Nghiên cứu quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM - o0o - TRẦN THỊ THÚY HẰNG MSSV: 54130320 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHITOSAN CÓ ĐỘ DEACETYL CAO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM GVHD: PGS.TS TRANG SĨ TRUNG NHA TRANG, NĂM 2016 i LỜI CẢM ƠN Trải qua tháng với nỗ lực giúp đỡ từ nhiều phía, hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp Qua xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Ban giám hiệu trường Đại học Nha Trang, Khoa Công Nghệ Thực Phẩm thầy cô tận tình giúp đỡ, giảng dạy, trang bị cho kiến thức suốt thời gian học tập trường PGS.TS Trang Sĩ Trung, Th.S Nguyễn Công Minh tận tình hướng dẫn, giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến quý thầy cô giáo phụ trách phòng thí nghiệm – Trung tâm thí nghiệm thực hành tạo điều kiện cho hóa chất trang thiết bị thí nghiệm thời gian thực đề tài Cuối xin cảm ơn đến gia đình bạn lớp 54TP2, bạn thực nghiên cứu phòng thí nghiệm động viên giúp đỡ nhiều thời gian vừa qua Khánh Hòa, tháng năm 2016 Sinh viên thực Trần Thị Thúy Hằng ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC VIẾT TẮT vi LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Chitosan có độ deacetyl cao, tính chất ứng dụng 1.1.1 Tính chất chitosan 1.1.2 Ứng dụng chitosan 10 1.2 Quy trình sản xuất chitosan 12 1.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ deacetyl trình sản xuất chitosan 14 1.2.2 Ảnh hưởng độ Deacetyl đến tính chất ứng dụng Chitosan 16 1.2.2.1 Ảnh hưởng độ deacetyl đến tính chất chitosan 16 1.2.2.2 Ảnh hưởng độ deacetyl đến khả ứng dụng chitosan 16 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 19 2.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chi tiết 20 2.2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm trình deacetyl lần 20 2.2.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm trình deacetyl lần 24 2.2.3.Các phương pháp phân tích 25 iii 2.2.3.1 Xác định độ ẩm hàm lượng khoáng[14] (phụ lục 3) 25 2.2.3.2 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp microbiuret[14] (phụ lục 3) 25 2.2.3.3 Xác định độ nhớt chitosan máy đo độ nhớt Brookfiel[22] (phụ lục 3) 25 2.2.3.4 Xác định độ deacetyl (DD) (Tao cộng sự) (phụ lục 3) 25 2.2.3.5 Xác định lượng phân tử theo phương pháp đo độ nhớt nội (phụ lục 3) 25 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 25 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Kết chất lượng chitin ban đầu 26 3.2 Kết nghiên cứu điều kiện Deacetyl lần 26 3.2.1 Ảnh hưởng nồng độ NaOH đến DD chitosan 26 3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến DD chitosan 29 3.2.3 Ảnh hưởng thời gian đến DD chitosan 31 3.3 Kết nghiên cứu điều kiện deacetyl lần 33 3.4 Đề xuất quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl > 90% 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tính chất chitosan ảnh hưởng độ deacetyl (Trung cộng sự, 2006) Bảng 1.2 Các dung môi thường sử dụng để hòa tan chitosan Bảng 1.3 Mô tả số quy trình deacetyl phương pháp hóa học 13 Bảng 2.1 Tính chất chitin 19 Bảng 3.1 Kết chất lượng chitin ban đầu 26 Bảng 3.2 Kết hàm lượng protein (%), hàm lượng khoáng (%) độ nhớt (mpa.s) chitosan 27 Bảng 3.3 Kết hàm lượng protein (%), hàm lượng khoáng (%) độ nhớt (mpa.s) chitosan 30 Bảng 3.4 Kết hàm lượng protein (%), hàm lượng khoáng (%) độ nhớt (mpa.s) chitosan 32 Bảng 3.5 Kết hàm lượng protein (%), hàm lượng khoáng (%) độ nhớt (mpa.s) chitosan 36 Bảng 3.6 Kết chất lượng chitosan sau lần deacetyl 38 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Công thức cấu tạo chitosan Hình 1.2 Quá trình Deacetyl 13 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 20 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NaOH đến độ deacetyl chitosan 21 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến độ deacetyl chitosan 22 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đến độ deacetyl chitosan 23 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đến độ deacetyl chitosan 24 Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ NaOH đến độ deacetyl (DD) phân tử lượng (Mw) chitosan 27 Hình 3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ khử acetyl đến độ deacetyl (DD) phân tử lượng (Mw) chitosan 29 Hình 3.3 Ảnh hưởng thời gian khử acetyl đến độ deacetyl (DD) phân tử lượng (Mw) chitosan 31 Hình 3.4 Ảnh hưởng thời gian số lần deacetyl đến DD chitosan 34 Hình 3.5 Ảnh hưởng thời gian số lần deacetyl đến phân tử lượng chitosan 35 Hình 3.6 Sơ đồ quy trình sản xuất chitosan có độ Deacetyl >90% 37 vi DANH MỤC VIẾT TẮT CTS : Chitosan CT : chitin DD : Degree of deacetylation Mw : Molecular weight VSV : Vi sinh vật w/v : Weight/volume LỜI MỞ ĐẦU Chitosan polymer sinh học, có nhiều ứng dụng công nghiệp sống, đặc biệt chế biến bảo quản thực phẩm Khi chế biến loài thủy sản giáp xác (tôm, cua), lượng chất thải (có chứa chitin) chiếm tới 50% nguyên liệu đầu vào số giới 5,11 triệu tấn/năm (theo www.chinhphu.vn), nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu đến môi trường sống người thiên nhiên Tuy nhiên, lại nguồn nguyên liệu sản xuất chitosan Vì vậy, ứng dụng chitosan vào bảo quản nguyên liệu, bán thành phẩm nhằm thúc đẩy ngành công nghệ sản xuất chitosan phát triển, tăng giá trị sản phẩm, làm giảm ô nhiễm môi trường phế thải trình chế biến sản phẩm thủy sản giáp xác, đồng thời làm tăng thời gian bảo quản sản phẩm Ở nước ta sản phẩm tôm đông lạnh chiếm sản lượng lớn (theo ước tính nước ta riêng tôm nuôi có khoảng triệu diện tích với suất bình quân – 1,5 tấn/ha), vỏ tôm phế liệu nguồn nguyên liệu dồi dào, rẻ tiền, có sẵn quanh năm, nên thuận tiện cho việc cung cấp chitin chitosan Tính cấp thiết đề tài: Qua khảo sát tìm hiểu nhiều tài liệu nghiên cứu thấy chitosan có nhiều ứng dụng nhiều lĩnh vực khác nhau, nhiên khả ứng dụng chitosan phụ thuộc vào nhiều yếu tố, có mức độ deacetyl chitosan Mức độ deacetyl chitosan có ảnh hưởng nhiều đến khả ứng dụng chitosan đặc biệt chitosan có độ deacetyl cao Theo nhiều nghiên cứu cho biết chitosan có độ deacetyl cao có khả kháng khuẩn, kháng nấm chống oxy hóa tốt Theo Dương cộng (2009), chitosan có độ deacetyl cao, nồng độ dung dịch cao khả tiêu diệt VSV tổng số lớn Bên cạnh đó, thực phẩm ta dùng ngày cá, thịt, trái cây,… nói dễ bị hư hỏng xâm nhập loại vi khuẩn, dễ bị oxy hóa không khí ta bảo quản điều kiện thông thường, thời gian bảo quản lại ít, việc bổ sung chất bảo quản nhằm giảm thiểu hư hỏng nguyên liệu thực phẩm nhiều người quan tâm Tuy nhiên, với phát triển khoa học, việc lạm dụng hóa chất bảo quản vào thực phẩm vấn đề quan tâm, việc sử dụng chất bảo quản vào thực phẩm vấn đề nhạy cảm, “con dao hai lưỡi” tốn Dựa vào tạo màng khả kháng khuẩn chitosan ta sử dụng chitosan để bảo quản thực phẩm mà không gây hại đến người tiêu dùng kéo dài thời gian bảo quản Chitosan có độ deacetyl trung bình 75 – 85% ứng dụng làm màng bao bảo quản loại thực phẩm khả kháng khuẩn, kháng nấm chống oxy hóa chitosan có độ deacetyl cao với số loại thực phẩm dễ bị hư hỏng vi khuẩn, cần phải sản xuất chitosan có độ deacetyl cao để nâng cao khả ứng dụng vào thực phẩm, đảm bảo thực phẩm an toàn Vấn đề đặt làm để sản xuất chitosan có độ deacetyl cao để đáp ứng nhu cầu trên? Xuất phát từ thực tế trên, đồng ý Chủ nhiệm Khoa Công Nghệ Thực Phẩm trường Đại học Nha Trang, xin thực đề tài: “ Nghiên cứu quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl cao” để phục vụ bảo quản thực phẩm Mục tiêu đề tài Xác định điều kiện deacetyl thích hợp để tạo sản phẩm chitosan có DD cao Tính đề tài Hiện giới nước có nhiều nghiên cứu chitosan, nhiên có tài liệu nghiên cứu để sản xuất chitosan có độ deacetyl cao, chưa có công bố thức quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl cao Nội dung đề tài - Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NaOH, nhiệt độ khử acetyl thời gian khử acetyl chitosan trình deacetyl lần - Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử acetyl chitosan trình deacetyl lần - Đề xuất quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl cao Tính khoa học Xác định nồng độ NaOH thích hợp, nhiệt độ thời gian khử acetyl thích hợp để sản xuất chitosan có độ deacetyl cao Tính thực tiễn Sản xuất chitosan có độ deacetyl cao mở rộng ứng dụng vào việc bảo quản thực phẩm Phù hợp với điều kiện sản xuất phòng thí nghiệm cho nhà máy sau 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đặng Kim Chung (2012), Nghiên cứu ảnh hưởng độ deacetyl đến hoạt tính chống oxy hóa chitosan thủy phân H2SO4, Luận văn tốt nghiệp, Đại học Nha Trang Đặng Xuân Dự (2015), Nghiên cứu cắt mạch chitosan hiệu ứng đồng vận H2O2/bức xạ gamma Coban-60 để chế tạo oligochitosan, Luận án tiến sĩ hóa học, Trường đại học khoa học Huế Đỗ Thị Cẩm Nguyên (2015), Nghiên cứu ảnh hưởng trạng thái chất lượng chitin đến khả deacetyl NaOH, Luận án tốt nghiệp, Đại học Nha Trang Đỗ Thị Liền (2008), Nghiên cứu cắt mạch chitosan Hydroperxit thử nghiệm khả kháng khuẩn chúng, Luận văn thạc sỹ, Đại học Nha Trang Hoàng Minh Châu, Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Hoàng Hà, Nguyễn Kim Hùng (1998), "Bước đầu nghiên cứu tổng hợp dẫn chất chitosan từ vỏ tôm ứng dụng kỹ thuật bao phim thuốc", Tạp chí hóa học, Lê Thanh Long (2006), Nghiên cứu sử dụng dung dịch chitosan phụ liệu để kéo dài thời gian bảo quản trứng gà tươi, Luận văn thạc sỹ kỹ thuật, Đại Học Thủy sản Nha Trang Lê Tùng Dương (2009), Nghiên cứu ảnh hưởng độ deacetyl chitosan đến khả bảo quản cá Đổng Quéo, Luận án tốt nghiệp, Đại học Nha Trang Ngô Thị Hoài Dương, Ngô Đăng Nghĩa, and Kjell M.Varum (2015), Tối ưu hóa trình thu nhận chitin chitosan từ phế liệu tôm thẻ chân trắng nhằm nâng cao hiệu chất lượng sản phẩm, Luận án tiến sĩ, Đại học Nha Trang 41 Nguyễn Công Minh (2009), Nghiên cứu ảnh hưởng độ deacetyl hóa chitosan đến khả ứng dụng vào bảo quản xoài, Luận văn thạc sỹ kỹ thuật, Đại học Nha Trang 10 Nguyễn Thị Hằng Phương (2008), Ảnh hưởng độ deacetyl chitosan đến khả bảo quản na, Luận văn tốt nghiệp, Đại học Nha Trang 11 Tôn Nữ Minh Nguyệt (2013), Nghiên cứu ứng dụng chitosan chế biến bảo quản rau trái, Trường Đại học Bách khoa TP.Hồ Chí Minh 12 Trần Thị Luyến, Huỳnh Nguyễn Duy Bảo (2000), Hoàn thiện quy trình sản xuất chitin-chitosan chế biến số sản phẩm công nghiệp từ phế liệu tôm cua, Đề tài cấp bộ, Trường Đại Học Thủy sản Nha Trang 13 Trang Sĩ Trung, Trần Thị Luyến, Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thị Hằng Phương, (2010), "Chitin – chitosan từ phế liệu thủy sản ứng dụng", NXB Hà Nội – Nông Nghiệp, Hà Nội Tiếng Anh 14 AOAC (1990), "Official method of analysis", Association of official analytical chemists 15 Darmadji, P., Izumimoto, M., (1994), "Effect of chitosan in meat preservation", Meat Science 38: p 243-254 16 H.K No, S.P.Meyers, W Prinyawiwatkul, Z Xu, (2007), "Applications of Chitosan for Improvement of Quality and Shelf Life of Foods: A Review" Journal of food science 72(5) 17 Hein, S., Ng, C.H, Steven, W.F., Wang, K (2008), "Selection of a practical assay for the determination of the entire range of acetyl content in chitin and chitosan: UV spectrophotometry with phosphoric acid as solvent", J Biomed Mater Res B Appl Biomater 86B,(2): p 558-68 18 Hsiao, H.Y., Tsai, C.C, Chen, S.M., Hsieh, B.C.,Chen, R.L.C (2004), "Spectrophotometric determination of deacetylation degree of chitinous 42 materials dissolved in phosphoric acid", Macromolecular Bioscience 4(10) 19 Kassai, M.R (2009), "Various Methods for Determination of the Degree of N-Acetylation of Chitin and Chitosan : A Review" Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57(5): p 1667-1676 20 Md Rabiul Hussain, Murshid Iman, and and Tarun K.Maji (2013), "Determination of degree of Deacetylation of chitosan and their effect on the release Behavior of Essential oil from chitosan and chitosan - gelatin complex microcapsules", International Journal of Advanced Engineering Applications 2(4): p - 12 21 Methacanom, P., Prasitsilp, M., Pothsree, T., Pattaraarchachai, J., (2003), "Heterogeneous N-deacetylation of squid chitin in alkaline solution", Carbohydrate Polymers: p 119 - 123 22 Ottey, M.H., K.M Varum, and O Smidsrod (1996), "Compositional heterogenously deacetylated chitosan", Carbohydrate Polymers,(29(1)): p 17-24 23 Rhazi, M., Desbriese, J., Tolaimate, A., Alagui, A., Vottero, P., (2000), "Investigation of different natural sources of chitin: influence of the source and deacetylation process on the physicochemical characteristics of chitosan", Polym,(49): p 337-344 24 Trung, T.S., Thein-Han, W.W., Qui, N.T., Ng, C.H., Stevens, W.F., (2006), "Functional characteristics of shrimp chitosan and its membranes as affected by the degree of deacetylation", Bioresource Technology 25 Xiaofei He, Kecheng Li, Ronge Xing, Song Liu, Linfeng Hu, Pengcheng Li, (2016), "The production of fully deacetylation chitosan by compression method", The Egyption Journal of Aquatic Research 142(1): p 75 - 81 PHỤ LỤC Phụ lục Bảng số liệu Bảng Ảnh hưởng hệ dung môi sử dụng đến ứng suất kéo, độ giãn dài giới hạn, độ trương nở màng chitosan với độ deacetyl khác (Trang Sĩ Trung, 2009) Dung môi Acid formic Acid acetic Acid glycolic Ứng suất kéo Độ giãn dài giới Độ trương nở(%) (N/mm ) hạn (%) Chitosan Chitosan Chitosan Chitosan Chitosan Chitosan độ độ độ độ độ độ deacetyl deacetyl deacetyl deacetyl deacetyl deacetyl thấp cao thấp cao thấp cao 18,64 35,35 0,95 1,95 403,90 69,81 27,91 40,53 0,84 1,70 359,00 65,69 18,78 35,71 0,88 2,50 450,39 97,35 Acid citric 24,80 36,55 1,85 3,50 437,24 7,54 Bảng Các điều kiện deacetyl thường sử dụng nguồn chitin khác Nguồn gốc chitin Tôm hùm Cua Tôm sú Tôm thẻ Nồng độ kiềm 55% 47% 40% 50% 50% 50% 50% 50% 50% 50% 60% 50% KOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH KOH NaOH Điều kiện deacetyl Nhiệt độ Thời gian ( C) (h) 100 – 140 0,5 – 1,5 60, 110 1,2x1 – 10 100 0,5 – 145 – 150 1/12, 1/4 60 100 0,5x2 100 0,75x2 95 30 24 – 144 100 100 Tỷ lệ (w/ v) 1:100 1:10 1:4 1:15 1:15 1:14 1:65 - Bảng Phân tử lượng chitosan điều kiện deacetyl hóa khác (Methacanon cộng sự, 2003) Phân tử lượng *105 (dalton) Điều kiện xử lý NaOH 40%, 80oC, 120 phút 8,74 NaOH 40%, 100oC, 60 phút 4,58 NaOH 60%, 80oC, 60 phút 10,9 NaOH 60%, 80oC, 120 phút 8,87 NaOH 60%, 100oC, 60 phút 4,53 NaOH 60%, 100oC, 120 phút 3,22 Bảng Độ deacetyl hóa chitosan điều kiện xử lý khác (Trung cộng sự, 2006) Nồng độ NaOH (%) Nhiệt độ (oC) Thời gian (h) Số lần xử lý lặp lại Độ deacetyl (%) 50 40 24 75 50 65 20 87 50 65 20 96 Bảng Phân tử lượng chitosan điều kiện deacetyl hóa khác (Methacanon cộng sự, 2003) Điều kiện xử lý Phân tử lượng*105 (dalton) NaOH 40%, 80oC, 120 phút 8,74 NaOH 40%, 100oC, 60 phút 4,58 NaOH 60%, 80oC, 60 phút 10,9 NaOH 60%, 80oC, 120 phút 8,87 NaOH 60%, 100oC, 60 phút 4,53 NaOH 60%, 100oC, 120 phút 3,22 Bảng Ảnh hưởng nồng độ NaOH đến độ deacetyl phân tử lượng chitosan Mẫu (NaOH %) DD (%) Mw (KDal) Lần Lần Lần Lần Lần Lần 40 62,6 60,2 61,4 1282 1248 1139 45 72,2 79,4 75,9 1079 1021 933 50 82,5 83,3 82,9 945 921 841 55 83,1 83,3 83,2 679 723 646 Bảng Ảnh hưởng nồng độ NaOH đến kết hàm lượng protein, khoáng độ nhớt chitosan Hàm lượng Protein Hàm lượng khoáng (%) (%) Mẫu Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 35% 0,09 0,09 0,08 0,34 0,36 0,34 1320 1330 1330 40% 0,08 0,08 0,08 0,21 0,25 0,23 1140 1160 1140 45% 0,09 0,08 0,08 0,36 0,37 0,37 1150 1140 1140 50% 0,09 0,08 0,08 0,31 0,37 0,35 1050 1000 1020 55% 0,08 0,07 0,08 0,20 0,20 0,20 960 940 940 Viscosity (mpa.s) Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ deacetyl phân tử lượng chitosan Mẫu (oC) DD (%) Mw (KDal) Lần Lần Lần Lần Lần Lần 50 58,4 59,1 63,3 1221 1403 1218 60 65,7 67,4 67,2 1249 1210 1171 70 75,3 72,2 73,5 1212 1219 1142 80 81,4 81,1 83,3 1090 1092 1060 90 82,4 85,2 84,7 902 932 890 Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ khử acetyl đến hàm lượng protein, khoáng độ nhớt chitosan Hàm lượng protein Hàm lượng khoáng (%) (%) Mẫu Viscosity (mpa.s) Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 50oC 0,05 0,05 0,05 0,3 0,33 0,32 1305 1295 1300 60 oC 0,06 0,05 0,05 0,31 0,31 0,31 1180 1190 1190 70 oC 0,05 0,05 0,05 0,29 0,29 0,32 1115 1100 1110 80 oC 0,05 0,04 0,05 0,17 0,17 0,16 990 985 980 90 oC 0,05 0,05 0,05 0,20 0,18 0,18 825 800 810 Bảng 10 Ảnh hưởng thời gian đến độ deacetyl phân tử lượng chitosan Mẫu (thời gian: DD (%) Mw (KDal) giờ) Lần Lần Lần Lần Lần Lần 63,3 65,1 60,4 1472 1425 1432 72,3 70,1 71,6 1453 1448 1301 12 84,4 84,2 82,5 950 932 920 16 85,4 83,2 85,7 664 625 648 20 85,4 84,5 85,1 435 439 434 24 84,5 85,3 85,7 310 347 332 Bảng 11 Ảnh hưởng thời gian khử acetyl đến hàm lượng protein, khoáng độ nhớt chitosan Mẫu (giờ) Hàm lượng protein Hàm lựơng khoáng (%) (%) Viscosity (mpa.s) Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 0,09 0,09 0,10 0,02 0,03 0,03 1310 1290 1300 0,07 0,07 0,07 0,02 0,02 0,02 1060 1080 1095 12 0,07 0,07 0,07 0,02 0,02 0,02 945 960 950 16 0,05 0,04 0,05 0,01 0,02 0,02 935 945 930 20 0,07 0,07 0,07 0,02 0,02 0,02 920 930 935 24 0,04 0,05 0,05 0,03 0,03 0,02 935 940 940 Bảng 12 Ảnh hưởng thời gian đến độ deacetyl phân tử lượng chitosan (deacetyl lần 2) DD (%) Mẫu (thời gian: Mw (KDal) giờ) Lần Lần Lần Lần Lần Lần 83,4 83,2 85,5 1051 1122 1070 88,3 87,1 89,4 972 925 932 92,3 92,1 91,6 853 848 801 94,4 94,2 92,5 651 622 670 95,4 93,2 95,7 434 405 398 Bảng 13 Ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng protein, khoáng độ nhớt chitosan (deacetyl lần 2) Mẫu (giờ) Hàm lượng protein Hàm lượng khoáng (%) (%) Viscosity (mpa.s) Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 0,05 0,04 0,05 0,32 0,33 0,32 590 540 540 0,05 0,04 0,04 0,14 0,13 0,14 530 500 480 0,05 0,04 0,05 0,16 0,18 0,16 470 460 450 0,05 0,05 0,05 0,17 0,17 0,16 420 410 400 0,04 0,05 0,05 0,15 0,15 0,16 430 420 410 Phụ lục 2: Sơ đồ tổng quát trình sản xuất chitin, Trang Sĩ Trung cộng sự, 2013 Vỏ tôm thẻ Rửa sạch, để Khử khoáng HCl 5%, RT, 24 Khử Protein NaOH 4%, RT, 24 Rửa sạch, phơi khô Chitin Hình Quy trình sản xuất chitin – chitosan, Trung cộng sự, 2013 Thuyết minh quy trình: Nguyên liệu sau thu mua F17 về, đem xử lý, nhặt rác bẩn, rửa, để Sau đó, đem khử khoáng HCl 5%, điều kiện nhiệt độ thường, thời gian 24 tiếng, với tỷ lệ w/v = 1/5 Trong thời gian khử khoáng phải liên tục khuấy đảo Sau thời gian khử khoáng, mẫu đem rửa trung tính Tiếp tục, mẫu khử protein NaOH 4%, điều kiện nhiệt độ thường, thời gian 24 tiếng, với tỷ lệ w/v = 1/5 Sau mẫu đem rửa trung tính đem phơi khô ta thu chitin Mẫu chitin mang kiểm tra tiêu: cảm quan, độ ẩm, khoáng, protein Phụ lục Các phương pháp phân tích Phương pháp xác định hàm lượng ẩm a Tiến hành Sấy cốc ban đầu đến trọng lượng không đổi 105oC Cân lại cốc sau sấy đến trọng lượng không đổi (m1) Cân lượng mẫu khoảng 2-5 g vào cốc, cân xác khối lượng cốc mẫu (m2) Đem sấy nhiệt độ 105oC thời gian 16 Lấy cốc cho vào bình hút ẩm để 30 phút tiến hành cân khối lượng mẫu cốc sau sấy (m3) Tiếp tục sấy cân lại hai trình cân không lệch 0.01 b Tính kết Tính kết hàm lượng ẩm mẫu theo công thức: Hàm lượng ẩm (%) = m2  m3  100 % m2  m1 Trong đó: m1: khối lượng cốc sau sấy (g) m2: khối lượng mẫu cốc trước sấy (g) m3: khối lượng mẫu cà cốc sau sấy (g) Phương pháp xác định hàm lượng khoáng a Tiến hành Cho vài giọt H2O2 vào mẫu sấy trên, sau đem nung 550 – 600oC mẫu có màu trắng thời gian 16 giờ) Sau lấy cốc chuyển vào bình hút ẩm để khoảng 30 phút tiến hành cân khối lượng cốc mẫu sau nung (m4) Tiếp tục nung cân lại hai trình cân không lệch 0,01g b Tính kết hàm lượng khoáng mẫu theo công thức Hàm lượng khoáng (%): = m4  m1  100 % m3  m1 Trong : m1 : khối lượng cốc sau sấy (g) m3 : khối lượng mẫu cà cốc sau sấy (g) m4 : khối lượng mẫu cốc sau sấy (g) Phương pháp xác định độ nhớt chitosan máy đo độ nhớt Brookfiel a Tiến hành Cho 1g chitosan +100ml dung dịch acid acetic 1%, khuấy tan, để 3-4h Sau đo độ nhớt mẫu máy đo độ nhớt Brookfiel, chọn spin tốc độ quay phù hợp, tiến hành đo độ nhớt mẫu đọc số đọc b Tính kết Vis = hệ số * số đọc (mpa.s) Hệ số dựa vào spin speed dụng cụ đo Phương pháp xác định hàm lượng protein mẫu chitosan theo phương pháp Micro Biuret a Tiến hành Pha thuốc thử Microbiuret: lấy 173g sodium citrat 100g sodium carbonat, đem hoà tan 500mL nước nóng không để nước sôi Lấy 17,3g CuSO4 hoà tan 100mL nước cất thêm vào hỗn hợp Sau thêm nước cất vào cho đủ 1000mL Dung dịch đựng chai màu Xử lý mẫu: lấy 1g mẫu + 10mL NaOH 3%, đem ủ 80oC/8h Sau hỗn hợp làm lạnh nhiệt độ phòng, sau mang lọc Định mức dịch lọc đến thể tích định V1 Sử dụng 4mL dịch sau lọc, sau thêm 200 L thuốc thử Microbiuret, ủ nhiệt độ phòng 15 phút, sau đo UV bước sóng 330nm Từ giá trị OD thu được, thay vào phương trình đường chuẩn để suy hàm lượng protein mẫu b Tính kết Hàm lượng protein mẫu chitin xác định theo công thức sau Trong đó: V1 : thể tích dịch lọc (mL) C : Hàm lượng protein tính theo đường chuẩn biuret (mg/mL) W : khối lượng mẫu ủ (g) MC : độ ẩm mẫu (%) Phương trình đường chuẩn: y = 1,4689 x + 0,0027 Phương pháp xác định độ deacetyl a Tiến hành  Chuẩn bị mẫu xác định hàm lượng N – Acetyl Glucosamine  Cân xác 100 mg chitosan cho vào 20 ml H3PO4 85% sau khuấy máy khuấy từ 600C 40 phút  Lấy 10 ml dung dịch định mức đến 100 ml nước cất sau ủ dung dịch 600C  Sau ủ, tiến hành đo UV bước sóng 210 nm để xác định hàm lượng N – Acetyl glucosamine theo đường chuẩn b Tính kết Xác định giá trị Degree of deacetyl (DD) mẫu Degree of deacetyl (DD) mẫu xác định theo công thức: Trong : DD: Degree of deacetyl w: khối lượng mẫu mM NAC Glc: hàm lượng NAC Glc tính theo đường chuẩn mM Glc: Hàm lượng glucosamine Phương trình đường chuẩn : y = 1,055x + 0,022 Xác định phân tử lượng phương pháp đo độ nhớt nội Pha đệm acid acetic 0,25M/sodium acetate 0,25M Chitosan hòa tan dung dịch đệm, lọc qua màng lọc có kích thước μm pha loãng thành nồng độ khác có tỷ lệ chitosan/dung dịch đệm là: (4 – 4, – 3, – 2, – 1, – 0) (v/v) Hút ml từ dung môi đến nồng độ chitosan cho vào thiết bị đo độ nhớt nội AVS – 470 để xác định thời gian chảy dịch chitosan qua ống mao quản nhiệt độ 25oC Thời gian chảy dung môi nồng độ chitosan thay vào công thức để xác định độ nhớt tương đối (ηr), độ nhớt riêng (ηsp), độ nhớt nội (ηg) Công thức tính sau: 𝛈 Độ nhớt tương đối: ηr = Độ nhớt riêng: ηsp Độ nhớt nội: ηg = 𝐥𝐢𝐦 Trong đó: 𝛈𝐨 = = 𝐭 𝐭𝐨 ηr – 𝑪→𝟎 𝛈𝐬𝐩 𝐂 ηo: Độ nhớt dung môi η: Độ nhớt dung dịch chitosan to : Thời gian chảy dung dịch chitosan t : Thời gian chảy dung dịch chitosan ηr : Độ nhớt tương đối ηsp: Độ nhớt riêng ηg : Độ nhớt nội Vẽ đồ thị tương quan độ nhớt nội nồng độ chitosan, từ xác định độ nhớt nội chitosan, thay độ nhớt nội vào phương trình Mark – Hauwink – Sakudara sau để xác định khối lượng phân tử (M): [ηg] = 𝑲𝑴𝒂𝒗 Với K a số cho hệ thống chất tan – dung môi nhiệt độ ... nước có nhiều nghiên cứu chitosan, nhiên có tài liệu nghiên cứu để sản xuất chitosan có độ deacetyl cao, chưa có công bố thức quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl cao Nội dung đề tài - Nghiên. .. chitin chitosan Chitin có độ deacetyl thấp chitosan có độ deacetyl cao, tức chứa nhiều nhóm amino[13] Nhiệt độ trình deacetyl: Nhiệt độ cao trình deacetyl diễn nhanh Sản phẩm chitosan thu có độ deacetyl. .. sản xuất chitosan có độ deacetyl cao Tính khoa học Xác định nồng độ NaOH thích hợp, nhiệt độ thời gian khử acetyl thích hợp để sản xuất chitosan có độ deacetyl cao Tính thực tiễn Sản xuất chitosan