BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG PHAN THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU THU NHẬN, ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA LIPASE THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT ĐÀ NẴ[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG PHAN THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU THU NHẬN, ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA LIPASE THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT ĐÀ NẴNG 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG PHAN THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU THU NHẬN, ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA LIPASE THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm Mã số : 62.54.01.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS ĐẶNG MINH NHẬT PGS.TS TRẦN THỊ XƠ ĐÀ NẴNG 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Việc tham khảo nguồn tài liệu trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo quy định Người cam đoan Phan Thị Việt Hà MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài .1 Mục tiêu nghiên cứu 3 Nội dung nghiên cứu .3 Phƣơng pháp nghiên cứu 4.1 Phƣơng pháp nghiên cứu lý thuyết 4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài .5 Bố cục luận án CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan lipase 1.1.1 Nguồn thu nhận lipase 1.1.2 Cấu trúc chế xúc tác lipase 1.1.3 Tính đặc hiệu lipase 10 1.1.4 Các hệ phản ứng cho lipase xúc tác 11 1.2 Lipase thực vật 12 1.2.1 Khả xúc tác lipase thực vật 12 1.2.2 Một số nguồn lipase từ thực vật 13 1.2.3 Phƣơng pháp chiết tách lipase từ thực vật 17 1.2.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ lipase thực vật 19 1.2.5 Ứng dụng lipase thực vật 21 1.2.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm 21 1.2.5.2 Trong công nghiệp dƣợc 22 1.2.5.3 Trong lĩnh vực khác 23 1.3 Dầu cá ứng dụng lipase làm giàu DHA, EPA dầu cá 24 1.3.1 Dầu cá 24 1.3.2 Ứng dụng lipase làm giàu DHA, EPA dầu cá 26 1.4 Lƣợc sử vấn đề nghiên cứu 28 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 28 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 34 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 Nguyên liệu 38 2.1.1 Nguyên liệu hạt 38 2.1.2 Nguyên liệu phụ phẩm nông nghiệp (cám gạo, phôi lúa mì) 38 2.1.3 Nguyên liệu mủ từ loại 39 2.2 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 40 2.2.1 Hóa chất 40 2.2.2 Thiết bị 40 2.3 Nội dung nghiên cứu 41 2.4 Bố trí thí nghiệm 42 2.4.1 Phần 1: Đánh giá khả thu nhận lipase từ nguồn thực vật: đậu nành, đậu phộng nảy mầm, cám gạo, phơi mì, mủ sung, mủ vả, mủ đu đủ 42 2.4.2 Phần 2: Nghiên cứu thu nhận lipase thô từ mủ đu đủ 49 2.4.3 Phần 3: Chiết tách tinh lipase từ lipase thô mủ đu đủ 51 2.4.4 Phần 4: Nghiên cứu tính chất lipase tinh 52 2.4.5 Phần 5: Phƣơng pháp nghiên cứu ứng dụng lipase thô 53 2.5 Phƣơng pháp phân tích 61 2.5.1 Phƣơng pháp hóa học xác định thành phần nguyên liệu 61 2.5.2 Phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase phƣơng pháp chuẩn độ 61 2.5.3 Phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase phƣơng pháp đo quang 62 2.5.4 Phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch 62 2.5.5 Phƣơng pháp xác định điểm đẳng điện lipase 62 2.5.6 Phƣơng pháp kết tủa phân đoạn lipase với muối amoni sunfat 63 2.5.7 Phƣơng pháp tinh lipase sắc ký trao đổi ion 63 2.5.8 Phƣơng pháp điện di 64 2.5.9 Phƣơng pháp xác định đặc tính hóa lý dầu cá 64 2.5.10 Phƣơng pháp xác định thành phần acid béo có dầu cá hồi 65 2.5.11 Phƣơng pháp xác định hiệu suất thủy phân dầu cá hồi xúc tác CPL 65 2.5.12 Phƣơng pháp xác định thông số động học Km Vmax phản ứng thủy phân dầu cá hồi CPL 65 2.5.13 Phƣơng pháp xác định lƣợng hoạt hóa 66 2.5.14 Phƣơng pháp phân tích số liệu thực nghiệm 67 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 68 3.1 Đánh giá khả thu nhận lipase từ số nguồn thực vật 68 3.1.1 Hoạt tính lipase từ loại hạt có dầu nảy mầm 68 3.1.2 Hoạt tính lipase từ phụ phẩm nơng nghiệp: cám gạo phơi lúa mì 74 3.1.3 Hoạt tính lipase từ mủ loại 79 3.1.4 Đánh giá khả thu nhận lipase từ nguồn thực vật khác 86 3.2 Thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ 87 3.2.1 Các phƣơng pháp bảo quản mủ đu đủ 87 3.2.2 Thu nhận enzyme thô 90 3.2.3 Kết khảo sát khả thủy phân lipase thô từ mủ đu đủ chất khác 96 3.3 Tinh enzyme lipase từ mủ đu đủ 99 3.3.1 Chiết tách lipase mủ đu đủ muối sodium lauroyl sarcosinate (SLS) 99 3.3.2 Ảnh hƣởng nồng độ SLS lên hoạt độ lipase 101 3.3.3 Tủa lipase dung dịch amoni sunfat (AS) 102 3.3.4 Kết xác định điểm đẳng điện protein enzyme 103 3.3.5 Kết tinh enzyme lipase từ mủ đu đủ sắc ký trao đổi ion 104 3.4 Tính chất lipase tinh 104 3.4.1 Kết xác định khối lƣợng phân tử lipase 104 3.4.2 Xác định Km Vmax 105 3.5 Đánh giá khả ứng dụng lipase mủ đu đủ quy trình sản xuất dầu cá giàu DHA EPA 106 3.5.1 Một số đặc điểm dầu cá hồi thô 106 3.5.2 Xác định thành phần acid béo có dầu cá hồi 107 3.5.3 Ứng dụng lipase từ mủ đu đủ để thủy phân dầu cá hồi 109 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 127 A KẾT LUẬN 127 B NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 128 C KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 128 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CƠNG BỐ 129 TÀI LIỆU THAM KHẢO 130 DANH MỤC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt Lipase từ mủ đu đủ CPL Carica papaya lipase DHA Docosahexaenoic acid EPA Eicosapentaenoic acid PUFAs Polyunsaturated fatty acids p-NPP Para-nitrophenyl palmitate p-NP Para-nitrophenol OD Optical density Mật độ quang AS Ammonium sulfate Amoni sunfat TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam DH Degree of hydrolysis TAG Triacylglycerol SLS Sodium Lauroyl Saccosine CHAPS EDTA Acid béo khơng bão hịa nhiều nối đôi Hiệu suất thủy phân 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate Ethylene Diamine Tetracetic Acid Acid etylenediaminetetraacetic DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu Tên bảng Trang Bảng 1.1 Tính chất số lipase có nguồn gốc từ hạt [72] 14 Bảng 1.2 Tính chất lipase từ số loại hạt chứa dầu 30 Bảng 1.3 Tính chất lipase từ số loại hạt ngũ cốc 31 Bảng 1.4 Tính chất lipase từ số loại mủ 32 Bảng 2.1 Một số hóa chất d ng nghiên cứu 40 Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng yếu tố nhiệt độ, pH ion kim loại đến hoạt độ lipase 48 Bảng 2.3 Khoảng biến thiên yếu tố thực nghiệm 55 Bảng 2.4 Ma trận quy hoạch thực nghiệm 55 Bảng 2.5 Khoảng biến thiên yếu tố thực nghiệm 56 Bảng 2.6 Ma trận quy hoạch thực nghiệm 57 Bảng 2.7 Khoảng biến thiên yếu tố thực nghiệm 60 Bảng 2.8 Ma trận quy hoạch thực nghiệm 60 Bảng 3.1 Thành phần hóa học hạt đậu nành, đậu phộng 68 Bảng 3.2 Thành phần hóa học cám gạo phơi lúa mì 75 Bảng 3.3 Thành phần hóa học mủ đu đủ 79 Bảng 3.4 Hiệu thu nhận lipase từ nguồn thực vật 86 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng phƣơng pháp sấy khác lên hoạt độ lipase 88 Bảng 3.6 Sự thay đổi hoạt độ lipase mủ đu đủ theo thời gian trữ đông 89 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng tỷ lệ nƣớc đến hiệu thu nhận lipase thô 90 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng số lần lặp rửa – ly tâm đến hiệu thu nhận lipase thô 92 Bảng 3.9 Hoạt độ chế phẩm lipase thô thu phƣơng pháp sấy khác 93 Bảng 3.10 Hoạt độ CPL sau loại lipid chiết tách với SLS 100 Bảng 3.11 Hoạt tính CPL sau hịa tan mà khơng loại lipid 100 Bảng 3.12 Hoạt tính lipase thu đƣợc phân đoạn tủa khác 102 Bảng 3.13 Các số chất lƣợng dầu cá hồi thô 107 Bảng 3.14 Thành phần hàm lƣợng acid béo dầu cá hồi 108 Bảng 3.15 Phần trăm acid béo có dầu cá hồi trƣớc sau thủy phân 110 Bảng 3.16 Hiệu suất phản ứng thủy phân qua thí nghiệm 111 Bảng 3.17 Giá trị hệ số b phƣơng trình hồi quy xác suất p 112 Bảng 3.18 Hiệu suất phản ứng thủy phân qua thí nghiệm 114 Bảng 3.19 Giá trị hệ số b phƣơng trình hồi quy xác suất p 114 Bảng 3.20 Hiệu suất thủy phân dầu cá hệ phản ứng khác 116 Bảng 3.21 Hiệu suất phản ứng thủy phân qua thí nghiệm 120 Bảng 3.22 Hiệu suất phản ứng thủy phân qua thí nghiệm 121 Bảng 3.23 Tốc độ ban đầu phản ứng thu đƣợc nồng độ chất khác thủy phân dầu cá hồi CPL thời gian 60 phút 123 Bảng 3.24 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến số tốc độ (k) 125 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Số hiệu Tên hình Trang Hình 1.1 Mơ hình cấu trúc 3D Arabidopsis thaliana lipase Hình 1.2 Cơ chế phản ứng thủy phân liên kết ester xúc tác esterase lipase Hình 1.3 Phản ứng xúc tác lipase khơng đặc hiệu đặc hiệu vị trí sn 1, sn 11 Hình 1.4 Cấu trúc phân tử DHA, EPA 25 Hình 1.5 Quy trình tổng hợp glyceride giàu DHA, EPA [37] 27 Hình 2.1 Hạt đậu nành (a) hạt đậu phộng (b) 38 Hình 2.2 Phơi lúa mì (a) cám gạo (b) 38 Hình 2.3 Vƣờn thu nhận mủ đu đủ 39 Hình 2.4 Quả vả (a) sung (b) 39 Hình 2.5 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 41 Hình 2.6 Sơ đồ quy trình thu lipase từ hạt đậu phộng, đậu nành nảy mầm 43 Hình 2.7 Sơ đồ quy trình thu lipase thơ từ cám gạo, phơi lúa mì 44 Hình 2.8 Sơ đồ quy trình thu lipase thơ từ mủ đu đủ Lipase thô thu đƣợc từ mủ đu đủ đƣợc dùng thí nghiệm khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ lipase 46 Hình 2.9 Thu nhận mủ vả 47 Hình 2.10 Sơ đồ khảo sát trình thủy phân dầu cá hồi enzyme lipase thơ từ mủ đu đủ 58 Hình 3.1 Hình thái hạt đậu nành nảy mầm theo thời gian theo thứ tự từ - ngày 69 Hình 3.2 Hình thái hạt đậu phộng nảy mầm theo thời gian 69 Hình 3.3 Hoạt độ lipase thời gian nảy mầm hạt đậu nành, đậu phộng 70 Hình 3.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ hạt đậu nành nảy mầm 71 Hình 3.5 Ảnh hƣởng pH đến hoạt độ lipase từ hạt đậu nành nảy mầm 72 Hình 3.6 Ảnh hƣởng ion kim loại đến hoạt độ lipase từ hạt đậu nành nảy mầm 73 Hình 3.7 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ cám gạo phơi lúa mì 76 Hình 3.8 Ảnh hƣởng pH đến hoạt độ lipase từ cám gạo phơi lúa mì 77 Hình 3.9 Ảnh hƣởng ion kim loại đến hoạt độ lipase từ cám gạo 78 Hình 3.10 Lipase thơ từ mủ đu đủ 80 Hình 3.11 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ 80 Hình 3.12 Ảnh hƣởng pH đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ 81 Hình 3.13 Ảnh hƣởng ion kim loại đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ 82 Hình 3.14 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới hoạt độ lipase mủ sung mủ vả 83 Hình 3.15 Ảnh hƣởng pH tới hoạt độ lipase từ mủ sung mủ vả 84 Hình 3.16 Ảnh hƣởng ion kim loại tới hoạt độ lipase từ mủ sung, mủ vả 85 Hình 3.17 Mủ đu đủ thu đƣợc sau phơi nắng, sấy đối lƣu, sấy thăng hoa 89 Hình 3.18 Ảnh hƣởng tỷ lệ mủ đu đủ/nƣớc đến hoạt độ riêng hoạt độ tổng CPL 91 Hình 3.19 Ảnh hƣởng số lần lặp rửa – ly tâm đến hoạt độ riêng hoạt độ tổng CPL 92 Hình 3.20 Mẫu lipase từ mủ đu đủ sau sấy đối lƣu (a) sấy thăng hoa (b) 94 Hình 3.21 Quy trình thu lipase thơ từ mủ đu đủ 95 Hình 3.22 Hoạt độ chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đủ chất khác 96 Hình 3.23 Khả thủy phân lipase chất dầu cá hồi 98 Hình 3.24 Khả thủy phân lipase chất dầu cọ 98 Hình 3.25 Ảnh hƣởng nồng độ SLS đến hoạt độ lipase từ mủ đu đủ 101 Hình 3.26 Đồ thị độ đục dung dịch enzyme lipase pH khác 103 Hình 3.27 Sắc ký đồ phân đoạn lipase tủa 50-60% AS 104 Hình 3.28 Hình ảnh điện di SDS 105 Hình 3.29 Đồ thị Lineweaver-Burk xác định Km (mM) Vmax (mM/min/mL) lipase từ mủ đu đủ 106 Hình 3.30 Điều kiện tối ƣu nhiệt độ, pH phản ứng thủy phân dầu cá hệ nhũ tƣơng dầu – nƣớc 113 Hình 3.31 Điều kiện tối ƣu tỷ lệ nƣớc/cơ chất nồng độ enzyme phản ứng thủy phân dầu cá hệ nhũ tƣơng dầu – nƣớc 115 Hình 3.32 Ảnh hƣởng nồng enzyme đến hiệu suất thủy phân 117 Hình 3.33 Ảnh hƣởng tỷ lệ dung môi/cơ chất đến hiệu suất thủy phân 118 Hình 3.34 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân 119 Hình 3.35 Điều kiện tối ƣu phản ứng thủy phân dầu cá hệ pha iso - octan/nƣớc 122 Hình 3.36 Biểu đồ thể thay đổi tốc độ phản ứng theo thời gian thủy phân dầu cá hồi CPL 123 Hình 3.37 Biểu đồ Lineweaver-Burk thủy phân dầu cá CPL 124 Hình 3.38 Đồ thị Arrhenius thủy phân dầu cá CPL 125 Hình 3.39 Biểu đồ ảnh hƣởng thời gian đến hiệu suất trình thủy phân 126 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Lipase hay Triacylglycerol acylhydrolase (E.C 3.1.1.3) loại enzyme có khả xúc tác phản ứng thủy phân triacylglycerol mạch dài tạo thành diacylglycerol, monoacylglycerol, glycerol acid béo tự bề mặt liên pha nƣớc dung môi hữu Khác với esterase chất thủy phân, lipase đƣợc định nghĩa carboxylesterase có khả xúc tác thủy phân acylglycerol với gốc acyl có mạch dài 10 nguyên tử carbon Ngoài ra, lipase tham gia xúc tác phản ứng chuyển vị ester phản ứng tổng hợp ester môi trƣờng nƣớc [105] Năm 2010, thị phần enzyme tồn cầu cơng nghiệp đƣợc ƣớc tính khoảng 3,3 tỷ đô la Lipase đứng thứ ba số enzyme đƣợc thƣơng mại hóa sau protease carboxylase [35] Đến năm 2016, thị phần enzyme giới đƣợc sản xuất ứng dụng công nghiệp ƣớc tính đạt đến 5,5 tỷ la Trong đó, lipase chiếm gần 10% thị phần enzyme toàn cầu, với loạt ứng dụng ngành công nghiệp nhƣ sản xuất chất tẩy rửa, chế biến dầu, chế biến thực phẩm dƣợc phẩm [56] Điều cho thấy ngành cơng nghệ enzyme, có lipase phát triển đầy triển vọng Lipase đƣợc thu nhận từ nhiều nguồn khác nhƣ: vi khuẩn (45%), nấm (21%), động vật (18%), thực vật (11%) vi tảo (3%) [91] Lipase công nghiệp chủ yếu đƣợc phân lập từ vi sinh vật phần từ thực vật So với lipase từ vi sinh vật, lipase từ thực vật có ƣu điểm quan trọng nhƣ: - Dễ đƣợc ngƣời tiêu dùng chấp nhận thực phẩm, dƣợc phẩm hơn, dạng enzyme thô [75]; - Nguồn nguyên liệu để thu nhận có sẵn tự nhiên, không độc hại không cần công nghệ di truyền phân tử để sản xuất [75] Lipase thực vật đƣợc cho có tiềm ứng dụng tốt công nghệ thực phẩm, chất tẩy rửa, tổng hợp chất hữu cơ, dƣợc phẩm sản xuất nhiên liệu sinh học nhƣ biodiesel [108] Do đó, lipase thực vật thu hút quan tâm ngày nhiều nhà nghiên cứu Lipase thực vật thƣờng đƣợc tìm thấy loại hạt chứa dầu, ngũ cốc (hạt cải, đậu phộng, đậu nành, yến mạch, v.v…) nhƣ thực vật có chứa nhiều mủ nhƣ Asclepiadaceae, Sapotaceae, Euphorbiaceae, Moraceae, Papaveraceae Asteraceae Nhiều nghiên cứu đặc tính ứng dụng lipase thực vật thu đƣợc từ mủ cho thấy chúng thay cho lipase vi sinh vật Lipase đƣợc tìm thấy mủ xƣơng rồng, mủ sung đƣợc tinh xác định đƣợc khối lƣợng phân tử [52], [53] Lipase từ mủ đu đủ đƣợc xác định enzyme cố định mủ [18], đƣợc sử dụng điều chỉnh cấu trúc glycerolipid [50], tổng hợp ester terpene [127], tổng hợp bơ ca cao nhân tạo [94] Trong hạt có dầu, lipase có chức thủy phân triglyceride để tạo glycerol acid béo, cung cấp lƣợng cần thiết cho nảy mầm hạt phát triển [25] Trên giới, có nhiều cơng trình nghiên cứu lipase thực vật từ chiết tách, khảo sát đặc tính, tinh lipase đến ứng dụng Nhƣng 29 loại lipase từ thực vật đƣợc xác định khối lƣợng phân tử nhƣ trình tự acid amin chuỗi protein [108] Việc nghiên cứu chiết tách tinh lipase từ thực vật gặp nhiều thách thức hàm lƣợng lipid phenolic mẫu cao dẫn đến lipase bền dễ bị biến tính q trình chiết tách Trong quy trình thu lipase từ hạt nảy mầm, thời gian nảy mầm kéo dài cho hoạt độ lipase cao, nhƣng chịu ảnh hƣởng nhiễm vi sinh vật [108] Ngồi ra, q trình sấy khơ hạt làm lipase hoạt tính Tƣơng tự, nghiên cứu cấu trúc lipase thực vật gặp khó khăn khó thu đƣợc cấu trúc tinh thể mẫu có độ đồng khơng cao [108] Điển hình trƣờng hợp lipase từ mủ đu đủ Một số tác giả nƣớc nghiên cứu chiết tách, tinh để xác định cấu trúc phân tử lipase từ mủ đu đủ, nhƣng gặp phải khó khăn lipase có chất cố định tự nhiên mủ đu đủ, khó giải phóng Tất nỗ lực để chiết tách lipase khỏi mủ đu đủ không thành công [17] Trong đó, cơng trình nghiên cứu nƣớc lipase cịn ít, chủ yếu nghiên cứu phân lập lipase từ vi sinh vật thu lipase từ nội tạng loài cá, nghiên cứu lipase từ thực vật lĩnh vực hầu nhƣ không đƣợc quan tâm Với ƣu điểm bật đƣợc trình bày trên, việc nghiên cứu khai thác nguồn enzyme lipase từ thực vật đƣợc đánh giá có tiềm mang lại lợi ích lớn mặt kinh tế cho ngành cơng nghệ enzyme Việt Nam có nguồn thực vật đa dạng phong phú lƣợng lớn phế phẩm từ thực vật có tiềm thu đƣợc lipase chất lƣợng tốt, nhiên chúng chƣa đƣợc quan tâm nghiên cứu Do đó, đề tài đƣợc chọn cho luận án: "Nghiên cứu thu nhận, đánh giá đặc tính lipase thực vật khả ứng dụng cơng nghiệp thực phẩm" thực có ý nghĩa khoa học thực tiễn Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu luận án đánh giá khả khai thác lipase từ nguồn thực vật sẵn có Việt Nam ứng dụng công nghệ thực phẩm, thơng qua tạo sản phẩm có giá trị cao từ nguồn thực vật phổ biến Việt Nam Mục tiêu cụ thể nhƣ sau: - Đánh giá hoạt tính lipase thu nhận từ số nguồn thực vật: + Hạt có dầu + Phụ phẩm nông nghiệp + Mủ loại - Xây dựng quy trình cơng nghệ thu nhận lipase thơ từ nguồn thực vật; - Xác định đặc tính hố sinh lipase thơ lipase tinh sạch; - Đánh giá khả ứng dụng lipase thô công nghiệp thực phẩm Nội dung nghiên cứu Để đạt đƣợc mục tiêu nghiên cứu nhƣ trên, đề tài xác định nội dung cần thực nhƣ sau: - Nghiên cứu lựa chọn nguồn nguyên liệu thực vật thích hợp để thu nhận lipase; - Nghiên cứu yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ lipase thu đƣợc; - Nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận lipase thơ có hoạt độ cao từ ngun liệu lựa chọn; - Nghiên cứu khảo sát đặc tính hố sinh lipase thơ; - Nghiên cứu tinh lipase thơ xác định đặc tính hố sinh lipase tinh sạch; - Nghiên cứu ứng dụng lipase thơ quy trình sản xuất dầu cá giàu DHA EPA Phƣơng pháp nghiên cứu 4.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết Thu thập, tổng hợp tài liệu, tƣ liệu, sách báo, cơng trình nghiên cứu enzyme lipase 4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm - Các phƣơng pháp xác định thành phần nguyên liệu thực vật gồm: phƣơng pháp xác định độ ẩm, hàm lƣợng tro tổng, hàm lƣợng protein, hàm lƣợng chất béo - Các phƣơng pháp thu nhận lipase từ đậu phộng nảy mầm, đậu nành nảy mầm, cám gạo, phơi lúa mì, mủ đu đủ, mủ vả mủ sung - Các phƣơng pháp xác định hoạt độ lipase: phƣơng pháp chuẩn độ, phƣơng pháp đo quang, phƣơng pháp đĩa thạch - Các phƣơng pháp tinh lipase: xác định điểm đẳng điện, phƣơng pháp tủa amoni sunfat, phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion, phƣơng pháp điện di - Các phƣơng pháp hóa lý xác định tiêu chất lƣợng dầu cá hồi: số acid, số xà phịng hóa, số ester - Các phƣơng pháp toán học: phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm, phƣơng pháp tối ƣu hoá Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Từ nội dung nghiên cứu đƣợc định luận án toát lên ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn nhƣ sau: * Ý nghĩa khoa học - Đánh giá đƣợc khả thu nhận lipase từ số nguồn nguyên liệu thực vật, ảnh hƣởng yếu tố đến hoạt độ chế phẩm, từ xác định đƣợc nguồn nguyên liệu thực vật có tiềm để khai thác enzyme lipase - Đề xuất đƣợc quy trình thu lipase thơ từ nguồn thực vật có hiệu cao - Xác định đƣợc tính đặc hiệu chất lipid lipase thô thu nhận đƣợc từ nguồn thực vật - Đề xuất phƣơng pháp tinh lipase thô từ mủ đu đủ xác định khối lƣợng phân tử lipase * Ý nghĩa thực tiễn - Tận dụng phế phẩm trình thu papain từ mủ đu đủ để sản xuất lipase thô - Ứng dụng lipase thô từ mủ đu đủ để thủy phân dầu cá hồi nhằm thu acid béo tạo tiền đề cho trình làm giàu DHA, EPA ứng dụng công nghiệp thực phẩm Bố cục luận án MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN Chƣơng 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan lipase Lipase (triacylglycerol acylhydrolases EC 3.1.1.3) thuộc lớp hydrolase, enzyme hoạt động tốt bề mặt liên pha dầu – nƣớc Tiềm xúc tác lipase đƣợc biết đến từ năm 1930 theo cơng trình cơng bố JBS Haldane cộng [38] Lipase tham gia xúc tác cho nhiều phản ứng khác nhƣ thủy phân, chuyển ester, tổng hợp ester Lipase xúc tác phản ứng thủy phân triglyceride tạo glycerol acid béo, phản ứng đặc trƣng lipase Ngồi ra, điều kiện nƣớc, lipase cịn có khả xúc tác phản ứng tổng hợp ester, chuyển ester Các phản ứng xúc tác lipase [106] đƣợc thể nhƣ sau: (1) Phản ứng thủy phân (2) Phản ứng tổng hợp Phản ứng ester hóa Phản ứng amid hóa Phản ứng tổng hợp thioester (3) Phản ứng chuyển ester Phản ứng gốc acid Phản ứng gốc amin Phản ứng gốc ancol Phản ứng chuyển vị ester 1.1.1 Nguồn thu nhận lipase Lipase đƣợc phân bố rộng rãi vi sinh vật, động vật thực vật Lipase vi sinh vật đƣợc số tác giả thu nhận từ Pseudomonas [128], Bacillus sp LBN [27], Staphylococcus epidermidis [63], Acinetobacter sp CR9 [68] Lipase chịu nhiệt từ nấm Rhizopus homothallicus đƣợc chiết tách Diaza cộng năm 2006 [41] Ở động vật, lipase đƣợc thu nhận chủ yếu từ tụy tạng trâu, bò, cừu, lợn, số loại cá Lipase động vật đóng vai trị quan trọng việc tiêu hóa lipid Một số tác giả thu nhận lipase từ nội tạng cá lóc, cá tra [11], [12] Trong loại tr ng, lipase đƣợc tìm thấy cơ, huyết tƣơng, ống tiêu hóa tuyến nƣớc bọt Thực vật nguồn cung cấp lipase quan trọng xét đến ƣu điểm nhƣ giá thành thấp, tính đặc hiệu, dễ dàng đƣợc chấp nhận ứng dụng trực tiếp nhƣ chất xúc tác sinh học sau trình tinh sơ [33], [75] ... cho luận án: "Nghiên cứu thu nhận, đánh giá đặc tính lipase thực vật khả ứng dụng công nghiệp thực phẩm" thực có ý nghĩa khoa học thực tiễn Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu luận án đánh giá khả khai...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG PHAN THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU THU NHẬN, ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA LIPASE THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG CƠNG NGHIỆP THỰC PHẨM Chun ngành : Cơng nghệ thực phẩm. .. thơ lipase tinh sạch; - Đánh giá khả ứng dụng lipase thô công nghiệp thực phẩm Nội dung nghiên cứu Để đạt đƣợc mục tiêu nghiên cứu nhƣ trên, đề tài xác định nội dung cần thực nhƣ sau: - Nghiên cứu