luận án tiến sĩ nghiên cứu thu nhận, đánh giá đặc tính của lipase thực vật và khả năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG  PHAN THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU THU NHẬN, ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA LIPASE THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT ĐÀ NẴNG 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG PHAN THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU THU NHẬN, ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA LIPASE THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm Mã số : 62.54.01.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS ĐẶNG MINH NHẬT PGS.TS TRẦN THỊ XƠ ĐÀ NẴNG 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Việc tham khảo nguồn tài liệu trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo quy định Người cam đoan Phan Thị Việt Hà MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu 3 Nội dung nghiên cứu Phƣơng pháp nghiên cứu 4.1 Phƣơng pháp nghiên cứu lý thuyết 4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Bố cục luận án CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan lipase 1.1.1 Nguồn thu nhận lipase 1.1.2 Cấu trúc chế xúc tác lipase 1.1.3 Tính đặc hiệu lipase 10 1.1.4 Các hệ phản ứng cho lipase xúc tác 11 1.2 Lipase thực vật 12 1.2.1 Khả xúc tác lipase thực vật 12 1.2.2 Một số nguồn lipase từ thực vật 13 1.2.3 Phƣơng pháp chiết tách lipase từ thực vật 17 1.2.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ lipase thực vật .19 1.2.5 Ứng dụng lipase thực vật 21 1.2.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm 21 1.2.5.2 Trong công nghiệp dƣợc 22 1.2.5.3 Trong lĩnh vực khác 23 1.3 Dầu cá ứng dụng lipase làm giàu DHA, EPA dầu cá 24 1.3.1 Dầu cá 24 1.3.2 Ứng dụng lipase làm giàu DHA, EPA dầu cá 26 1.4 Lƣợc sử vấn đề nghiên cứu 28 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 28 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 34 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 Nguyên liệu 38 2.1.1 Nguyên liệu hạt 38 2.1.2 Nguyên liệu phụ phẩm nơng nghiệp (cám gạo, phơi lúa mì) .38 2.1.3 Nguyên liệu mủ từ loại 39 2.2 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 40 2.2.1 Hóa chất 40 2.2.2 Thiết bị 40 2.3 Nội dung nghiên cứu 41 2.4 Bố trí thí nghiệm 42 2.4.1 Phần 1: Đánh giá khả thu nhận lipase từ nguồn thực vật: đậu nành, đậu phộng nảy mầm, cám gạo, phơi mì, mủ sung, mủ vả, mủ đu đủ 42 2.4.2 Phần 2: Nghiên cứu thu nhận lipase thô từ mủ đu đủ 49 2.4.3 Phần 3: Chiết tách tinh lipase từ lipase thô mủ đu đủ .51 2.4.4 Phần 4: Nghiên cứu tính chất lipase tinh 52 2.4.5 Phần 5: Phƣơng pháp nghiên cứu ứng dụng lipase thô .53 2.5 Phƣơng pháp phân tích 61 2.5.1 Phƣơng pháp hóa học xác định thành phần nguyên liệu .61 2.5.2 Phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase phƣơng pháp chuẩn độ 61 2.5.3 Phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase phƣơng pháp đo quang 62 2.5.4 Phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch 62 2.5.5 Phƣơng pháp xác định điểm đẳng điện lipase 62 2.5.6 Phƣơng pháp kết tủa phân đoạn lipase với muối amoni sunfat 63 2.5.7 Phƣơng pháp tinh lipase sắc ký trao đổi ion .63 2.5.8 Phƣơng pháp điện di 64 2.5.9 Phƣơng pháp xác định đặc tính hóa lý dầu cá 64 2.5.10 Phƣơng pháp xác định thành phần acid béo có dầu cá hồi 65 2.5.11 Phƣơng pháp xác định hiệu suất thủy phân dầu cá hồi xúc tác CPL 65 2.5.12 Phƣơng pháp xác định thông số động học Km Vmax phản ứng thủy phân dầu cá hồi CPL 65 2.5.13 Phƣơng pháp xác định lƣợng hoạt hóa 66 2.5.14 Phƣơng pháp phân tích số liệu thực nghiệm .67 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 68 3.1 Đánh giá khả thu nhận lipase từ số nguồn thực vật .68 3.1.1 Hoạt tính lipase từ loại hạt có dầu nảy mầm 68 3.1.2 Hoạt tính lipase từ phụ phẩm nơng nghiệp: cám gạo phơi lúa mì 74 3.1.3 Hoạt tính lipase từ mủ loại 79 3.1.4 Đánh giá khả thu nhận lipase từ nguồn thực vật khác 86 3.2 Thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ 87 3.2.1 Các phƣơng pháp bảo quản mủ đu đủ 87 3.2.2 Thu nhận enzyme thô 90 3.2.3 Kết khảo sát khả thủy phân lipase thô từ mủ đu đủ chất khác 96 3.3 Tinh enzyme lipase từ mủ đu đủ 99 3.3.1 Chiết tách lipase mủ đu đủ muối sodium lauroyl sarcosinate (SLS) 99 3.3.2 Ảnh hƣởng nồng độ SLS lên hoạt độ lipase .101 3.3.3 Tủa lipase dung dịch amoni sunfat (AS) 102 3.3.4 Kết xác định điểm đẳng điện protein enzyme 103 3.3.5 Kết tinh enzyme lipase từ mủ đu đủ sắc ký trao đổi ion 104 3.4 Tính chất lipase tinh 104 3.4.1 Kết xác định khối lƣợng phân tử lipase 104 3.4.2 Xác định Km Vmax 105 3.5 Đánh giá khả ứng dụng lipase mủ đu đủ quy trình sản xuất dầu cá giàu DHA EPA 106 3.5.1 Một số đặc điểm dầu cá hồi thô 106 3.5.2 Xác định thành phần acid béo có dầu cá hồi 107 3.5.3 Ứng dụng lipase từ mủ đu đủ để thủy phân dầu cá hồi 109 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 127 A KẾT LUẬN 127 B NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 128 C KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 128 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CƠNG BỐ 129 TÀI LIỆU THAM KHẢO 130 DANH MỤC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh CPL Carica papaya lipase DHA Docosahexaenoic acid EPA Eicosapentaenoic acid PUFAs Polyunsaturated fatty acids p-NPP Para-nitrophenyl palmitate p-NP Para-nitrophenol Tiếng Việt Lipase từ mủ đu đủ Acid béo không bão hịa nhiều nối đơi OD Optical density Mật độ quang AS TCVN Ammonium sulfate Amoni sunfat DH Degree of hydrolysis TAG Triacylglycerol SLS Sodium Lauroyl Saccosine 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate CHAPS EDTA Tiêu chuẩn Việt Nam Ethylene Diamine Tetracetic Acid Hiệu suất thủy phân Acid etylenediaminetetraacetic DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu Bảng 1.1 Bảng 1.2 Bảng 1.3 Bảng 1.4 Bảng 2.1 Bảng 2.2 Bảng 2.3 Bảng 2.4 Bảng 2.5 Bảng 2.6 Bảng 2.7 Bảng 2.8 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Bảng 3.10 Bảng 3.11 Bảng 3.12 Bảng 3.13 Bảng 3.14 Bảng 3.15 Bảng 3.16 Bảng 3.17 Bảng 3.18 Bảng 3.19 Bảng 3.20 Bảng 3.21 Bảng 3.22 Bảng 3.23 Bảng 3.24 Source Model Linear Nồng độ enzyme (%) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nhiệt độ (độ C) Square Nồng độ enzyme (%)*Nồng độ enzyme (%) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nhiệt độ (độ C)*Nhiệt độ (độ C) 2-Way Interaction Nồng độ enzyme (%)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nồng độ enzyme (%)*Nhiệt độ (độ C) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Nhiệt độ (độ C) Error Lack-of-Fit Pure Error Total Model Summary S 1,38290 Coded Coefficients Term Constant Nồng độ enzyme (%) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nhiệt độ (độ C) Nồng độ enzyme (%)*Nồng độ enzyme (%) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nhiệt độ (độ C)*Nhiệt độ (độ C) Nồng độ enzyme (%)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nồng độ enzyme (%)*Nhiệt độ (độ C) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Nhiệt độ (độ C) Term Constant Nồng độ enzyme (%) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nhiệt độ (độ C) Nồng độ enzyme (%)*Nồng độ enzyme (%) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nhiệt độ (độ C)*Nhiệt độ (độ C) Nồng độ enzyme (%)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nồng độ enzyme (%)*Nhiệt độ (độ C) Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Nhiệt độ (độ C)  Hiệu suất thủy phân (%) Regression Equation in Uncoded Units = -265,4 + 189,2 Nồng độ enzyme (%) + 15,2 Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) + 7,42 Nhiệt độ (độ C) - 44,8 Nồng độ enzyme (%)*Nồng độ enzyme (%) -4,62 Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) - 0,0810 Nhiệt độ (độ C)*Nhiệt độ (độ C) - 4,87 Nồng độ enzyme (%)*Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) - 0,937 Nồng độ enzyme (%)*Nhiệt độ (độ C) + 0,055 Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w)*Nhiệt độ (độ C) Fits and Diagnostics for Unusual Observations Hiệu suất Obs 15 R Large residual Effects Pareto for Hiệu suất thủy phân (%) Các biểu đồ đường mức biểu đồ mặt đáp biểu thị ảnh hưởng yếu tố đến hiệu suất thủy phân thể Hình 3.40, Hình 3.41, Hình 3.42, Hình 3.43, Hình 3.44, Hình 3.45 PL 37 Nồ ng độ enzyme (%) Contour Plot of Hiệu suất th vs Nồng độ enzyme (%), Nhiệt độ (độ C) Hình 3.5 Biểu đồ đƣờng mức biểu thị ảnh hƣởng nồng độ enzyme nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân Surface Plot of Hiệu suất thủy phân (%) vs Nhiệt độ (độ C), Nồng độ en Hold Values Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Nồng độ enzyme (%) Hình 3.6 Biểu đồ mặt đáp biểu thị ảnh hƣởng nồng độ enzyme nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân Từ biểu đồ đường mức biểu thị ảnh hưởng nồng độ enzyme nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân cho thấy vùng có hiệu suất thủy phân cao nằm o khoảng nồng độ enzyme (1,57 – 1,8%) nhiệt độ (34 – 38,7 C) PL 38 Tỉ lệ dung mô i/ c hấ t (w/w) Contour Plot of Hiệu suất th vs Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w), Nhiệt độ Hình 3.7 Biểu đồ đƣờng mức biểu thị ảnh hƣởng nồng độ enzyme tỷ lệ dung môi/cơ chất đến hiệu suất thủy phân Surface Plot of Hiệu suất thủy phân (%) vs Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w Hold Values Nhiệt độ (độ C) 35 35 suất thủy phân (%)30 25 1.2 Nồng độ enzyme (%) Hình 3.8 Biểu đồ mặt đáp biểu thị ảnh hƣởng nồng độ enzyme tỷ lệ dung môi/cơ chất đến hiệu suất thủy phân Từ biểu đồ đường mức biểu thị ảnh hưởng nồng độ enzyme tỷ lệ dung môi/cơ chất đến hiệu suất thủy phân cho thấy vùng có hiệu suất thủy phân cao nằm khoảng nồng độ enzyme (1,6 – 1,8%) tỷ lệ dung môi/cơ chất (0,65 – 1,25) PL 39 Contour Plot of Hiệu suất th vs Nhiệt độ (độ C), Tỉ lệ dung môi/cơ chấ Hiệu suất thủy phân (%) Nh iệ độ (độ C ) 42 40 Hold Values Nồng độ enzyme (%) 1.6 t 38 36 34 32 30 28 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w) Hình 3.9 Biểu đồ đƣờng mức biểu thị ảnh hƣởng tỷ lệ dung môi/cơ chất nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân Surface Plot of Hiệu suất thủy phân (%) vs Tỉ lệ dung môi/cơ chất (w/w Hold Values Nồng độ enzyme (%) 1.6 35 u suất thủy phân (%)30 Hình 3.10 Biểu đồ mặt đáp biểu thị ảnh hƣởng tỷ lệ dung môi/cơ chất nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân Từ biểu đồ đường mức biểu thị ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/cơ chất nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân cho thấy vùng có hiệu suất thủy phân cao nằm o khoảng nhiệt độ (35,3 – 39 C) tỷ lệ dung môi/cơ chất (0,75 – 1,28) PL 40 Phụ lục 3.37 Kiểm chứng điều kiện tối ưu thực nghiệm trình thủy phân dầ cá hồi CPL hệ pha iso-octan/nước Xác định nồng độ KOH T du Nồng độ dung dịch KOH (N) Thể tích KOH chuẩn độ ứng với mẫu lặp (ml) 15,05 15,10 15,30 Phụ lục 3.38 Xác định Km Vmax T du Nồng độ dung dịch KOH (N) Nồng độ chất dầu cá hồi [S] ban đầu xác định số mol acid béo liên kết có 1ml thể tích hỗn hợp Số mol acid béo liên kết xác định thông qua số ester số xà phịng trừ số acid Thể tích (V) V hỗn hợp = V nước cất + V dung dịch đệm + V dầu + V dung môi = + + khối lượng dầu.Khối lượng riêng dầu + khối lượng dung môi.Khối lượng riêng dung môi = + khối lượng dầu.0,892 + khối lượng dung môi.0,69 (ml) [S] = số mol dầu/V hỗn hợp =khối lượng dầu/( M dầu V hỗn hợp) M dầu = M = M glycerol +3 M acid béo – 3MH2O 38,5 - M acid béo acid béo = xi: tỷ lệ % theo khối lượng acid béo thành phần thứ i PL 41 M i : khối lượng phân tử acid béo thành phần thứ i n: số acid béo có mặt dầu KLPT trung bình acid béo dầu cá hồi myristic acid methyl ester palmitic acid ester palmitoleic acid methyl ester stearic acid methyl ester oleic acid methyl ester linoleic acid methyl ester arachidic acid methyl ester linolenic acid methyl ester cis-11-eicosenoic acid methyl ester cis-11,14-eicosadienoic acid methyl ester EPA DHA sum KLPT TB dầu cá hồi Tính nồng độ chất ban đầu [S] Khối lượng dầu (g) Chỉ số acid 11,65 11,65 11,65 11,65 PL 42 Dầu cá Nồng độ 1/[S] chất [S] 1gam 540,25 0,0019 921,94 0,0011 1207,3 0,0008 1428,36 0,0007 2gam 3gam 4gam PL 43 Ghi chú: Số mol FFA tạo thành (*) = số mol FFA - số mol FFA ban đầu Số mol FFA ban đầu = 207,6649 Phụ lục 3.39 Xác định lượng hoạt hóa E Xác định nồng độ KOH Nồng độ dung dịch KOH (N) Nhiệt độ (K) 298 303 308 PL 44 ... cho luận án: "Nghiên cứu thu nhận, đánh giá đặc tính lipase thực vật khả ứng dụng công nghiệp thực phẩm" thực có ý nghĩa khoa học thực tiễn Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu luận án đánh giá khả khai...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG PHAN THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU THU NHẬN, ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA LIPASE THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG CƠNG NGHIỆP THỰC PHẨM Chun ngành : Cơng nghệ thực phẩm. .. thơ lipase tinh sạch; - Đánh giá khả ứng dụng lipase thô công nghiệp thực phẩm Nội dung nghiên cứu Để đạt đƣợc mục tiêu nghiên cứu nhƣ trên, đề tài xác định nội dung cần thực nhƣ sau: - Nghiên cứu