a. Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên cơ sở enzyme amylase thủy phân tinh bột tới các dextrin có phân tử lượng khác nhau tùy mức độ thủy phân. Sản phẩm thủy phân sẽ có màu khác nhau với I2. Bằng cách đo mật độ quang của dung dịch thủy phân sẽ tính được hoạt tính enzyme.
Hoạt tính enzyme amylase được biểu thị là số µg tinh bột được thủy phân do 1 ml dịch enzyme, trong 1 phút ở 35oC, pH 7.2.
b. Hóa chất và dịch chiết enzyme: Dung dịch đệm photphat pH 7,2. Dung dịch HCl 0,1 N.
Dung dịch iot gốc: Hòa tan 0,25 g iot và 2,5 g KI với 1 lượng nhỏ nước cất. Lắc nhẹ để hỗn hợp hòa tan hoàn toàn, sau đó chuyển dung dịch sang bình định mức 100 ml, bổ sung nước cất đến vạch mức. Bảo quản dung dịch trong bình màu nâu ở chổ tối trong thời gian 1 tháng.
Dung dịch iot phân tích: Pha loãng 2 ml dung dịch iot gốc với dung dịch HCl 0,1 N trong bình định mức dung tích 100ml. Trước khi sử dụng cần kiểm tra mật độ quang của nó trên máy so màu quang điện ở bước sóng λ = 453 nm với chiều dày cuvet 1mm. Mật độ quang của dung dịch phải có giá trị 0,160 (±0.001). Nếu có sai lệch về mật độ quang phải hiệu chỉnh bằng cách thêm 1 vài giọt axit HCl hoặc dung dịch iot gốc.
50 ml nước cất trong bình định mức 100ml, lắc đều. Đặt vào bếp cách thủy đang sôi, lắc liên tục cho đến khi tinh bột tan hoàn toàn. Sau đó làm nguội bình và bổ sung 10ml dung dịch đệm phophat 7,2. Bổ sung nước cất đến vạch mức, lắc đều. Dung dịch được chuẩn bị trong ngày sử dụng.
Dịch enzyme pha loãng: lấy 10 ml dịch chứa enzyme, bổ sung 2,5 ml đệm phophat 7,2 ; 12,5 ml dung dịch NaCl 0,1N. Giữ hỗn hợp ở nhiệt độ 35oC trong thời gian một giờ.
c. Cách tiến hành:
Cho vào ống nghiệm 5 ml dung dịch tinh bột 1%, đặt vào bể điều nhiệt có nhiệt độ 35 oC trong 10 phút để ổn định. Bổ sung vào 10 ml dịch enzyme pha loãng. Lắc đều. Lấy từ ống nghiệm 0,1 ml hỗn hợp phản ứng cho vào ống nghiệm khác chứa 10ml dung dịch iot phân tích, lắc đều. Để 15 phút, đo cường độ màu của dung dịch ở bước sóng λ = 656nm so với nước cất, ta được giá trị D1. Sau 4 tiếng phản ứng, tiến hành đo mật độ quang tương tự như trên ta có được giá trị D2.
d. Tính toán kết quả:
HTA : số đơn vị hoạt tính trong 1 ml dịch enzyme t : thời gian phản ứng (giờ);
D1 : mật độ quang ban đầu;
D2 : mật độ quang sau 4 giờ phản ứng;
C : lượng tinh bột ban đầu tham gia phản ứng (mg). V : thể tích dịch enzyme.