Giai đoạn 3: tạo thành sản phẩm còn enzyme được giải phóng dướidạng tự do

Cơ chế tác dụng của lipase : tâm ái nhân của lipase sẽ tương tác với 1 trong

2 nguyên tử tích điện dương của liên kết bị thuỷ phân Sự tạo thành phức hợp trựctiếp như thế với trung tâm phản ứng sẽ làm cho sự đứt các liên kết và sự thuỷ phân

dc dễ dàng thuận lợi

Một cơ chế khác liên hệ tính tác dụng của enzyme với sự khuyết electroncủa liên lết bị thuỷ phân là : Enzyme làm tăng sự khuyết electron vốn đã tồn tạitrước đó, bằng cách tạo thành liên kết tương ứng với cơ chất ở những vị trí ít nhiềugần gũi với liên kết bị thuỷ phân Nhờ vậy mà làm cho sự phân bố electron trongphân tử cơ chất bị thay đổi theo 1 chiều hướng cần thiết, khiến cho việc đứt liênkết được dễ dàng hoặc khiến cho 1 trong 2 nguyên tử của liên kết tương tác đượcvới các tác nhân ái nhân

Dưới tác dụng của enzyme lipase, khi hợp chất AB kết hợp với enzyme thìliên kết A-B bị kéo căng , kèm theo sự chuyển dịch electron dẫn đến làm đứt liênkết A-B và gắn nhóm HO- của nước vào phần B của phân tử

Sau khi hoàn thành phản ứng enzyme dược giải phóng dưới dạng tự do.

 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất của enzyme lipase

Cơ chất

• Báo cáo của Ting và các đồng sự thì tỷ lệ dầu nước là 10/5 là tối ưu với hiệusuất thủy phân dầu nành là 48% với lipase cố định trên hạt chitosan bằng phươngpháp Binary

thích hợp nhất của lipase dịch gan là 6.0, còn của dịch tụy tạng là 6.4

Hykeo đã lấy dịch ruột cá vược ( perca fluviatelis ) đem thuỷ phân tributirin

thì thấy tác dụng của chúng mạnh nhất ở 25–37oC, pH = 12.3 – 12.8

Các nhà khoa học Nhật đã dùng dịch tuỵ tạng của tôm càng

(Squil-laoratoria) thuỷ phân methylacetat thấy chúng hoạt động mạnh ở 38oC, pH = 7.2với thời gian là 15h

Chất hoạt hóa và ức chế:

Canxi hoạt hóa lipase trong phản ứng thủy phân theo ba cơ chế :

Kết hợp với enzyme làm thay đổi cấu trúc

Giúp lipase dễ dàng hấp thụ lên bề mặt cơ chất-nước

Khử các axit béo sản phẩm của phản ứng thủy phân giảm khả năngức chế của axit với enzyme

Một vài cơ chất ức chế như :

Các hợp chất bề mặt có chứa anionProtein

Ion kim loạiCác hợp chất có chứa phospho như cabarmate, β-lactone…

Chất nhũ hóa

Muối mật nhũ hóa lipase từ tuyến tụy của người

Nước

Nước không những là môi trường để khuyếch tán enzyme và cơ chất mà cònlà tác nhân tham gia vào phản ứng Nước có ảnh hưởng không những tới vận tốc

mà cả đến chiều hướng của phản ứng thủy phân bởi enzyme Nó cũng là 1 yếu tốđiều chỉnh các phản ứng thuỷ phân bởi enzyme, có thể dùng làm nhân tố tăngcường hay kìm hãm các phản ứng thuỷ phân có enzyme xúc tác.

2.2.4 Enzyme trong hệ tiêu hóa của cá và hoạt động của chúng

Hiện nay người ta nghiên cứu về hệ tiêu hóa trong cá chủ yếu để khảo sát thóiquen về ăn uống của chúng là chính chứ không nhằm mục đích về thu nhậnenzyme tiêu hóa

Trong hệ tiêu hóa của cá, một tế bào trong dạ dày có thể sản sinh cả HCl vàenzyme Điều này trái ngược với loài động vật có vú, chúng có 2 loại tế bào, mộtsản sinh HCl, một sản sinh enzyme Sự sản sinh axit ở cá giống với động vật có vú:NaCl và H2CO3, tạo thành NaHCO3 và HCl [39]

Hai hệ sản xuất enzyme chính là giữa ruột – tụy tạng, và thành ruột

Cá da trơn: [28]

Quá trình tiêu hóa cụ thể của cá da trơn chưa được nghiên cứu rộng rãi, nhưnghọ cho rằng nó giống với những động vật có cấu tạo dạ dày đơn giản Bộ phận tiêuhóa của cá da trơn gồm có miệng, họng , thực quản, dạ dày ruột và những bộ phậnkhác như tụy tạng, gan, và túi mật pH trong dạ dày của cá da trơn thì thay đổitrong khoảng từ 2-4, pH trong ruột thì từ 7-9 Enzyme tiêu hóa có trong ruột gồmtrypsin, chymotrypsin, lipase và amylase

Lipit là một nguồn năng lượng đặc biệt tốt cho cá da trơn Tinh bột không đượctiêu hóa tốt bằng lipit ở cá da trơn, nhưng sự tiêu hóa tinh bột ở loài cá sống ở vùngnước ấm thì cao hơn loài cá sống ở vùng nước lạnh

Cá da trơn răng nhọn [32]

Sự phân bố của enzyme ở loài cá da trơn răng nhọn:

Hình 2ﾧ.5 Hoạt tính amylase ở cá da trơn răng nhọn.

Hình 2ﾧ.6 Hoạt tính protease ở cá da trơn răng nhọn.

Cá bơn sao: [10]

Dạ dày có khả năng thủy phân protein nhờ enzyme pepsin, chất béo vàcacbonhydrat thì không bị tấn công ở dạ dày Trong ruột, protein bị thủy phânnhiều hơn nhờ enzyme trypsin và eresin Gan và thành túi mật chứa 1 lượng đángkể trypsin hơn so với ruột Chất béo và cacbonhydrat được thủy phân ở trong ruột,

vì màng nhầy ở ruột và màng của túi mật và cả gan chứa lipase và amylase Ganthì chứa một lượng đáng kể lipase hơn là mật và ruột, nhưng lipase của nó hoạtđộng bên trong tế bào

Enzyme tiêu hóa của cá da trơn ở Brazin (Pseudoplatystoma Coruscans) [26]

Hình 2ﾧ.7 Hoạt tính của enzyme hệ tiêu hóa của cá da trơn ở Brazin.

Hoạt tính enzyme ở một số loài cá [16]:

Hoạt tính lipase (xác định theo phương pháp chuẩn độ)

2.3 Ứng dụng của chế phẩm enzyme hệ tiêu hóa

Lipase từ tụy heo được ứng dụng trong công nghệ chế biến sữa, nhằm tạo mùi

vị và cấu trúc cho sản phẩm.[3]

Protease từ động vật từ lâu cũng được ứng dụng vào công nghệ chế biến sữa.[3]

Enzyme từ cá: Một đặc trưng của enzyme từ cá đó là chúng có thể hoạt động ởnhiệt độ thấp và pH từ trung tính đến kiềm trong khi enzyme từ động vật trên cạngiảm về hoạt tính trong cùng điều kiện Enzyme từ cá được dùng trong sản suất cá,để giúp cho quá trình loại bỏ da, vảy, và màng mà khi dùng cách khác rất khó khăntrong việc loại bỏ, ví dụ như là da cá thu, cá đuối … Chúng còn được dùng trong sảnxuất trứng cá, thủy phân cả bao tải trứng cá, cho phép loại bỏ hơn 50% so với chỉsử dụng phương pháp truyền thống tách bằng trụ quay [9]

Những đặc điểm đặc biệt của enzyme từ cá là vô giá cho một số quá trình sảnxuất Pepsin từ cá tuyết được dùng để ngăn ngừa những mùi vị không mong muốnphát triển trong thời hạn sử dụng của phô mai cứng Trypsin được sử dụng để khôiphục màu caroten cho phế liệu của động vật giáp xác để dùng trong thức ăn chođộng vật dưới nước mặc dù vẫn còn một vài vấn đề về kỹ thuật Enzyme từ cá cònđược dùng trong việc nướng, làm mềm thịt, sản xuất da, trứng cá muối, sốt cá, vàsản xuất mùi vị cá [9]

Những ứng dụng khác của enzyme từ cá bao gồm việc sản xuất FPC (fishprotein concentrate) dùng làm nguồn dinh dưỡng bổ sung vào thức ăn cho động vậtsống dưới nước để hỗ trợ cho việc tiêu hóa [9]

Ở Pháp, enzyme từ cá được sử dụng trong thương mại để phục hồi những gia vịtừ cá và động vật có vỏ Về cơ bản, nguyên liệu được nấu chảy để có thể loại rakhỏi xương và vỏ và những nguyên liệu cần thiết khác để làm gia vị cô đặc [9]Enzyme từ cá là một sản phẩm thương phẩm có giá trị Lọ trypsin từ cá tuyết,5g, trị giá khoảng £60 [9]

Enzyme tiêu hóa là thuốc trợ tiêu hóa: [42]

Trong y học, enzyme tiêu hóa được ứng dụng rộng rãi để cải thiện sự tiêuhóa: chữa trị những vấn đề liên quan đến tiêu hóa như chứng ợ nóng, viêm, loét dạdày, bệnh trĩ, táo bón, ung thư ruột …

Amylase tuyến tụy: [ 29, 25, 34] :

Đến nay những ứng dụng lâm sàng của amylase là dùng để phát hiệnbệnh viêm tụy, như dạng amylase tuyến tụy (p-amylase) được dùng làm test thửđơn, hữu hiệu nhất trong chẩn đoán viêm tụy cấp tính

Amylase huyết thanh cũng được ứng dụng lâm sàng rộng rãi để pháthiện ra bệnh viêm tụy cấp tính Sự ứng dụng của enzyme này có độ chính xác là95% Tuy nhiên, nhược điểm của nó là tính đặc hiệu chỉ 70-80%

Amylase tuyến tụy thì hữu dụng hơn amylase tổng trong việc ướclượng bệnh nhân viêm tụy cấp tính

2.4 Các phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme [3]

2.4.1 Phương pháp trích ly và kết tủa bằng muối

Nguyên tắc: muối có nồng độ cao có tác dụng với phân tử nước bao quanhprotein enzyme và làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hòa tan củaenzyme

Trong công nghiệp enzyme, người ta thường sử dụng muối ammonium sulfate.Nhược điểm của nó là tính ăn mòn rất cao Sau này người ta thay thế bằng sodiumsulfate, muối này không gây hư hỏng thiết bị nhưng tính hòa tan của nó không tốt Nhiệt độ tiến hành kết tủa enzyme có thể là 35 – 400C nhưng để tránh khả nănglàm mất hoạt tính enzyme, người ta thường phải làm lạnh dung dịch muối và dungdịch enzyme trước khi trộn hai loại dung dịch này lại với nhau

Nồng độ tối ưu của muối dùng trong kết tủa enzyme sẽ được xác định trongnhững thí nghiệm cụ thể Khoảng tối ưu của nồng độ muối dùng trong kết tủaenzyme rất rộng, khoảng 20-80%

2.4.2 Phương pháp trích ly và kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ

Dung môi hữu cơ có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng hòa tan của enzyme, ảnhhưởng solvat hóa của phân tử nước xung quanh phân tử enzyme bị thay đổi, tươngtác giữa enzyme sẽ tăng lên

Nguyên tắc: khi cho dung môi hữu cơ vào dung dịch enzyme sẽ làm giảm khảnăng hòa tan của nước bao quanh enzyme Hiện tượng này xảy ra là do sự giảmhằng số điện ly của dung môi, đẩy một lượng lớn nước Các phân tử nước sắp xếprất trật tự xung quanh các đoạn kỵ nước trên bề mặt enzyme có thể được thay thếbằng phân tử của dung môi hữu cơ Từ đó làm gia tăng độ hòa tan của chúng Cácenzyme có tính kỵ nước mạnh sẽ có khả năng hòa tan hoàn toàn trong dung môihữu cơ

Nguyên nhân cơ bản của sự quần hợp protein enzyme có thể do các lực tĩnhđiện, lực Van der Waals (giống như ở muối) Tương tác kỵ nước trong trường hợpnày không có ý nghĩa lớn, tại điểm đẳng điện thì sự kết tủa diễn ra tốt nhất, khi đólượng dung môi sử dụng cho quá trình tủa là ít nhất

Trong công nghiệp sản xuất enzyme, người ta thường sử dụng ethanol và acetonđể kết tủa enzyme Khi tiến hành kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ thìcần hết sức lưu ý đến nhiệt độ Do enzyme rất nhạy cảm với nhiệt độ khi có mặtcủa các chất như ethanol hoặc aceton, nên bắt buộc khi tiến hành kết tủa enzymephải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme Mức độ nhạy cảm nhiệtđộ của enzyme khi có mặt các dung môi hữu cơ thường mạnh hơn mức độ nhạycảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ Người ta thường tiếnhành kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3-100C Tỷ lệ và nồng độcác dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định bằng thực nghiệm chotừng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch

Nhược điểm: có thể xảy ra hiện tượng biến tính không thuận nghịch khi kết tủabằng dung môi hữu cơ Nguyên nhân là do, khi hằng số điện môi giảm phân tửprotein có thể tự tháo gỡ và tạo thành dạng không hoạt động, trong khi các gốc kỵnước lại tiếp xúc với dung môi Hiện tượng này xảy ra khi tiến hành tủa ở nhiệt độphòng, nếu thực hiện ở nhiệt độ 4-10oC không thấy xuất hiện kết tinh enzyme.Trong quá trình kết tủa bằng dung môi hữu cơ tạo ra 1 nhiệt lượng lớn có thểlàm mất hoạt tính của enzyme Do đó dung dịch sau lọc cùng dung môi được làm

lạnh trước khi sử dụng và dung môi phải được cho từ từ và khuấy liên tục để tránhsự tăng nhiệt độ cục bộ bên trong hỗn hợp ( t = 5-10’, trong lúc đó nhiệt độ khôngquá 5oC )

2.4.3 Phương pháp sử dụng pH

Protein là chất lưỡng cực, chúng có cả nhóm axit và nhóm bazơ Mức độ hòa tancủa enzyme phụ thuộc vào pH, mức độ này là tối thiểu khi chúng ở điểm đẳngđiện, phần lớn protein có điểm đẳng điện ở khoảng axit, vì thế quá trình này đượcgọi là kết tủa axit Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện thường được thực hiện ở quymô nhỏ, chứ không thực hiện ở quy mô công nghiệp Thời gian tạo điểm đẳng điệnvà thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi hoạt tính enzyme.Như vậy, thiết bị phản ứng càng lớn, khả năng làm thay đổi hoạt tính enzyme cànglớn Khi đó, thời gian khuấy trộn và thời gian lắng kết tủa càng kéo dài, enzymecàng dễ bị biến tính

2.4.4 Các quy trình thu nhận chế phẩm enzyme

2.4.4.1 Phương pháp tách chiết enzyme với aceton và rửa tủa (2 lần) bằng aceton

Quá trình trích ly thực hiện ở 200C với thời gian là 3h và tỷ lệ nguyên liệu vàdung dịch Na2CO3 1.2 % theo khối lượng là 1 : 2

Quá trình kết tủa sử dụng dung môi hữu cơ là aceton với tỷ lệ nguyên liệu vàdung môi là 1 : 4, khuấy trong 10 phút để lắng 15 phút ở nhiệt độ lạnh

Sấy tủa ở 30-350C

Hình 2ﾧ.8 Sơ đồ thu nhận enzyme bằng phương pháp tách chiết với aceton.

2.4.4.2 Phương pháp tách chiết enzyme bằng cồn

Các giai đoạn tách chiết với cồn tuyệt đối với những tỷ lệ 1:4, 1:5, 1:7 và cồn

96o tương tự như với aceton nhưng thay aceton bằng cồn

Xử lý nguyên liệu, xay nhỏ

Nguyên liệu được bảo quản ở nhiệt độ đông đá

Tủa thu lấy enzyme

Ly tâm lấy tủa (lần 1)

Rửa tủa bằng aceton

Ly tâm lấy tủa (lần 2)

Sấy tủa

Nghiền nhỏ

Chế phẩm enzyme

Aceton lạnh

2.4.4.3 Phương pháp tách chiết enzyme kết tủa bằng (NH 4 ) 2 SO 4

Hình 2ﾧ.9 Sơ đồ tách chiết enzyme bằng phương pháp kết tủa bằng muối

(NH4)2SO4Trích ly lần 1 với nước cất với tỉ lệ nguyên liệu và dung môi là 1 : 1, để tự phân

Tụy heo bảo quản

Nước cất

H2SO4 0,25N

(NH4)2SO4 0,25 N

2.4.4.4 Phương pháp thu nhận enzyme thô bằng phương pháp sấy

Lấy tụy tươi đã được bảo quản, cân trọng lượng và trộn với tinh bột một lượngbằng 10% so với trọng lượng tụy tươi, tiếp theo sấy ở những nhiệt độ 50oC, 60oC,

70oC Sau 1 thời gian sấy ở những nhiệt độ trên thì ta đem xay nhuyễn và được chếphẩm enzyme thô

Trong quá trình ly tâm lấy tủa, trộn với tá dược như lactose, glucose, hay tinhbột là các chất phụ gia có tính chất ổn định enzyme đồng thời rút ngắn thời giansấy, hạn chế sự giảm hoạt tính enzyme trong khi sấy Thường sấy ở chân khôngnhiệt độ to = 45oC

Sấy khô : sau khi ly tâm thu phần kết tủa, đem sấy khô có thổi khí ở nhiệt độ 30– 40oC hoặc sấy chân không hay thiết bị sấy đông khô Để tránh bị mất hoạt tínhngười ta trộïn thêm vào chế phẩm enzyme các chất độn như tinh bột hoà tan,maltose dextrin trong quá trình sấy

2.4.5 Phương pháp tách và làm sạch enzyme

Gần đây ứng dụng các phương pháp mới (điện di, sắc ký trao đổi ion, lọc gel…)phối hợp với các biện pháp thường đđược dùng trước đây (biến tính chọn lọc, kếttủa phân đoạn, sắc ký hấp phụ) cho phép thu được phẩm vật của nhiều enzyme vớiđộ thuần khiết cao

Mặc dù trong việc xây dựng phương pháp mới đã đạt được nhiều kết quả, tuynhiên vấn đề tách làm thuần khiết enzyme hiện nay vẫn còn là một công tác phứctạp, khó khăn Nguyên nhân chủ yếu do một mặt enzyme có trong tế bào với lượngrất ít, mặc khác nó luôn có đồng thời với các protein khác cũng có các tính chất lýhoá rất giống nhau, hơn nữa enzyme lại rất không bền, dễ bị mất khả năng xúc tác

do tác động của các yếu tố bên ngoài

Trong dịch chiết, ngoài enzyme còn chứa các protein tạp và nhiều chất khác, đểloại bỏ chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác nhau

Để loại bỏ muối và các tạp chất có phân tử lượng thấp thường dùng các biệnpháp thẩm tích đối với nước hay đối với các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cáchlọc qua gel sephadex.

Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác, thườngdùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tácdụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằngmuối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấpphụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel

Phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môitrường chỉ dùng đối với trường hợp của các enzyme bền nhiệt hoặc bền axit Dịchenzyme đươc giữ ở 50-70oC hay ở pH = 5 hoặc nhỏ hơn trong thời gian xác định sauđó protein tạp đã bị biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm

Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 dựa trên cơ sở sự khác nhau vềkhả năng kết tủa của các protein (enzyme) ở một nồng độ muối (tính theo % nồngđộ bão hoà) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp của cácdịch enzyme Cũng có thể kết tủa phân đoạn bằng các dung môi hữu cơ Phươngpháp này chỉ dùng với những enzyme ít bị biến tính bởi các dung môi hữu cơ đượcchọn dùng Để giữ cho enzyme khỏi bị mất khả năng hoạt động, quá trình phảiđươc thực hiện ở nhiệt độ thấp (-5oC)

Phương pháp hấp phụ chọn lọc – hấp phụ “trong thể tích” (thêm chất hấp phụtrực tiếp vào dịch enzyme) hoặc trên cột (sắc ký hấp phụ) được dùng phổ biếntrong việc tách và làm sạch enzyme Chất hấp phụ chủ yếu thường được dùng làhydroxyapatit cho hiệu quả phân tách đặc biệt cao Hấp phụ chọn lọc enzyme cóthể thực hiện bằng một trong hai cách: chất hấp phụ protein tạp hoặc hấp phụenzyme Quá trình hấp phụ thường được tiến hành ở 0oC Enzyme sau đó đươc chiếtbằng các dung môi thích hợp

Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa tên cơ sở phản ứng trao đổi ion giữaprotein đđược tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổiion Tác nhân trao đổi ion có thể là nhựa trao đổi ion hoặc các dẫn xuất ester củaxelulloza (cacboxymetylxelluloza, dietylaminoetylxelluloza,trietylaminoetylxelluloza…) Phương pháp sắc ký trên dietylaminoetylxelluloza(DEAE-xelluloza) có ưu điểm là với dịch chiết thích hợp ngoài tạp chất protein còncó khả năng loại bỏ các tạp chất axit nucleic Điều đó cho phép không cần dùng