Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá

Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM Lời cảm ơn Để hoàn thành luận văn, nhận giúp đỡ từ nhiều phía Trước hết, xin cảm ơn Bộ môn Kỹ thuật Thực phẩm, Khoa Kỹ thuật Hoá học, trường Đại học Bách khoa Tp HCM tạo môi trường cho học tập nghiên cứu thời gian thực luận văn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến q thầy cô truyền đạt kiến thức kinh nghiệm làm việc quý báu gần năm năm ngồi ghế giảng đường Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến cô Trần Bích Lam tận tình hướng dẫn bảo cho em thời gian làm luận văn vừa qua Con xin cảm ơn ba mẹ hết lòng yêu thương, chăm sóc cổ vũ tinh thần cho Cuối xin gửi lòng biết ơn đến tất bạn khoa giúp đỡ suốt thời gian làm luận văn Ngày tháng năm Phạm Thò Hồng Nga SVTH: Phạm Thò Hồng Nga Trang i Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM Tóm tắt luận văn Đề tài “Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá” nhằm khảo sát hoạt tính enzyme nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus) nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme thô Các số liệu thực nghiệm việc so sánh mẫu nội tạng có mật bỏ mật cho thấy mẫu có mật hoạt tính riêng enzyme amylase thấp hơn; hoạt tính riêng enzyme protease cao hơn; hoạt tính riêng enzyme lipase cao mẫu bỏ mật Đáng ý hoạt tính riêng lipase cao nên việc thu nhận chế phẩm tập trung theo hướng tối ưu hóa điều kiện trích ly enzyme Quá trình trích ly tiến hành nhiệt độ 30 0C; thời gian trích ly 2,5 h; pH dung môi trích ly (dung dòch Na2CO3) 9; tỷ lệ nội tạng dung môi trích ly : 2,5 (theo khối lượng) thu dòch trích ly có hoạt tính riêng lipase cao 1,4257 µmol/h.mg Sử dụng dung môi kết tủa ethanol với tỷ lệ dòch trích ly ethanol (theo thể tích) 50 : 50 cho tủa có hoạt tính riêng lipase cao 7,5187 µmol/h.mg Trong trình bảo quản lạnh đông, hoạt tính riêng enzyme lipase giảm theo hàm số mũ Error: Reference source not found (với y hoạt tính riêng lipase, x ngày bảo quản) SVTH: Phạm Thò Hồng Nga Trang ii Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM MỤC LỤC TRANG BÌA .I NHIỆM VỤ LUẬN VĂN LỜI CẢM ƠN I TÓM TẮT LUẬN VĂN II MỤC LỤC III DANH SÁCH HÌNH VẼ .VI DANH SÁCH BẢNG BIỂU VII CHƯƠNG LỜI MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Cá da trơn .4 2.1.2 Cá tra 2.1.3 Tình hình sản xuất Việt Nam 2.1.4 Lượng phế liệu tận dụng phế liệu .8 2.2 Enzyme hệ tiêu hóa .10 2.2.1 Đặc điểm chung enzyme hệ tiêu hóa 10 2.2.2 Sự sản sinh enzyme hệ tiêu hóa 11 2.2.3 Đặc điểm tính chất số enzyme hệ tiêu hóa .12 2.2.4 Enzyme hệ tiêu hóa cá hoạt động chúng 20 2.3 Ứng dụng chế phẩm enzyme hệ tiêu hóa .24 2.4 Các phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme [3] .25 2.4.1 Phương pháp trích ly kết tủa muối 25 2.4.2 Phương pháp trích ly kết tủa enzyme dung môi hữu 26 2.4.3 Phương pháp sử dụng pH 27 2.4.4 Các quy trình thu nhận chế phẩm enzyme 27 SVTH: Phạm Thò Hồng Nga Trang iii Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM 2.4.5 Phương pháp tách làm enzyme 30 2.4.6 Một số chế phẩm enzyme từ động vật [3] 32 2.5 Các phương pháp xác đònh hoạt tính enzyme 34 2.5.1 Một số điểm cần lưu ý xác đònh hoạt tính enzyme [3] 34 2.5.2 Enzyme amylase 34 2.5.3 Enzyme protease 36 2.5.4 Enzyme lipase [11] .36 CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .47 3.1 Nguyên liệu 48 3.2 Hóa chất 48 3.3 Thiết bò sử dụng nghiên cứu .48 3.4 Phương pháp nghiên cứu .50 3.4.1 Sơ đồ nghiên cứu 50 3.4.2 Quy trình thuyết minh 51 3.5 Phương pháp xác đònh hàm lượng protein 53 3.6 Phương pháp xác đònh hoạt tính enzyme .54 3.6.1 Hoạt tính enzyme amylase [2, 4] 54 3.6.2 Hoạt tính enzyme protease [1] .55 3.6.3 Hoạt tính enzyme lipase .57 3.6.4 Hoạt tính riêng enzyme 58 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 60 4.1 Xây dựng đường chuẩn 61 4.2 So sánh mẫu có mật mật 62 4.3 Tối ưu trình trích ly .74 4.3.1 Khảo sát thời gian trích ly 74 4.3.2 Khảo sát tỷ lệ dung môi trích ly 77 SVTH: Phạm Thò Hồng Nga Trang iv Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM 4.3.3 Khảo sát pH dung môi trích ly 80 4.3.4 Khảo sát nhiệt độ trích ly .84 4.3.5 Tối ưu trình trích ly 86 4.4 Khảo sát trình kết tủa thu enzyme thô 91 4.5 Sự giảm hoạt tính enzyme theo thời gian 96 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 99 5.1 Kết luận 100 5.2 Kiến nghò 100 TÀI LIỆU THAM KHẢO 101 SVTH: Phạm Thò Hồng Nga Trang v Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM DANH SÁCH HÌNH VẼ HÌNH ﾧ.1 CÁ TRA .5 HÌNH ﾧ.2 MỘT SỐ ENZYME TRONG HỆ TIÊU HÓA CỦA ĐỘNG VẬT .12 HÌNH ﾧ.3 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ LÊN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME AMYLASE .13 HÌNH ﾧ.4 ẢNH HƯỞNG CỦA KETENE LÊN HOẠT TÍNH CỦA ENZYM AMYLASE .14 HÌNH ﾧ.5 HOẠT TÍNH AMYLASE Ở CÁ DA TRƠN RĂNG NHỌN 21 HÌNH ﾧ.6 HOẠT TÍNH PROTEASE Ở CÁ DA TRƠN RĂNG NHỌN 21 HÌNH ﾧ.7 HOẠT TÍNH CỦA ENZYME HỆ TIÊU HÓA CỦA CÁ DA TRƠN Ở BRAZIN .23 HÌNH ﾧ.8 SƠ ĐỒ THU NHẬN ENZYME BẰNG PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VỚI ACETON 28 HÌNH ﾧ.9 SƠ ĐỒ TÁCH CHIẾT ENZYME BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA BẰNG MUỐI (NH4)2SO4 .29 HÌNH ﾧ.10 CẤU TẠO CÁ 48 HÌNH ﾧ.11 ĐƯỜNG CHUẨN PROTEIN 61 HÌNH ﾧ.12 ĐƯỜNG CHUẨN TYROSIN 62 HÌNH ﾧ.13 SỰ TÁCH LỚP CỦA MẪU SAU TRÍCH LY THỰC HIỆN QUÁ TRÌNH LY TÂM (1-LỚP BÃ, 2-LỚP DỊCH TRÍCH LY, 3-LỚP MỢ, 4-LỚP DẦU) 63 HÌNH ﾧ.14 NỒNG ĐỘ PROTEIN TRONG MẪU M VÀ MẪU BM 64 HÌNH ﾧ.15 SO SÁNH HOẠT TÍNH ENZYME AMYLASE CỦA MẪU M, VÀ MẪU BM 67 HÌNH ﾧ.16 SO SÁNH HOẠT TÍNH ENZYME PROTEASE CỦA MẪU M, VÀ MẪU BM 68 SVTH: Phạm Thò Hồng Nga Trang vi Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM HÌNH ﾧ.17 SO SÁNH HOẠT TÍNH ENZYME LIPASE CỦA MẪU M, VÀ MẪU BM 69 HÌNH ﾧ.18 SO SÁNH HOẠT TÍNH RIÊNG ENZYME CỦA MẪU M, VÀ MẪU BM 72 HÌNH ﾧ.19 SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH PROTEASE KIỀM Ở MỘT SỐ LOÀI CÁ [19] 73 HÌNH ﾧ.20 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN TRÍCH LY ĐẾN HOẠT TÍNH RIÊNG ENZYME LIPASE 76 HÌNH ﾧ.21 ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ NỘI TẠNG VÀ DUNG MÔI TRÍCH LY ĐẾN HOẠT TÍNH RIÊNG ENZYME LIPASE 80 HÌNH ﾧ.22 ẢNH HƯỞNG CỦA PH DUNG MÔI TRÍCH LY ĐẾN HOẠT TÍNH RIÊNG ENZYME LIPASE 83 HÌNH ﾧ.23 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ TRÍCH LY ĐẾN HOẠT TÍNH RIÊNG ENZYME 86 HÌNH 4.24 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN TRÍCH LY, TỶ LỆ DUNG MÔI TRÍCH LY VÀ NỘI TẠNG LÊN HOẠT TÍNH ENZYME LIPASE 91 HÌNH ﾧ.25 ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ DỊCH TRÍCH LY VÀ ETHANOL LÊN NỒNG ĐỘ PROTEIN TAN 93 HÌNH ﾧ.26 ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ DỊCH TRÍCH LY VÀ ETHANOL LÊN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME LIPASE .94 HÌNH ﾧ.27 ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ DỊCH TRÍCH LY VÀ ETHANOL LÊN HOẠT TÍNH RIÊNG CỦA ENZYME LIPASE 95 DANH SÁCH BẢNG BIỂU BẢNG ﾧ.1 THÀNH PHẦN THỨC ĂN TRONG RUỘT CÁ TRA NGOÀI TỰ NHIÊN BẢNG ﾧ.2 KHỐI LƯNG CÁC PHẦN KHÁC NHAU CỦA CÁ TRA SVTH: Phạm Thò Hồng Nga Trang vii Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM BẢNG ﾧ.3 LƯNG ENZYME CỦA TUYẾN TỤY 33 BẢNG ﾧ.4 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN PROTEIN 61 BẢNG ﾧ.5 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN TYROSIN .62 BẢNG ﾧ.6 NỒNG ĐỘ PROTEIN TRONG DỊCH TRÍCH LY CỦA MẪU CÓ MẬT (M) VÀ MẪU BỎ MẬT (BM) .64 BẢNG ﾧ.7 HOẠT TÍNH ENZYME AMYLASE TRONG NỘI TẠNG CÁ, SO SÁNH GIỮA MẪU M VÀ MẪU BM 66 BẢNG ﾧ.8 HOẠT TÍNH ENZYME PROTEASE TRONG NỘI TẠNG CÁ, SO SÁNH GIỮA MẪU M VÀ MẪU BM 67 BẢNG ﾧ.9 HOẠT TÍNH ENZYME LIPASE TRONG NỘI TẠNG CÁ, SO SÁNH GIỮA MẪU M VÀ MẪU BM 68 BẢNG ﾧ.10 HOẠT TÍNH RIÊNG CỦA CÁC ENZYME TRONG NỘI TẠNG CÁ, SO SÁNH GIỮA MẪU M VÀ MẪU BM 70 BẢNG ﾧ.11 SỰ THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ PROTEIN THEO THỜI GIAN TRÍCH LY (T) 75 BẢNG ﾧ.12 SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH LIPASE (HTL) THEO THỜI GIAN TRÍCH LY .75 BẢNG ﾧ.13 SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH RIÊNG LIPASE (HTRL) THEO THỜI GIAN TRÍCH LY 76 BẢNG ﾧ.14 SỰ THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ PROTEIN THEO TỶ LỆ NỘI TẠNG VÀ DUNG MÔI TRÍCH LY 77 BẢNG ﾧ.15 SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH LIPASE THEO TỶ LỆ NỘI TẠNG VÀ DUNG MÔI TRÍCH LY 78 BẢNG ﾧ.16 SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH RIÊNG LIPASE THEO TỶ LỆ NỘI TẠNG VÀ DUNG MÔI TRÍCH LY 79 BẢNG ﾧ.17 SỰ THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ PROTEIN THEO PH DUNG MÔI TRÍCH LY .81 BẢNG ﾧ.18 SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH LIPASE THEO PH DUNG MÔI SVTH: Phạm Thò Hồng Nga Trang viii Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM TRÍCH LY .82 BẢNG ﾧ.19 SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH RIÊNG LIPASE THEO PH DUNG MÔI TRÍCH LY 83 BẢNG ﾧ.20 SỰ THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ PROTEIN THEO NHIỆT ĐỘ TRÍCH LY (T) .84 BẢNG ﾧ.21 SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH LIPASE THEO NHIỆT ĐỘ TRÍCH LY .85 BẢNG ﾧ.22 SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH RIÊNG LIPASE THEO NHIỆT ĐỘ TRÍCH LY .85 BẢNG ﾧ.23 BỐ TRÍ QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM 87 BẢNG ﾧ.24 NỒNG ĐỘ PROTEIN .87 BẢNG ﾧ.25 HOẠT TÍNH LIPASE 87 BẢNG ﾧ.26 HOẠT TÍNH RIÊNG LIPASE 88 BẢNG ﾧ.27 MA TRẬN QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM .88 BẢNG ﾧ.28 Ý NGHĨA CỦA CÁC HỆ SỐ ĐƯC KIỂM ĐỊNH THEO TIÊU CHUẨN T 89 BẢNG ﾧ.29 SỰ THAY ĐỔI NỒNG ĐỘ PROTEIN THEO TỶ LỆ DỊCH TRÍCH LY VÀ ETHANOL 92 BẢNG ﾧ.30 SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH LIPASE THEO TỶ LỆ DỊCH TRÍCH LY VÀ ETHANOL 94 BẢNG ﾧ.31 SỰ THAY ĐỔI HOẠT TÍNH RIÊNG LIPASE THEO TỶ LỆ DỊCH TRÍCH LY VÀ ETHANOL 95 SVTH: Phạm Thò Hồng Nga Trang ix Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương Lời mở đầu Chương Lời mở đầu Trang Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương Kết bàn luận Bảng 4ﾧ.28 Ý nghóa hệ số kiểm đònh theo tiêu chuẩn t x0 x1 x2 x1x2 0,8843 -0,2286 -0,2293 0,08342 129,978 33,6 33,708 12,2609 Hệ số PTHQ Error: Reference source not found Tra bảng tp(f) với p = 0,05 ; f=1 t0.05(1) = 12,71 Vì t13 < tp(f) nên loại hệ số b12 khỏi phương trình hồi quy vàphương trình có dạng: (*) Sự tương thích phương trình hồi quy với thực nghiệm kiểm đònh theo tiêu chuẩn Fisher: x0 (y -Error: STT x1 x2 Referenc y e source not + + + + + + - + + - 0,5098 0,8002 0,8016 1,4257 0,42637 0,88357 0,88504 1,34224 ⇒ F = 150,3293136 Tra bảng F1-p (f1,f2) với p = 0,05; f1 = 1; f2 =1 F0.95(1,1) = 161,4 F < F1-p (f1,f2) ⇒ PTHQ tương thích với thực nghiệm Từ (*) ta có phương trình hồi quy là: HTRL = 3,6317 – 0,4572t – 0,4586p Với HTRL : hoạt tính riêng lipase t thời gian trích ly : Trang 89 found)2 0,006958 0,006958 0,006958 0,006958 Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá p : Chương Kết bàn luận tỷ lệ dung môi trích ly nội tạng Trang 90 Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương Kết bàn luận Hình 4.24 Ảnh hưởng thời gian trích ly, tỷ lệ dung môi trích ly nội tạng lên hoạt tính enzyme lipase Với nhiệt độ trích ly 30 0C, sử dụng dung môi trích ly dung dòch Na 2CO3 pH 9, khoảng thời gian trích ly từ 2,5 đến 3h, tỷ lệ dung môi nguyên liệu từ 2,5 đến 3,5 hoạt tính enzyme lipase cao dòch trích ly với thời gian 2,5 h tỷ lệ nguyên liệu dung môi : 2,5 4.4 Khảo sát trình kết tủa thu enzyme thô Nội tạng cá tra sau rã đông đem xay trích ly với tỷ lệ nguyên liệu dung dòch Na2CO3 pH : 2,5 (về khối lượng), nhiệt độ 30 0C, với thời Trang 91 Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương Kết bàn luận gian trích ly 2,5 h Hỗn hợp đem lọc vải lần để thu dòch trích ly Sau đem kết tủa ethanol với tỷ lệ dòch trích ly ethanol (dt/ Et) 10 : 90; 20 : 80; 30 : 70; 40 : 60; 50 : 50; 60 : 40 để thu enzyme thô Dung môi kết tủa dòch trích ly làm lạnh đến 20 0C sau hòa vào theo tỷ lệ giữ nhiệt độ 20 0C, sau khuấy 15 phút, để lắng kết tủa 30 phút đem ly tâm với tốc độ vòng 3500 vòng/ phút 0C 10 phút Tủa pha loãng thể tích dòch trích ly trước kết tủa xác đònh nồng độ protein tan, hoạt tính enzyme lipase hoạt tính riêng enzyme lipase, xác đònh hiệu suất thu hồi độ tinh mẫu Bảng 4ﾧ.29 Sự thay đổi nồng độ protein theo tỷ lệ dòch trích ly ethanol Tỷ lệ dt/Et Mật độ quang Nồng độ protein Nồng độ protein bước sóng 750nm (A) dòch chứa dòch chứa enzyme pha loãng enzyme (µg /ml) 169,84 39,17 27,23 23,17 21,98 13,85 8,84 (mg /ml) 3,397 0,783 0,545 0,463 0,440 0,277 0,177 (v/v) L1 L2 L3 TB 100 : 10 : 90 20 : 80 30 : 70 40 : 60 50 : 50 60 : 40 0,237 0,055 0,039 0,031 0,029 0,022 0,014 0,236 0,054 0,038 0,033 0,032 0,015 0,011 0,238 0,055 0,037 0,033 0,031 0,021 0,012 0,237 0,055 0,038 0,032 0,031 0,019 0,012 Trang 92 Chương Kết bàn luận Nồng độ protein Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Tỷ lệ dòch trích ly ethanol Hình 4ﾧ.25 Ảnh hưởng tỷ lệ dòch trích ly ethanol lên nồng độ protein tan Trang 93 Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương Kết bàn luận Bảng 4ﾧ.30 Sự thay đổi hoạt tính lipase theo tỷ lệ dòch trích ly ethanol Lượng NaOH 0,1 N (ml) Tỷ lệ dt/Et Mẫu phản ứng (v/v) 100 : 10 : 90 20 : 80 30 : 70 40 : 60 50 : 50 60 : 40 20,00 6,50 6,00 7,00 7,00 10,00 9,50 20,00 6,50 6,00 7,00 7,00 11,00 9,00 TB 20,00 6,50 6,00 7,00 7,00 10,50 9,25 Mẫu trắng 17,50 5,25 5,00 6,00 6,00 7,50 7,50 17,50 5,25 5,00 6,00 6,00 8,50 8,50 TB 17,50 5,25 5,00 6,00 6,00 8,00 8,00 Lượng HTL axit dòch chứa béo enzyme 0,1 N (µmol /h (ml) 2,50 1,25 1,00 1,00 1,00 2,50 1,250 ml) 2,083 1,042 0,833 0,833 0,833 2,083 1,042 Hoạ t tính lipa se lipa seli pas e Tỷ lệ dòch trích ly ethanol ﾧ Hình 4ﾧ.26 Ảnh hưởng tỷ lệ dòch trích ly ethanol lên hoạt tính enzyme lipase Trang 94 Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương Kết bàn luận Bảng 4ﾧ.31 Sự thay đổi hoạt tính riêng lipase theo tỷ lệ dòch trích ly ethanol Tỷ lệ dt/Et (v/v) 100 : 10 : 90 20 : 80 30 : 70 40 : 60 50 : 50 60 : 40 HTL 2,083 1,042 0,833 0,833 0,833 2,083 1,042 Nồng độ protein dòch chứa enzyme (mg /ml) 3,397 0,783 0,545 0,463 0,440 0,277 0,177 HTRL 0,6133 1,3295 1,5301 1,7983 1,8960 7,5187 5,8930 Hiệu suất Độ tinh (%) 100 50 40 40 40 100 50 1,00 2,17 2,49 2,93 3,09 12,26 9,61 lipa seli pase Hoạ t tính riên g lipa se Tỷ lệ dòch trích ly enzyme dung môi Hình ﾧ 27 Ảnh hưởng tỷ lệ dòch trích ly ethanol lên hoạt tính riêng enzyme lipase Dùng dung môi kết tủa ethanol có ưu điểm thu nhận enzyme thô dạng kết tủa tiến hành công đoạn xử lý phức tạp khác để tách loại dung môi, chế phẩm sử dụng cho mục đích thực phẩm Kết nghiên cứu cho thấy sử dụng tỷ lệ dòch enzyme ethanol với tỷ lệ 50 : 50 hoạt tính riêng enzyme lipase cao Khi lượng ethanol tăng lên dẫn đến tượng vô hoạt enzyme, nồng độ ethanol thấp không đủ để kết tủa toàn Trang 95 Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương Kết bàn luận enzyme Khi sử dụng tỷ lệ dòch enzyme ethanol với tỷ lệ 50 : 50 hiệu suất thu hồi cao 100%, tủa thu có hoạt tính riêng cao nhất, độ gấp 12,26 lần so với dòch trích ly 4.5 Sự giảm hoạt tính enzyme theo thời gian Nguyên liệu nội tạng cá tra để thu hoạt tính cao cần phải tiến hành thu hồi sau giết mổ cá Khi cá sống, nội tạng tự sản sinh enzyme tiêu hóa cung cấp cho thể, cá chết trình ngừng hẳn, enzyme tự tiêu lẫn nhau, biến tính protein enzyme làm giảm hẳn hoạt tính enzyme Bảo quản lạnh đông -200C phương pháp làm hạn chế giảm hoạt tính enzyme, phản ứng diễn yếu làm giảm hoạt tính enzyme Từ số liệu trình khảo sát thu nhận trên, ta thấy hoạt tính enzyme giảm đáng kể Khi trích ly enzyme từ nội tạng cá tra nước cất với tỷ lệ nguyên liệu dung môi : (về khối lượng), thời gian 3h, nhiệt độ 30 0C Hoạt tính riêng enzyme lipase thu 1,5403 (µmol /h mg), sau ngày hoạt tính riêng (µmol /h mg) Hoạt tính riêng 0,7668 (µmol /h mg) Ngày Vẫn giữ nguyên nhiệt độ thời gian trình trích ly tương ứng 30 0C 3h, tỷ lệ nguyên liệu dung môi trích ly (nước cất) : 3, hoạt tính riêng enzyme lipase 3,1165 (µmol /h mg), sau ngày hoạt tính riêng giảm 1,8074 (µmol /h mg) Trang 96 Chương Kết bàn luận (µmol /h mg) Hoạt tính riêng Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Ngày Dùng dung môi trích ly dung dòch Na 2CO3 pH 9, tỷ lệ nguyên liệu dung môi trích ly theo khối lượng : 3, nhiệt độ 30 0C, hoạt tính riêng enzyme ban đầu 2,4788 (µmol /h mg), sau ngày hoạt tính riêng lại 1,8913 (µmol (µmol /h mg) Hoạt tính riêng /h mg), ngày hoạt tính 1,258 (µmol /h mg) Ngày Hoạt tính riêng lại (%) Chọn hoạt tính riêng cho ngày ban đầu 100 %, quy đổi giá trò hoạt tính ngày lại Trang 97 Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương Kết bàn luận Ngày Các số liệu cho thấy hoạt tính giảm nhanh ngày đầu, ngày sau hoạt tính giảm chậm dần Sự thay đổi hoạt tính biễu diễn hàm số mũ sau: (với y hoạt tính riêng lipase, x ngày bảo quản) Trang 98 Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương Kết luận kiến nghò Chương Kết luận kiến nghò Trang 99 Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương Kết luận kiến nghò 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu cho thấy: 1- Ở nội tạng cá tra enzyme lipase có hoạt tính cao Quá trình trích ly thu nhận enzyme từ nội tạng cá tra tối ưu trích ly nội tạng cá dung dòch Na 2CO3 pH 9, với tỷ lệ nội tạng dung môi : 2,5; nhiệt độ 30 0C; thời gian trích ly 2,5 h - Sử dụng ethanol làm tác nhân kết tủa với tỷ lệ 50 : 50 (v/v) nhận kết tủa có hoạt tính riêng lipase cao nhất, hiệu suất thu hồi từ dòch trích ly 100% độ tinh so với dòch trích ly cao 12,26 lần - Việc thu nhận enzyme từ nội tạng cần tiến hành thời gian sớm có thể, hoạt tính enzyme thay đổi đáng kể trình bảo quản, kể bảo quản lạnh đông 5.2 Kiến nghò Do hạn chế thời gian nên chưa khảo sát hết trình sau trích ly Chúng có số kiến nghò sau: - Khảo sát thêm chất kết tủa khác để thu hồi tủa enzyme - Khảo sát thêm ảnh hưởng yếu tố lên hoạt tính riêng enzyme trình kết tủa thời gian kết tủa, nhiệt độ kết tủa, tỷ lệ dung môi kết tủa - Tối ưu trình kết tủa - Khảo sát trình tinh tủa - Sấy thăng hoa để thu chế phẩm enzyme dạng bột khô để tăng thời gian bảo quản - Tối ưu trình sấy Trang 100 Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Bích Lam, Tôn Nữ Minh Nguyệt, Đinh Trần Nhật Thu, Thí nghiệm hoá sinh thực phẩm, Nhà xuất đại học quốc gia TPHCM, 2004 Dương Tấn Lộc, Những Điều Cần Biết Về Kỹ Thuật Sản Xuất Giống Và Nuôi Cá Tra Xuất Khẩu Nguyễn Đức Lượng người khác, Công nghệ enzym, nhà xuất đại học quốc gia TPHCM, 2004 Lê Thanh Mai người khác, Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội, 2005 Trần Quốc Hiền, Nghiên cứu thu nhận enzyme protease có phụ phẩm ngành chế biến thủy sản, Luận văn thạc só, 2005 Nguyễn Thạch Minh, Sản xuất maltodextrin có DE: 15-17 từ tinh bột khoai mỳ enzyme ứng dụng để sản xuất số sản phẩm hòa tan, Luận văn thạc só, 2002 Nguyễn Thò Thảo Minh, Nghiên cứu cố đònh enzyme α-amylase, Luận văn thạc só, 2003 Alarcon, F.J., Studies on digestive enzyme in fish: Characterization and practical applications, ciheam - options mediterraneennes Archer, M., Watson, R., Denton, J.W., Fish Waste Production in the United Kingdom_The Quantities Produced and Opportunities for Better Utilisation,The Sea Fish Industry Authority Seafish Technology, 2001 10 Bayliss, L.E Digestion in the plaice (Pleuronectes platessa) Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom, 20 (1), 1935, p 73-91 11 Beisson, F., et al, Methods for lipase detection and assay: a critical review, Eur.J.Lipid Sei Technol ,2002, 133-135 12 Bengt Persson et al, Structural features of lipoprotein lipase , Eur.J.Biochem 179, 1989, p.39-45 13 Bernfield, P., Amylase A and B, In: Colowick and N.O Kaplan (Editors), Methods in Enzymeology, 1955,Vol I Academic Press, NewYork, NY, p 149-157 14 Bruce, D.S.,Jeffrey R.H., Triacylglycerol lipase activities in tissues of Antarctic fishes – Polar Biol vol 25, 2002, p.517-522 15 Carlsen, B., The nutrition digest of essential nutrients, a concise reference for nutritional groups, the human digestive system, vitamins, minerals, enzymes, Trang 101 Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá TÀI LIỆU THAM KHẢO essential fatty acids, amino sugars and amino acids, 2005, p.170 16 Chesley L.C., The concentrations of proteases, amylase, and lipase in certain marine fishes, the Department of Zoology, Duke University, Durham, N C., and the U S Bureau of Fisheries, Woods Hole, Mass 17 Chesley, L C., The Iodine and Copper Reduction Methods for the Determination of Amylase 1934 18 Chesley, L C., The Validity of the Viscometric and Wohlgemuth Methods for the Quantitative Determination of Amylase Jour Blot Chem., 1931, p 92-171 19 Chesley, L.C., The influence of temperature upon the amylases of cold - and warm blooded animals 20 Johnson, W A., A proposed method for the routine valuation of diastase preparations Jour Am Chem Soc., 1908, 30: 798 21 Little, E.L., Caldwell, M.L., A study of the action of pancreatic amylase, The journal of biological chemistry, 1941 22 Little, E.L., Caldwell, M.L., A study of the action of pancreatic amylase, The journal of biological chemistry, 1942 23 Love, M.R - The chemical biology of fishes - Academic Press, London, U.K., p – 39, 1970 24 MacDonald, R P., Lefave, R O., Serum Lipase Determination with an Olive Oil Substrate Using a Three-Hour Incubation Period, 1961 25 McCroskey R, Chang T, David H, Winn E, p-Nitrophenylglycosides as substrates for measurement of amylase in serum and urine, 1982 26 Melo, J.F.B, Moraes, G., Induction of digestive enzymes in the brazilian catfish (Pseudoplatystoma Coruscans) 27 Mukundan, M.K., Antony, P.D., Nair, M.R., A Review on Autolysis in fish, Fisheries Research, vol (1986) 259-269 28 Robinson, E.H., A practical guide to nutrition, feeds, and feeding of catfish, Thad Cochran National Warmwater Aquaculture Center, 2001 29 Street, H.V and Close, J.R., Determination of amylase activity in biological fluids Clin Chim Acta, 1956, 256-268 30 Thierry de Laborde de Monpezat et al, A Flourimetric Method for Measuring Lipase activity Based on Umbelliferyl Esters – vol 62 , 1989, p.1640-1644 31 Ul-Haq, I., Idrees, S., Rajoka, M.I., Production of lipases by Rhizopus Trang 102 Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá TÀI LIỆU THAM KHẢO oligosporous by solid-state fermentation, Process Biochemistry, vol 37, 2002, 637641 32 Uys, W., Hecht, T., Assays on the digestive enzymes of sharptooth catfish, Clarias gariepinus (Pisces: Clariidae), Alquacultutre, Vol 63, 1987, 301-313 33 Walter, H.E., Proteinase : methods in with hemoglobin, casein and azocoll as substates In H.U.Bergmeyer (Editor), Methods of Enzymeatic Analysis, Vol V Verlag Chemie, Weinheim, pp 270 - 277 34 Young, D S., Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, 3rd Edition AACC Press, 1990 35 Żółtowska, K., Purification and characterization of α-amylases from the intestine and muscle of Ascaris suum (Nematoda) Acta Biochem, 2001, Vol 48, 763-774 36 http://en.wikipedia.org/wiki/Digestive_enzyme 37 http://sokhoahoccn.angiang.gov.vn/xemnoidung.asp?maidtt=1865 38 http://vi.wikipedia.org/wiki/B%E1%BB%99_C%C3%A1_da_tr%C6%A1n 39 http://www.fao.org/docrep/X5738E/x5738e02.htm 40 http://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=1015068&News_ID=9853974 41 http://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=7126825&news_ID=81267609 42 http://www.klaire.com/enzymesforGI.htm 43 http://www.sgtt.com.vn/web/tintuc/default.aspx?cat_id=600&news_id=21595 44 http://www.sgtt.com.vn/web/tintuc/default.aspx?cat_id=630&news_id=21593#content Trang 103 [...]... ruột, nhưng lipase của nó hoạt động bên trong tế bào Enzyme tiêu hóa của cá da trơn ở Brazin (Pseudoplatystoma Coruscans) [26] Trang 22 Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương 2 Tổng quan Hình 2ﾧ.7 Hoạt tính của enzyme hệ tiêu hóa của cá da trơn ở Brazin Hoạt tính enzyme ở một số loài cá [16]: Trang 23 Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương 2 Tổng quan Hoạt tính lipase (xác đònh theo... chế phẩm enzyme thô Trang 2 Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương 2 Tổng quan Chương 2 Tổn g quan Trang 3 Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương 2 Tổng quan 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Cá da trơn Phân loại khoa học Giới (regnum) : Animalia Ngành (phylum) Lớp (class) : : Chordata Actinopterygii Siêu bộ (superordo) : Ostariophysi Bộ (ordo) Siluriformes : Bộ Cá da trơn hay bộ Cá nheo (danh... xúc tại các khu vực chế biến cá Xuất phát từ thực tế này chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Trong khuôn khổ luận văn, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu các nội dung sau: - Khảo sát hoạt tính của các enzyme trong nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus) - Khảo sát các thông số của quá trình trích ly enzyme - Tối ưu hóa quá trình trích ly - Thu nhận chế... 73 kDa, và enzyme amylase từ cơ là 59kDa α-amylase từ ruột có pH tối ưu là 7,4 và từ cơ có pH tối ưu là 8,2 Enzyme từ cơ chòu nhiệt được hơn enzyme từ ruột Cả amylase từ cơ và từ ruột đều giảm nửa hoạt tính sau 15 phút tương ứng ở 700C và 500C Giá trò Km: Trang 14 Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương 2 Tổng quan Amylase từ cơ là: 0,22 g/ml glycogen, và 3,33 g/ml tinh bột Amylase từ ruột là:... nhận enzyme từ phế liệu cá Hình 2ﾧ.5 Hoạt tính amylase ở cá da trơn răng nhọn Hình 2ﾧ.6 Hoạt tính protease ở cá da trơn răng nhọn Cá bơn sao: [10] Trang 21 Chương 2 Tổng quan Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương 2 Tổng quan Dạ dày có khả năng thủy phân protein nhờ enzyme pepsin, chất béo và cacbonhydrat thì không bò tấn công ở dạ dày Trong ruột, protein bò thủy phân nhiều hơn nhờ enzyme. .. khuyếch tán enzyme và cơ chất mà còn là tác nhân tham gia vào phản ứng Nước có ảnh hưởng không những tới vận tốc Trang 19 Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương 2 Tổng quan mà cả đến chiều hướng của phản ứng thủy phân bởi enzyme Nó cũng là 1 yếu tố điều chỉnh các phản ứng thu phân bởi enzyme, có thể dùng làm nhân tố tăng cường hay kìm hãm các phản ứng thu phân có enzyme xúc tác 2.2.4 Enzyme. .. chính của cá tra, chứa nhiều enzyme tiêu hóa, nên cần thiết nghiên cứu và tận thu nguồn enzyme này Trang 9 Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương 2 Tổng quan 2.2 Enzyme hệ tiêu hóa 2.2.1 Đặc điểm chung của enzyme hệ tiêu hóa Sự tiêu hóa thức ăn ở động vật gồm chủ yếu là một chuỗi những quá trình hóa sinh học xảy ra ở miệng, dạ dày, ruột làm giảm kích thước phân tử và làm hòa tan các thành... nóng tới 39 oC Cá tra có số lượng hồng cầu trong máu nhiều hơn các loài cá khác Cá có cơ quan hô hấp phụ và còn có thể hô hấp bằng bóng khí và da nên chòu đựng được môi trường nước thiếu oxy Trang 5 Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương 2 Tổng quan hòa tan Tiêu hao oxy và ngưỡng oxy của cá tra thấp hơn 3 lần so với cá mè trắng [2] Cá tra có ngưỡng oxi thấp hơn cá basa (do cá basa không có... Những ứng dụng khác của enzyme từ cá bao gồm việc sản xuất FPC (fish protein concentrate) dùng làm nguồn dinh dưỡng bổ sung vào thức ăn cho động vật sống dưới nước để hỗ trợ cho việc tiêu hóa [9] Trang 24 Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương 2 Tổng quan Ở Pháp, enzyme từ cá được sử dụng trong thương mại để phục hồi những gia vò từ cá và động vật có vỏ Về cơ bản, nguyên liệu được nấu chảy để... với cá cao hơn so với động vật có vú, với amylase của cá là 0,5 N Tốc độ thủy phân tinh bột tỷ lệ nghòch với nồng độ enzyme khi lượng enzyme quá lớn [16, 19] Những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme amylase: thời gian thủy phân càng dài thì hoạt tính enzyme càng giảm, tỉ lệ giữa enzyme và cơ chất, nhiệt độ phản ứng, pH, nồng độ ion.[16, 19] Trang 12 Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương ... ly enzyme - Tối ưu hóa trình trích ly - Thu nhận chế phẩm enzyme thô Trang Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương Tổng quan Chương Tổn g quan Trang Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu. . .Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM Tóm tắt luận văn Đề tài Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá nhằm khảo sát hoạt tính enzyme nội tạng cá tra (Pangasius... 95 SVTH: Phạm Thò Hồng Nga Trang ix Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương Lời mở đầu Chương Lời mở đầu Trang Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá Chương Lời mở đầu Hàng năm, sản