Luận án tiến sĩ nghiên cứu thu nhận, đánh giá đặc tính của lipase thực vật và khả năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG   PHAN THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU THU NHẬN, ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA LIPASE THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT ĐÀ NẴNG 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG PHAN THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU THU NHẬN, ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA LIPASE THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm Mã số : 62.54.01.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS ĐẶNG MINH NHẬT PGS.TS TRẦN THỊ XƠ ĐÀ NẴNG 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Việc tham khảo nguồn tài liệu trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo quy định Người cam đoan Phan Thị Việt Hà MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài .1 Mục tiêu nghiên cứu 3 Nội dung nghiên cứu .3 Phƣơng pháp nghiên cứu 4.1 Phƣơng pháp nghiên cứu lý thuyết 4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài .5 Bố cục luận án CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan lipase 1.1.1 Nguồn thu nhận lipase 1.1.2 Cấu trúc chế xúc tác lipase 1.1.3 Tính đặc hiệu lipase 10 1.1.4 Các hệ phản ứng cho lipase xúc tác 11 1.2 Lipase thực vật 12 1.2.1 Khả xúc tác lipase thực vật 12 1.2.2 Một số nguồn lipase từ thực vật 13 1.2.3 Phƣơng pháp chiết tách lipase từ thực vật 17 1.2.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ lipase thực vật 19 1.2.5 Ứng dụng lipase thực vật 21 1.2.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm 21 1.2.5.2 Trong công nghiệp dƣợc 22 1.2.5.3 Trong lĩnh vực khác 23 1.3 Dầu cá ứng dụng lipase làm giàu DHA, EPA dầu cá 24 1.3.1 Dầu cá 24 1.3.2 Ứng dụng lipase làm giàu DHA, EPA dầu cá 26 1.4 Lƣợc sử vấn đề nghiên cứu 28 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 28 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 34 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 Nguyên liệu 38 2.1.1 Nguyên liệu hạt 38 2.1.2 Nguyên liệu phụ phẩm nông nghiệp (cám gạo, phôi lúa mì) 38 2.1.3 Nguyên liệu mủ từ loại 39 2.2 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 40 2.2.1 Hóa chất 40 2.2.2 Thiết bị 40 2.3 Nội dung nghiên cứu 41 2.4 Bố trí thí nghiệm 42 2.4.1 Phần 1: Đánh giá khả thu nhận lipase từ nguồn thực vật: đậu nành, đậu phộng nảy mầm, cám gạo, phơi mì, mủ sung, mủ vả, mủ đu đủ 42 2.4.2 Phần 2: Nghiên cứu thu nhận lipase thô từ mủ đu đủ 49 2.4.3 Phần 3: Chiết tách tinh lipase từ lipase thô mủ đu đủ 51 2.4.4 Phần 4: Nghiên cứu tính chất lipase tinh 52 2.4.5 Phần 5: Phƣơng pháp nghiên cứu ứng dụng lipase thô 53 2.5 Phƣơng pháp phân tích 61 2.5.1 Phƣơng pháp hóa học xác định thành phần nguyên liệu 61 2.5.2 Phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase phƣơng pháp chuẩn độ 61 2.5.3 Phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase phƣơng pháp đo quang 62 2.5.4 Phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch 62 2.5.5 Phƣơng pháp xác định điểm đẳng điện lipase 62 2.5.6 Phƣơng pháp kết tủa phân đoạn lipase với muối amoni sunfat 63 2.5.7 Phƣơng pháp tinh lipase sắc ký trao đổi ion 63 2.5.8 Phƣơng pháp điện di 64 2.5.9 Phƣơng pháp xác định đặc tính hóa lý dầu cá 64 2.5.10 Phƣơng pháp xác định thành phần acid béo có dầu cá hồi 65 2.5.11 Phƣơng pháp xác định hiệu suất thủy phân dầu cá hồi xúc tác CPL 65 2.5.12 Phƣơng pháp xác định thông số động học Km Vmax phản ứng thủy phân dầu cá hồi CPL 65 2.5.13 Phƣơng pháp xác định lƣợng hoạt hóa 66 2.5.14 Phƣơng pháp phân tích số liệu thực nghiệm 67 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 68 3.1 Đánh giá khả thu nhận lipase từ số nguồn thực vật 68 3.1.1 Hoạt tính lipase từ loại hạt có dầu nảy mầm 68 3.1.2 Hoạt tính lipase từ phụ phẩm nơng nghiệp: cám gạo phơi lúa mì 74 3.1.3 Hoạt tính lipase từ mủ loại 79 3.1.4 Đánh giá khả thu nhận lipase từ nguồn thực vật khác 86 3.2 Thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ 87 3.2.1 Các phƣơng pháp bảo quản mủ đu đủ 87 3.2.2 Thu nhận enzyme thô 90 3.2.3 Kết khảo sát khả thủy phân lipase thô từ mủ đu đủ chất khác 96 3.3 Tinh enzyme lipase từ mủ đu đủ 99 3.3.1 Chiết tách lipase mủ đu đủ muối sodium lauroyl sarcosinate (SLS) 99 3.3.2 Ảnh hƣởng nồng độ SLS lên hoạt độ lipase 101 3.3.3 Tủa lipase dung dịch amoni sunfat (AS) 102 3.3.4 Kết xác định điểm đẳng điện protein enzyme 103 3.3.5 Kết tinh enzyme lipase từ mủ đu đủ sắc ký trao đổi ion 104 3.4 Tính chất lipase tinh 104 3.4.1 Kết xác định khối lƣợng phân tử lipase 104 3.4.2 Xác định Km Vmax 105 3.5 Đánh giá khả ứng dụng lipase mủ đu đủ quy trình sản xuất dầu cá giàu DHA EPA 106 3.5.1 Một số đặc điểm dầu cá hồi thô 106 3.5.2 Xác định thành phần acid béo có dầu cá hồi 107 3.5.3 Ứng dụng lipase từ mủ đu đủ để thủy phân dầu cá hồi 109 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 127 A KẾT LUẬN 127 B NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 128 C KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 128 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CƠNG BỐ 129 TÀI LIỆU THAM KHẢO 130 DANH MỤC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt Lipase từ mủ đu đủ CPL Carica papaya lipase DHA Docosahexaenoic acid EPA Eicosapentaenoic acid PUFAs Polyunsaturated fatty acids p-NPP Para-nitrophenyl palmitate p-NP Para-nitrophenol OD Optical density Mật độ quang AS Ammonium sulfate Amoni sunfat TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam DH Degree of hydrolysis TAG Triacylglycerol SLS Sodium Lauroyl Saccosine CHAPS EDTA Acid béo khơng bão hịa nhiều nối đôi Hiệu suất thủy phân 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate Ethylene Diamine Tetracetic Acid Acid etylenediaminetetraacetic DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu Tên bảng Trang Bảng 1.1 Tính chất số lipase có nguồn gốc từ hạt [72] 14 Bảng 1.2 Tính chất lipase từ số loại hạt chứa dầu 30 Bảng 1.3 Tính chất lipase từ số loại hạt ngũ cốc 31 Bảng 1.4 Tính chất lipase từ số loại mủ 32 Bảng 2.1 Một số hóa chất d ng nghiên cứu 40 Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng yếu tố nhiệt độ, pH ion kim loại đến hoạt độ lipase 48 Bảng 2.3 Khoảng biến thiên yếu tố thực nghiệm 55 Bảng 2.4 Ma trận quy hoạch thực nghiệm 55 Bảng 2.5 Khoảng biến thiên yếu tố thực nghiệm 56 Bảng 2.6 Ma trận quy hoạch thực nghiệm 57 Bảng 2.7 Khoảng biến thiên yếu tố thực nghiệm 60 Bảng 2.8 Ma trận quy hoạch thực nghiệm 60 Bảng 3.1 Thành phần hóa học hạt đậu nành, đậu phộng 68 Bảng 3.2 Thành phần hóa học cám gạo phơi lúa mì 75 Bảng 3.3 Thành phần hóa học mủ đu đủ 79 Bảng 3.4 Hiệu thu nhận lipase từ nguồn thực vật 86 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng phƣơng pháp sấy khác lên hoạt độ lipase 88 Bảng 3.6 Sự thay đổi hoạt độ lipase mủ đu đủ theo thời gian trữ đông 89 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng tỷ lệ nƣớc đến hiệu thu nhận lipase thô 90 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng số lần lặp rửa – ly tâm đến hiệu thu nhận lipase thô 92 Bảng 3.9 Hoạt độ chế phẩm lipase thô thu phƣơng pháp sấy khác 93 Bảng 3.10 Hoạt độ CPL sau loại lipid chiết tách với SLS 100 Bảng 3.11 Hoạt tính CPL sau hịa tan mà khơng loại lipid 100 Bảng 3.12 Hoạt tính lipase thu đƣợc phân đoạn tủa khác 102 Bảng 3.13 Các số chất lƣợng dầu cá hồi thô 107 Bảng 3.14 Thành phần hàm lƣợng acid béo dầu cá hồi 108 Bảng 3.15 Phần trăm acid béo có dầu cá hồi trƣớc sau thủy phân 110 Bảng 3.16 Hiệu suất phản ứng thủy phân qua thí nghiệm 111 Bảng 3.17 Giá trị hệ số b phƣơng trình hồi quy xác suất p 112 Bảng 3.18 Hiệu suất phản ứng thủy phân qua thí nghiệm 114 Bảng 3.19 Giá trị hệ số b phƣơng trình hồi quy xác suất p 114 Bảng 3.20 Hiệu suất thủy phân dầu cá hệ phản ứng khác 116 Bảng 3.21 Hiệu suất phản ứng thủy phân qua thí nghiệm 120 Bảng 3.22 Hiệu suất phản ứng thủy phân qua thí nghiệm 121 Bảng 3.23 Tốc độ ban đầu phản ứng thu đƣợc nồng độ chất khác thủy phân dầu cá hồi CPL thời gian 60 phút 123 Bảng 3.24 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến số tốc độ (k) 125 Phụ lục 34 Số liệu xác định nhiệt độ pH tối ƣu cho hiệu suất trình thủy phân dầu cá hồi CPL Số thí nhiệt độ pH (x2) X1 X2 HS nghiệm (x1) 35,0000 8,00000 0,00000 0,00000 36,9 35,0000 8,00000 0,00000 0,00000 37,8 40,0000 9,00000 1,00000 1,00000 25,8 40,0000 7,00000 1,00000 -1,00000 32,9 30,0000 9,00000 -1,00000 1,00000 35,0 30,0000 7,00000 -1,00000 -1,00000 38,9 42,0711 8,00000 1,41421 0,00000 32,2 27,9289 8,00000 -1,41421 0,00000 37,7 35,0000 9,41421 0,00000 1,41421 24,8 10 35,0000 6,58579 0,00000 -1,41421 36,7 Central Composite Design Design Summary Factors: Replicates: Base runs: 10 Total runs: 10 Base blocks: Total blocks: α = 1,41421 Two-level factorial: Full factorial Point Types Cube points: Center points in cube: Axial points: Center points in axial: Response Surface Regression: HS versus nhiệt độ, pH Analysis of Variance Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value Model 213,283 42,6566 14,56 0,011 Linear 162,807 81,4036 27,79 0,005 nhiệt độ 66,000 65,9996 22,53 0,009 pH 96,808 96,8076 33,05 0,005 Square 47,916 23,9580 8,18 0,039 nhiệt độ*nhiệt độ 5,786 5,7857 1,98 0,233 pH*pH 47,546 47,5457 16,23 0,016 2-Way Interaction 2,560 2,5600 0,87 0,403 nhiệt độ*pH 2,560 2,5600 0,87 0,403 Error 11,718 2,9294 PL 30 Lack-of-Fit 11,313 3,7709 9,31 0,235 Pure Error 0,405 0,4050 Total 225,001 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 1,71156 94,79% 88,28% 63,53% Coded Coefficients Term Coef SE Coef T-Value P-Value VIF Constant 37,35 1,21 30,86 0,000 nhiệt độ -4,062 0,856 -4,75 0,009 1,00 pH -4,920 0,856 -5,75 0,005 1,00 nhiệt độ*nhiệt độ -2,25 1,60 -1,41 0,233 1,23 pH*pH -6,45 1,60 -4,03 0,016 1,23 nhiệt độ*pH -1,60 1,71 -0,93 0,403 1,00 Regression Equation in Uncoded Units HS = -221,0 + 3,86 nhiệt độ + 53,7 pH - 0,0450 nhiệt độ*nhiệt độ - 3,225 pH*pH - 0,160 nhiệt độ*pH Biểu đồ đƣờng mức biểu đồ mặt đáp biểu ảnh hƣởng nhiệt độ, pH đến hiệu suất thủy phân đƣợc thể Hình 3.33 Hình 3.34 Contour Plot of HS vs pH, nhiệt độ 20 24 28 32 9.0 pH 8.5 HS < – – – – > 20 24 28 32 36 36 8.0 7.5 7.0 30.0 32.5 35.0 nhiệt độ 37.5 40.0 Hình 3.1 Biểu đồ đƣờng mức biểu thị ảnh hƣởng nhiệt độ, pH đến hiệu suất thủy phân PL 31 Surface Plot of HS vs pH , nhiệt độ 40 HS 30 20 30 pH 35 nhiệt độ 40 Hình 3.2 Biểu đồ mặt đáp biểu thị ảnh hƣởng nhiệt độ, pH đến hiệu suất thủy phân Phụ lục 35 Số liệu xác định tỷ lệ nƣớc/cơ chất nồng độ enzyme tối ƣu cho hiệu suất trình thủy phân dầu cá hồi CPL Response Surface Regression: HS versus Nước/cơ chất, độ Enzyme Analysis of Variance D FPSource F Adj SS Adj MS Value Value Model 821,784 164,357 8,62 0,029 Linear 613,334 306,667 16,08 0,012 Nước/cơ chất 302,921 302,921 15,88 0,016 Nồng độ Enzyme 310,413 310,413 16,28 0,016 Square 173,640 86,820 4,55 0,093 Nước/cơ chất*Nước/cơ chất 164,178 164,178 8,61 0,043 Nồng độ Enzyme*Nồng độ 68,380 68,380 3,59 0,131 Enzyme 2-Way Interaction 34,810 34,810 1,83 0,248 Nước/cơ chất*Nồng độ Enzyme 34,810 34,810 1,83 0,248 Error 76,285 19,071 Lack-of-Fit 75,785 25,262 50,52 0,103 Pure Error 0,500 0,500 Total 898,069 Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 4,36706 91,51% 80,89% 39,77% Coded Coefficients Term Coef SE Coef T-Value P-Value VIF Constant 46,20 3,09 14,96 0,000 PL 32 Nước/cơ chất 8,70 2,18 3,99 Nồng độ Enzyme 8,81 2,18 4,03 Nước/cơ chất*Nước/cơ chất -11,98 4,08 -2,93 Nồng độ Enzyme*Nồng độ Enzyme -7,73 4,08 -1,89 Nước/cơ chất*Nồng độ Enzyme -5,90 4,37 -1,35 Regression Equation in Uncoded Units H = -125,9 + 60,0 Nước/cơ chất + 67,0 Nồng độ Enzyme S 5,99 Nước/cơ chất*Nước/cơ chất - 15,47 Nồng độ Enzyme*Nồng độ Enzyme 5,90 Nước/cơ chất*Nồng độ Enzyme 0,016 0,016 0,043 0,131 0,248 1,00 1,00 1,22 1,22 1,00 Contour Plot of HS vs Nồng độ Enzyme, Nước/cơ chất HS < 10 10 – 20 20 – 30 30 – 40 > 40 Nồ ng độ Enzyme 1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 3.0 3.5 4.0 4.5 Nước/cơ chất 5.0 Hình 3.3 Biểu đồ đƣờng mức biểu thị ảnh hƣởng lƣợng nƣớc/cơ chất nồng độ enzyme đến hiệu suất thủy phân Surface Plot of HS vs Nồng độ Enzyme, Nước/cơ chất 45 HS 30 15 0 Nồng độ Enzyme Nước/cơ chất Hình 3.4 Biểu đồ mặt đáp biểu thị ảnh hƣởng tỷ lệ nƣớc/cơ chất nồng độ enzyme đến hiệu suất thủy phân PL 33 Phụ lục 3.36 Tối ưu hóa trình thủy phân dầu cá hệ pha isooctan/nước Xác định nồng độ KOH Mẫu lặp 10,30 Thể tích dung dịch KOH Mẫu lặp 10,35 (ml) chuẩn độ với 10ml dung dịch acid oxalic 0,1N Trung bình 10,33 Nồng độ dung dịch KOH (N) 0,097 Thí nghiệm 10 11 12 13 14 T1 T2 T3 Thể tích KOH chuẩn độ ứng với mẫu lặp (ml) Mẫu lặp Mẫu lặp Mẫu lặp 13,45 13,20 13,55 13,80 13,90 14,30 12,20 12,10 12,30 11,40 11,50 11,90 13,80 13,70 13,30 13,95 13,65 13,80 14,05 14,45 14,55 11,75 11,80 11,85 13,65 13,80 13,95 12,00 12,20 11,95 13,75 13,95 13,85 14,20 14,40 14,15 14,50 14,70 14,45 13,15 13,35 13,25 14,90 14,80 15,15 14,95 15,25 15,15 15,20 15,30 15,60 Thí nghiệm Nồng độ enzyme (%) 1,8 1,6 1,4 1,6 1,4 1,94 1,8 1,4 Ti lệ dung môi/cơ chất (w/w) 1,5 1,84 1,5 1,5 0,5 0,5 Nhiệt độ (oC) Thể tích KOH trung bình (ml) 30 35 30 26,6 40 35 40 30 13,40 14,00 12,20 11,60 13,60 13,80 14,35 11,80 Thể tích KOH trung bình (ml) 13,40 14,00 12,20 11,60 13,60 13,80 14,35 11,80 13,80 12,05 13,85 14,25 14,55 13,25 14,95 15,12 15,36 Chỉ số acid Hiệu suất thủy phân (%) 72,81 76,07 66,29 63,03 73,89 74,98 77,97 64,11 30,8 32,4 27,5 25,9 31,3 31,9 33,4 26,4 PL 34 10 11 12 13 14 T1 T2 T3 1,4 1,26 1,6 1,8 1,8 1,6 1,6 1,6 1,6 0,5 1 1,5 0,5 0,16 1 40 35 43,4 40 30 35 35 35 35 13,80 12,05 13,85 14,25 14,55 13,25 14,95 15,12 15,36 74,98 65,47 75,25 77,43 79,06 71,99 81,23 82,15 83,49 31,9 27,1 32,0 33,1 33,9 30,4 35,0 35,5 36,1 Response Surface Regression: Hiệu suất thủy phân (%) nhiệt độ (độ C) Analysis of Variance Source Model Linear Nồng độ enzyme (%) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nhiệt độ (độ C) Square Nồng độ enzyme (%)*Nồng độ enzyme (%) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nhiệt độ (độ C)*Nhiệt độ (độ C) 2-Way Interaction Nồng độ enzyme (%)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nồng độ enzyme (%)*Nhiệt độ (độ C) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Nhiệt độ (độ C) Error Lack-of-Fit Pure Error Total DF Adj SS 143,75 69,374 35,958 0,016 33,400 65,298 37,487 14,971 Adj MS 15,9728 FValue 8,35 23,1247 35,9585 0,0155 33,4001 21,7659 37,4872 14,9707 12,09 18,80 0,01 17,46 11,38 19,60 7,83 45,904 9,084 1,901 45,9041 3,0279 1,9012 24,00 1,58 0,99 1 7,031 0,151 7,0312 0,1513 3,68 0,08 16 13,387 12,780 0,607 157,14 1,9124 2,5560 0,3033 8,43 PL 35 Source Model Linear Nồng độ enzyme (%) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nhiệt độ (độ C) Square Nồng độ enzyme (%)*Nồng độ enzyme (%) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nhiệt độ (độ C)*Nhiệt độ (độ C) 2-Way Interaction Nồng độ enzyme (%)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nồng độ enzyme (%)*Nhiệt độ (độ C) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Nhiệt độ (độ C) Error Lack-of-Fit Pure Error Total Model Summary S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred) 1,38290 91,48% 80,53% 35,12% Coded Coefficients Term Constant Nồng độ enzyme (%) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nhiệt độ (độ C) Nồng độ enzyme (%)*Nồng độ enzyme (%) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nhiệt độ (độ C)*Nhiệt độ (độ C) Nồng độ enzyme (%)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nồng độ enzyme (%)*Nhiệt độ (độ C) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Nhiệt độ (độ C) Term P-Value 0,005 0,004 0,003 0,931 0,004 0,004 0,003 0,027 0,002 0,277 0,352 0,097 0,787 0,109 SE Coef 0,797 TValue 44,47 PValue 0,000 0,633 0,629 0,629 1,17 1,17 4,34 0,09 4,18 -4,43 -2,80 0,003 0,931 0,004 0,003 0,027 -5,71 -1,39 1,17 1,40 -4,90 -1,00 0,002 0,352 -2,68 0,39 1,40 1,38 VIF -1,92 0,28 0,097 0,787 Coef 35,45 2,746 0,057 2,628 -5,18 -3,26 PL 36 Constant Nồng độ enzyme (%) 1,00 Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) 1,00 Nhiệt độ (độ C) 1,00 Nồng độ enzyme (%)*Nồng độ enzyme (%) 1,16 Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) 1,16 Nhiệt độ (độ C)*Nhiệt độ (độ C) 1,16 Nồng độ enzyme (%)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) 1,00 Nồng độ enzyme (%)*Nhiệt độ (độ C) 1,00 Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Nhiệt độ (độ C) 1,00  Regression Equation in Uncoded Units Hiệu suất thủy phân (%) = -265,4 + 189,2 Nồng độ enzyme (%) + 15,2 Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) + 7,42 Nhiệt độ (độ C) - 44,8 Nồng độ enzyme (%)*Nồng độ enzyme (%) -4,62 Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) - 0,0810 Nhiệt độ (độ C)*Nhiệt độ (độ C) - 4,87 Nồng độ enzyme (%)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) - 0,937 Nồng độ enzyme (%)*Nhiệt độ (độ C) + 0,055 Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Nhiệt độ (độ C) Fits and Diagnostics for Unusual Observations Hiệu suất thủy phân Std Obs (%) Fit Resid Resid 15 33,900 32,060 1,840 2,31 R R Large residual Effects Pareto for Hiệu suất thủy phân (%) Các biểu đồ đường mức biểu đồ mặt đáp biểu thị ảnh hưởng yếu tố đến hiệu suất thủy phân thể Hình 3.40, Hình 3.41, Hình 3.42, Hình 3.43, Hình 3.44, Hình 3.45 PL 37 Contour Plot of Hiệu suất th vs Nồng độ enzyme (%), Nhiệt độ (độ C) Hiệu suất thủy phân (%) < 20 20 – 25 25 – 30 30 – 35 > 35 1.9 1.7 1.6 Hold Values Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nồ ng độ enzyme (%) 1.8 1.5 1.4 1.3 28 30 32 34 36 38 Nhiệt độ (độ C) 40 42 Hình 3.5 Biểu đồ đƣờng mức biểu thị ảnh hƣởng nồng độ enzyme nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân Surface Plot of Hiệu suất thủy phân (%) vs Nhiệt độ (độ C), Nồng độ en Hold Values Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) 35 30 suất t hủy p hân (%) 25 45 20 40 35 1.2 1 30 Nhiệt độ (độ C ) 1.8 Nồ ng độ enzyme (%) Hình 3.6 Biểu đồ mặt đáp biểu thị ảnh hƣởng nồng độ enzyme nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân Từ biểu đồ đường mức biểu thị ảnh hưởng nồng độ enzyme nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân cho thấy vùng có hiệu suất thủy phân cao nằm khoảng nồng độ enzyme (1,57 – 1,8%) nhiệt độ (34 – 38,7oC) PL 38 Contour Plot of Hiệu suất th vs Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w), Nhiệt độ 1.8 Hiệu suất thủy phân (%) < 25.0 25.0 – 27.5 27.5 – 30.0 30.0 – 32.5 32.5 – 35.0 > 35.0 Tỉ lệ dung mô hấ i/ c t (w/w) 1.6 1.4 1.2 1.0 Hold Values Nồng độ enzyme (%) 1.6 0.8 0.6 0.4 0.2 28 30 32 34 36 38 40 Nhiệt độ (độ C) 42 Hình 3.7 Biểu đồ đƣờng mức biểu thị ảnh hƣởng nồng độ enzyme tỷ lệ dung môi/cơ chất đến hiệu suất thủy phân Surface Plot of Hiệu suất thủy phân (%) vs Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w Hold Values Nhiệt độ (độ C) 35 35 suất thủy phân (%) 30 25 1.0 1.4 Nồng độ enzyme (%) 1.8 Tỉ lệ dung mơi/cơ chất (w 0.0 Hình 3.8 Biểu đồ mặt đáp biểu thị ảnh hƣởng nồng độ enzyme tỷ lệ dung môi/cơ chất đến hiệu suất thủy phân Từ biểu đồ đường mức biểu thị ảnh hưởng nồng độ enzyme tỷ lệ dung môi/cơ chất đến hiệu suất thủy phân cho thấy vùng có hiệu suất thủy phân cao nằm khoảng nồng độ enzyme (1,6 – 1,8%) tỷ lệ dung môi/cơ chất (0,65 – 1,25) PL 39 Contour Plot of Hiệu suất th vs Nhiệt độ (độ C), Tỉ lệ dung môi/cơ chấ Hiệu suất thủy phân (%) < 25.0 25.0 – 27.5 27.5 – 30.0 30.0 – 32.5 32.5 – 35.0 > 35.0 42 iệ Nh t độ (độ C) 40 38 36 Hold Values Nồng độ enzyme (%) 1.6 34 32 30 28 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Tỉ lệ dung mơi/cơ chất (w/w) 1.6 1.8 Hình 3.9 Biểu đồ đƣờng mức biểu thị ảnh hƣởng tỷ lệ dung môi/cơ chất nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân Surface Plot of Hiệu suất thủy phân (%) vs Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w Hold Values Nồng độ enzyme (%) 1.6 35 u suất t hủy phân (%) 30 25 30 0.5 Tỉ lệ d ung mô i /cơ chất (w/ 35 Nhiệt độ (độ C) 40 45 0.0 Hình 3.10 Biểu đồ mặt đáp biểu thị ảnh hƣởng tỷ lệ dung môi/cơ chất nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân Từ biểu đồ đường mức biểu thị ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/cơ chất nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân cho thấy vùng có hiệu suất thủy phân cao nằm khoảng nhiệt độ (35,3 – 39oC) tỷ lệ dung môi/cơ chất (0,75 – 1,28) PL 40 Phụ lục 3.37 Kiểm chứng điều kiện tối ưu thực nghiệm trình thủy phân dầ cá hồi CPL hệ pha iso-octan/nước Xác định nồng độ KOH Mẫu lặp 10,30 Thể tích dung dịch KOH Mẫu lặp 10,30 (ml) chuẩn độ với 10ml dung dịch acid oxalic 0,1N Trung bình 10,30 Nồng độ dung dịch KOH (N) 0,097 Thể tích KOH chuẩn độ ứng với mẫu lặp (ml) 15,05 15,10 15,30 Thể tích KOH trung bình (ml) Chỉ số acid Hiệu suất thủy phân (%) 15,15 82,52 35,7 Phụ lục 3.38 Xác định Km Vmax Xác định nồng độ KOH Mẫu lặp Thể tích dung dịch KOH Mẫu lặp (ml) chuẩn độ với 10ml dung dịch acid oxalic 0,1N Trung bình Nồng độ dung dịch KOH (N) 11,05 11,00 11,03 0,091 Nồng độ chất dầu cá hồi [S] ban đầu xác định số mol acid béo liên kết có 1ml thể tích hỗn hợp Số mol acid béo liên kết xác định thơng qua số ester số xà phịng trừ số acid Thể tích (V) V hỗn hợp = V nước cất + V dung dịch đệm + V dầu + V dung môi = + + khối lượng dầu.Khối lượng riêng dầu + khối lượng dung môi.Khối lượng riêng dung môi = + khối lượng dầu.0,892 + khối lượng dung môi.0,69 (ml) [S] = số mol dầu/V hỗn hợp =khối lượng dầu/( M dầu V hỗn hợp) M dầu = M glycerol + 3M = 38,5 - M M acid béo =  n i Mi acid béo – 3MH2O acid béo xi 100 xi: tỷ lệ % theo khối lượng acid béo thành phần thứ i PL 41 M i : khối lượng phân tử acid béo thành phần thứ i n: số acid béo có mặt dầu KLPT trung bình acid béo dầu cá hồi myristic acid methyl ester palmitic acid ester palmitoleic acid methyl ester stearic acid methyl ester oleic acid methyl ester linoleic acid methyl ester arachidic acid methyl ester linolenic acid methyl ester cis-11-eicosenoic acid methyl ester cis-11,14-eicosadienoic acid methyl ester EPA DHA sum KLPT TB dầu cá hồi Tính nồng độ chất ban đầu [S] Khối Chỉ số Chỉ số Chỉ số lượng acid xà phịng este dầu (g) hóa 11,65 210,4 198,75 11,65 210,4 198,75 11,65 210,4 198,75 11,65 210,4 198,75 xi% Mi M i , xi 2,87 10,8 2,86 2,65 36,3 14,9 0,32 5,4 0,88 2,24 4,53 5,02 88,77 880,42 228,4 256,4 254,4 284,5 282,5 280,4 312,5 278,4 310,5 308,5 302,5 328,5 655,508 2769,12 727,584 753,925 10254,75 4177,96 100 1503,36 273,24 691,04 1370,325 1649,07 280,79 Số mol acid béo Thể tích hỗn hợp liên kết (ml) 3549,462 6,57 7098,924 7,7 10648,386 8,82 14197,848 9,94 Nồng độ chất [S] 540,253 921,938 1207,3 1428,355 PL 42 Dầu cá Nồng độ chất [S] 1/[S] 1gam 540,25 0,0019 2gam 921,94 0,0011 3gam 1207,3 0,0008 4gam 1428,36 0,0007 Thời gian VKOH (phút) 15 30 45 60 15 30 45 60 15 30 45 60 15 30 45 60 7,1 9,17 11,9 15,45 số mol KOH 643,9909297 831,7460317 1079,365079 1401,360544 số mol FFA số mol FFA tạo thành (*) V hỗn hợp 643,9909297 436,3260456 6,57 831,7460317 624,0811476 6,57 1079,365079 871,7001952 6,57 1401,360544 1193,69566 6,57 9,95 902,4943311 902,4943311 487,1645628 13,51 1225,396825 1225,396825 810,0670571 17,45 1582,76644 1582,76644 1167,436672 22,05 2000 2000 1584,670232 480,8602229 945,2593158 1277,232105 1948,433919 7,7 7,7 7,7 7,7 12,17 17,29 20,95 28,35 1103,854875 1568,253968 1900,226757 2571,428571 1103,854875 1568,253968 1900,226757 2571,428571 8,82 8,82 8,82 8,82 15,25 22,3 26,02 34,55 1383,219955 2022,675737 2360,090703 3133,786848 1383,219955 552,5604181 9,94 2022,675737 1192,0162 9,94 2360,090703 1529,431166 9,94 3133,786848 2303,127312 9,94 Nồng Tốc độ độ FFAs phản 1/v tạo ứng thành (v) 66,4 95 132,7 181,7 2,86 0,35 63,3 105,2 151,6 205,8 3,33 0,3 54,5 107,2 144,8 220,9 3,55 0,282 55,6 119,9 153,9 231,7 3,74 0,267 PL 43 Ghi chú: Số mol FFA tạo thành (*) = số mol FFA - số mol FFA ban đầu Số mol FFA ban đầu = 207,6649 Phụ lục 3.39 Xác định lượng hoạt hóa E Xác định nồng độ KOH Mẫu lặp 11,45 Thể tích dung dịch KOH Mẫu lặp 11,55 (ml) chuẩn độ với 10ml dung dịch acid oxalic 0,1N Trung bình 11,50 Nồng độ dung dịch KOH (N) 0,087 Nhiệt độ (K) 298 303 308 Thể tích KOH lần lặp (ml) 10,70 10,60 10,65 13,05 13,15 13,15 17,00 17,10 16,90 Thể tích KOH trung bình (ml) Nồng độ FFAs tạo thành đầu (µmol FFAs) Vận tốc phản ứng đầu (µmol FFAs/phút,ml) 10,65 109,4 1,82 13,12 142,0 2,37 17,00 193,6 3,23 PL 44