Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây rận trâu (Dioscorea SP.), họ củ nâu (Dioscoreaceae) ở Đà Nẵng

Chiết xuất, phân lập các hợp chất trong thân rễ Rận Trâu .... Chiết xuất, phân lập các hợp chất saponin có trong thân rễ Rận trâu .... - Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này tôi đã nhận

được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các chuyên gia trong

lĩnh vực cùng đồng nghiệp và gia đình

Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Sau Đại

học, các thầy cô giáo, các kỹ thuật viên bộ môn Dược liệu, Dược học cổ

truyền và Thực vật- Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi

cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tiếp theo, tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học

Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm và các cán bộ đồng nghiệp Khoa

Nông học Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi yên tâm

học tập và hoàn thành luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hoàng Tuấn người

thầy đã tận tình hướng dẫn, luôn quan tâm chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận

lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin cám ơn TS Đỗ Thị Hà, Trưởng khoa Hóa Thực vật- Viện

Dược liệu cùng các anh chị kỹ thuật viên Khoa Hóa thực vật- Viện Dược liệu

đã tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi nghiên cứu và hoàn thành luận văn

này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Nguyễn Thị Duyên, em

Lê Thị Mai Anh, anh Nguyễn Văn Phương đã giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn

này

Cuối cùng là lời cảm ơn sâu sắc nhất, tôi muốn gửi tới gia đình, người

thân và bạn bè những luôn luôn bên cạnh ủng hộ tôi trong quá trình học tập và

nghiên cứu

Thái Nguyên, ngày 30 tháng 3 năm 2016

Nguyễn Thị Tươi

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Chi Dioscorea L 3

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Diocorea L 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Dioscorea L 3

1.1.3 Các nghiên cứu về phân loại thực vật của chi Dioscorea L ở Việt Nam 4

1.1.4 Các nghiên cứu về hóa học của chi Dioscorea L 5

1.1.5 Ứng dụng của chi Dioscorea L 7

1.1.5.1 Ứng dụng trong đời sống 7

1.1.5.2 Ứng dụng trong y học 8

1.2 Diosgenin 9

1.2.1 Công thức cấu tạo, tính chất lý, hóa học 9

1.2.2 Ứng dụng của diosgenin 10

1.2.3 Các loài Dioscorea dùng làm nguồn nguyên liệu chiết xuất diosgenin 11

1.2.4.Các phương pháp định lượng diosgenin 13

1.3 Cây Rận Trâu 14

1.3.1 Đặc điểm thực vật 14

1.3.2 Thành phần hóa học 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 15

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 15

2.1.2 Các hóa chất, máy móc, thiết bị dùng trong nghiên cứu 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật 16

2.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học 17

2.2.2.1.Định tính một số hợp chất hữu cơ trong dược liệu bằng phản ứng hóa học 17

2.2.2.2 Chiết xuất, phân lập các hợp chất trong thân rễ Rận Trâu 21

2.2.2.3 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được 24

2.2.3 Định lượng diosgenin trong thân rễ Rận trâu 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27

3.1 Đặc điểm thực vật và dược liệu 27

3.1.1 Mô tả đặc điểm thực vật, đặc điểm dược liệu và giám định tên khoa học của cây Rận trâu 27

3.1.2 Hình ảnh đặc điểm vi phẫu của lá, thân và thân rễ cây Rận trâu 29

3.1.2.1 Đặc điểm vi phẫu lá 29

3.1.2.2 Đặc điểm vi phẫu thân 30

3.1.2.3 Đặc điểm vi phẫu thân rễ 31

3.1.3 Đặc điểm bột lá, thân, thân rễ Rận trâu 32

3.1.3.1 Đặc điểm bột lá 32

3.1.3.2 Đặc điểm bột thân 33

3.1.3.3 Đặc điểm bột thân rễ 34

3.2 Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học 35

3.2.1 Xác định sơ bộ thành phần các nhóm chất có trong dược liêu nghiên cứu 35

3.2.2 Chiết xuất, phân lập các hợp chất saponin có trong thân rễ Rận trâu 37

3.2.2.1 Chiết xuất 37

3.2.2.2 Phân lập các hợp chất saponin 38

3.2.3 Kết quả dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được 40

3.2.3.1 Hợp chất RT01 40

3.2.3.2 Hợp chất RT02 45

3.3 Định lượng diosgenin trong thân rễ Rận trâu 50

3.3.1 Chuẩn bị mẫu 50

3.3.2 Phân tích mẫu 51

3.3.3 Kết quả định lượng diosgenin trong thân rễ Rận trâu 55

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 56

4.1 Về thực vật 56

4.2 Về hóa học 57

4.3 Về định lượng diosgenin trong thân rễ Rận trâu 59

KẾT LUẬN 61

KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13

C-NMR: Carbon Nuclear Magnetic Resonance

CDCl3: Deuterated chloroform

COSY: Correlation spectroscopy

16-DPA: 10-dehydro pregnennolon acetat

d: doublet

DEPT: Detortionless enhancement by polarisationtrasfer

1

H-NMR: Proton Nuclear Magnetic Resonance

HPLC: High-performance liquid chromatography

HPTLC: High performance thin layer chromatography

HMBC: Heteronuclear multilpe bond cerelation

HSQC: Heteronuclear single quantum corelation

MS: Mass spectrum

m/z: Khối lượng/điện tích ion

NMR: Nuclear Magnetic Resonance

NOESY: Nuclear Magnetic Resonance

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 1.1 Số lượng các loài trong chi Dioscorea ở Việt Nam 4

Bảng 1.3 Các loài Dioscorea quan trọng được sử dụng để sản xuất

diosgenin trong công nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Trang

Hình 3.1.1 Một số đặc điểm hình thái của cây Rận trâu 28

Hình 3.1.7 Một số đặc điểm bột thân rễ Rận Trâu 35 Hình 3.2.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ thân rễ Rận trâu 38 Hình 3.2.2 Sơ đồ phân lập hợp chất saponin từ thân rễ Rận trâu 40

Hình 3.3.1 Sắc ký đồ của các mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu trắng 53 Hình 3.3.2 Phổ hấp thụ UV của diosgenin chuẩn và trong mẫu thử 53 Hình 3.3.3 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của diosgenin 55

Hiện nay ngành y các nước dùng khoảng hơn 100 loại chế phẩm hormon

để chữa bệnh, khoảng 50 chứng bệnh thường không chữa được bằng các thuốc khác Các chế phẩm này được sản xuất hoặc từ các hormon động vật hoặc từ các sapogenin và alcaloid steroid thực vật (diosgenin, hecogenin, solasodin,…) [25] Khoảng 50- 60% dẫn chất steroid dùng làm thuốc trên toàn cầu được sản xuất từ diosgenin Nhiều nước trên thế giới cũng như Việt

Nam đã và đang chú ý nghiên các cây cỏ thuộc chi Dioscorea họ Củ nâu

(Dioscoreaceae) với mục đích chiết xuất diosgenin sản xuất các chế phẩm

hormon steroid Nhu cầu về lượng thân rễ Dioscorea để sản xuất diosgenin

ngày càng lớn, trong khi đó nguồn nguyên liệu cung cấp diosgenin ngày càng giảm do sự khai thác quá mức [27], [34], [36] Điều này đòi hỏi cần tìm thêm những nguồn nguyên liệu khác cung cấp diosgenin Trong khi đó chi

Dioscorea trên thế giới có khoảng 600 loài, ở Việt Nam có hơn 40 loài [8],

[13], [40] Và còn nhiều loài trong số đó chưa được nghiên cứu để xác minh hàm lượng diosgenin

2

Gần đây chúng tôi mới phát hiện một loài Dioscorea sp tại Đà Nẵng mà

người dân địa phương gọi là cây Rận trâu (từ đây chúng tôi gọi loài này là Rận trâu) Cho đến nay, theo tổng quan tài liệu chưa thấy có nghiên cứu nào sâu về cây này ở Việt Nam

Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và

thành phần hóa học của cây Rận Trâu (Dioscorea sp.), họ Củ nâu

(Dioscoreaceae) ở Đà Nẵng” với mục tiêu :

- Nghiên cứu đặc điểm thực vật, đặc điểm vi học và giám định tên khoa học của cây Rận trâu ở Đà Nẵng

- Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số saponin từ thân rễ cây Rận trâu

- Định lượng diosgenin trong thân rễ Rận trâu

3

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Chi Dioscorea L

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Diocorea

Vị trí phân loại của chi Dioscorea trong hệ thống phân loại thực vật của

Takhatajan 1987 [4] như sau:

Thực vật chí Đông Dương [42] mô tả:

Cây cỏ lâu năm hoặc hàng năm Bộ phận dưới mặt đất giàu chất dự trữ (tinh bột) Thân leo, có những loài thì thân quấn sang phải, số khác thì quấn sang trái Lá nguyên, một số ít trường hợp là lá kép; lá mọc xen kẽ hoặc mọc đối Kiểu hoa: đa phần hoa đơn tính, hiếm khi gặp kiểu hoa khác Hoa thường không có cuống hoặc có cuống rất ngắn mọc thành chùm hay bông rủ xuống

Lá đài và cánh hoa giống nhau, lá đài 3, cánh hoa 3 Hoa đực: nhị 6 hoặc 3 có khi lép hay không có và rất ngắn Hoa cái giữa các loài trong chi không khác nhau lắm, các đặc điểm không phong phú như hoa đực Bầu 3 ô, mỗi ô chứa 2 noãn, noãn ngược, đầu nhụy 6 tạo thành 3 cặp Quả nang chẻ ô có 3 cánh Quả mở bằng cách nứt dọc theo mép của cánh với trục quả Hạt có cánh ở tất

cả các loài

 Phân bố:

4

Chi có khoảng 600 loài, phân bố rộng ở vùng nhiệt đới và ôn đới châu

Á, Australia, châu Mỹ Ở Việt Nam có hơn 40 loài [8], [13], [40] Ở châu Á

có khoảng 140 loài [38]

1.1.3 Các nghiên cứu về phân loại thực vật của chi Dioscorea L ở Việt

Nam

Nhiều tác giả Việt Nam và nước ngoài đã nghiên cứu chi Dioscorea L ở

Việt Nam về mặt phân loại thực vật

Loureiro trong bộ “Thực vật chi Nam bộ” đã mô tả 6 loài thuộc chi

Dioscorea L ở Nam bộ nước ta [37]

Prain và Burkill đã mô tả 51 loài thuộc chi Dioscorea L ở Đông dương,

trong đó Việt Nam có 27 loài [28] (Bảng 1.1) Đây là công trình lớn nhất và

có giá trị nhất về nghiên cứu phân loại chi Dioscorea L ở Đông dương cũng

như Việt Nam

Bảng 1.1 Số lượng các loài trong chi Dioscorea L ở Việt Nam

1 Stenophora Uline 4

2 Stenocorea Prain et Burkill 1

3 Combilium Prain et Burkill 1

4 Illigastrum Prain et Burkill 1

5 Shannicorea Prain et Burkill 1

6 Paramecocarpa Prain et Burkill 1

7 Lasiophyton Uline 7

8 Opsophyton Uline 1

9 Enantiophyllum Uline 10

Năm 1972, Phạm Hoàng Hộ trong cuốn “Hải nam thực vật chí” đã giới

thiệu 26 loài ở Việt nam [17], tác giả đã tóm tắt nêu sự phân bố và bổ sung

thêm hình vẽ các loài Prain et Burkill đã công bố trong “Thực vật chí tổng

5

quát Đông dương” [28] Đây là một tài liệu mang tính chất phổ biến khoa

học, có giá trị trong việc nhận biết các loài Năm 2000 các tác giả đã đưa tổng

số loài lên 43 loài

Năm 1977, Lê Đình Bích đã thống kê và lập danh mục gồm 36 loài

thuộc chi Dioscorea, tác giả đã mô tả 8 loài trong đó có 2 loài mới đối với hệ thực vật Việt nam (Dioscorea subcalva Prain et Burkill và D collettii Hook

f.) [5] Năm 1996, kết hợp điều tra nghiên cứu thực địa với việc tra cứu các tài liệu tác giả và cộng sự đã đưa ra bảng gồm 41 loài thuộc chi Củ nâu ở Việt Nam, nêu sự phân bố của các loài này ở Việt Nam và các nước lân cận [6] Tổng hợp các tài liệu trên cùng sự điều tra trong chương trình địa lý y tế quân sự Miền trung và Địa lý y tế quân sự Tây nguyên chúng tôi lập được

danh sách các loài thuộc chi Dioscorea L thường được sử dụng ở các địa

phương của nước ta (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Một số loài Dioscocrea L ở Việt Nam

1 Dioscorea collettii Hook f Nần nghệ

2 D membranacea Piere Nần đen

3 D dissimulan et Burkill Từ dấu

4 D hemsleyi Prain et Burkill Từ hemsley

5 D paradoxa Prain et Burkill Từ ngược

6 D.subcalva Prain et Burkill Cư chinh

7 D aff Tokoro Mark Nần dứa

8 D zingiberensis Nần gong

1.1.4 Các nghiên cứu về hóa học của chi Dioscorea L

Có nhiều công trình nghiên cứu về mặt hóa học của các cây thuộc chi

Dioscorea Kết quả nghiên cứu cho thấy thành phần chủ yếu trong thân rễ của

6

các loài này là tinh bột Nhiều loài được xếp vào danh sách nguyên liệu để thu

tinh bột (D alata) Tinh bột trong thân rễ của một số loài Dioscorea không

chỉ sử dụng làm lương thực, thực phẩm mà còn làm tá dược trong sản xuất thuốc, một số loài có hàm lượng tanin cao

Takeda đã nghiên cứu sapogenin steroid của họ Dioscoreaceae, ông nhận thấy rằng có sự liên quan về mặt hóa học và hình thái giải phẫu giữa các loài

khác nhau trong chi Củ nâu (Dioscorea L.) Theo tác giả các loài thuộc section Stenophora Uline thường chứa saponin steroid trong thân rễ, còn ở

các section khác không tìm thấy các chất này [40] Phần lớn các công trình

nghiên cứu về mặt hóa học của chi Dioscorea L thường quan tâm đến thành

phần saponin trong thân rễ và thành phần này thường được coi là hoạt chất chính Các nghiên cứu về mặt hóa học của họ Củ nâu trước đây cho thấy có saponin steroid và sự có mặt của alcaloid trong một số loài trong chi Củ nâu

(Dioscorea L.) Tuy nhiên việc nghiên cứu về các alcaloid chưa được chú ý

đến nhiều

Có rất nhiều công trình nghiên cứu saponin steroid trong chi Dioscorea

L Các công trình nghiên cứu của các nhà khoa học Mỹ đã chứng minh các saponin steroid có nhiều trong họ Hành (Liliaceae), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) và họ Củ Nâu (Dioscoreaceae) Đáng chú ý nhất là các loài

trong chi Dioscorea L trước đây trong công nghiệp để tổng hợp các thuốc

hocmon steroid chủ yếu dùng diosgenin được chiết xuất từ các loài thuộc chi

Dioscorea L Khoảng 90% các hormon được sản xuất từ diosgenin và các các

sapogenin có cấu trúc tương tự 117 loài (chiếm 18% tổng số loài) của chi

Dioscorea L đã được nghiên cứu về saponin steroid, có nhiều loài có hàm

lượng rất cao (Dioscorea spiculiflora Heml.) Với sự hỗ trợ của các phương

tiện phân tích các nhà khoa học đã phân lập ra nhiều chất trong thân rễ của chi này [6]

7

Năm 1986, Nguyễn Hoàng, Lê Đình Bích đã nghiên cứu saponin steroid của 8 loài thuộc chi này, hàm lượng diosgenin trong thân rễ và rễ củ (tính theo trọng lượng khô) của chúng rất khác nhau [5]

Nguyễn Hoàng và cộng sự đã nghiên cứu diosgenin trong Nần gừng thu mẫu tại Quảng Nam- Đà Nẵng, đã xác định hàm lượng 1% diosgenin trong thân rễ [14]

Năm 1985, Đống Việt Thắng và cộng sự đã phân lập được từ loài D

deltoidea nhập nội vào Việt Nam 2 saponin A và B, saponin A trùng với

deltonin Khi thủy phân saponin A thì được diosgenin và phần đường gồm glucose và L-rhamnose Saponin B trùng với diocin Thủy phân saponin B thu được diosgenin và phần đường gồm D-glucose và L-rhamnose [16]

D-Nguyễn Xuân Cường và cộng sự đã nghiên cứu thành phần hóa học

trong D hispida Dennst Đã xác định hàm lượng saponin 10% trọng lượng

khô Saponin này có tác dụng trị nấm ngoài da Tác giả đã xác định và phân lập cấu trúc của genin A [10]

Các công trình nêu trên cho thấy saponin steroid có trong nhiều loài

thuộc chi Dioscorea ở nước ta Một số loài có hàm lượng diosgenin lớn có thể

nghiên cứu trồng để chiết xuất diosgenin

1.1.5 Ứng dụng của chi Dioscorea

1.1.5.1 Ứng dụng trong đời sống

 Do thân rễ chứa nhiều chất dinh dưỡng nên một số loài Dioscorea

được sử dụng làm lương thực, chế biến thức ăn, đặc biệt khi thiếu đói, giáp

hạt như: khoai mỡ (D alata), củ từ (D esculenta), khoai rạng (D glabra), củ mài (D persimilis)…[4], [8], [13]

 Thân rễ chứa tanin, dùng để nhuộm lưới và quần áo như: Củ nâu

(D cirhosa), từ ngược mùa (D intempestiva)…[8], [13]

8

 Thân rễ một số loài có độc, dùng để diệt chấy rận, duốc cá, tẩm

mũi tên như: củ mài gừng (D zingiberensis), từ poilane (D deltoidea), củ nần (D hispida), …[8], [13]

1.1.5.2 Ứng dụng trong y học

Một số loài dùng để chiết xuất diosgenin từ thân rễ Ngoài ra, nhiều loài

trong chi Dioscorea được sử dụng làm thuốc Dưới đây là một số tác dụng của các loài Dioscorea:

- Bổ dưỡng nhất là khi cơ thể suy nhược, thận suy: D alata, D

asculenta, D glabra, D persimilis…[8], [9], [13]

- Chỉ huyết, tiêu ứ huyết: D bulbifera, D cirrhosa, D esculenta [8],

[9], [13]

- Mạnh gân xương, trị phong thấp, đau lưng, mỏi gối: D hispida, D

pentaphylla, D collettii…[8], [9], [13]

- Trị sưng tấy, vết thương, phần mềm: D esculenta, D chingii, D

subcalva, D pentaphylla, D hispida…[8], [9], [13]

- Giải độc: D esculenta …[8], [9], [13]

Các loài Dioscorea có chứa phytoestrogens, các chất này có nhiều tác

dụng kháng độc tố như làm chậm quá trình lão hóa của cơ thể và tăng cường

sức khỏe toàn diện nhất là ở phụ nữ Gần đây, thân rễ Dioscorea được xác

định có tác dụng điều chỉnh đáp ứng miễn dịch, kháng viêm, chống loãng xương Thêm nữa, tác dụng chống oxy hóa của dioscorin, một protein dự trữ

trong thân rễ Dioscorea cũng được nghiên cứu rộng rãi Đã chứng minh được rằng sử dụng thân rễ Dioscorea có thể cải thiện một số bất thường về chuyển

hóa bao gồm tăng đường huyết, bất thường chức năng ruột và chuyển hóa lipid (Jeon và cộng sự, 2006) [40]

9

1.2 Diosgenin

1.2.1 Công thức cấu tạo, tính chất lý, hóa học

Diosgenin là một sapogenin steroid, được sản xuất thông qua thủy phân

saponin bằng acid, base mạnh hoặc các enzyme

Công thức cấu tạo:

CH3C

H3

CH3

CH3

O H

O O

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của diosgenin

Tên IUPAC: (3β,25R)-spirost-5-en-3-ol

+ Acid sulfuric đậm đặc hòa tan các saponin và cho thấy màu thay đổi

từ vàng, đỏ, lơ-xanh lá hay lơ-tím (Phản ứng Salkowski)

+ Sapogenin hòa tan vào 1ml anhydrid acetic, cho thêm 1 giọt H2SO4đậm đặc cho màu xanh lá (Phản ứng Liebermann – Burchardt)

10

1.2.2 Ứng dụng của diosgenin

- Diosgenin được chứng minh là có tác dụng duy trì ổn định mức cholesterol máu và là nguyên liệu khởi đầu cho việc tổng hợp một số sản phẩm nội tiết tố như: dehydroepiandrosteron, progesteron Diosgenin có tác dụng ngăn ngừa sự mất xương ở mức độ tương tự estrogen Do vậy diosgenin được sử dụng để điều trị cho bệnh nhân sau mãn kinh để làm giảm sự tiến

triển loãng xương [36]

- Diosgenin có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu và huyết khối, kéo dài thời gian thromboplastin (APTT), thời gian thrombin (TT), thời gian prothrombin (PT) Do đó, nó có tác dụng trong việc điều trị các bệnh về tim

mạch như bệnh mạch vành và cơn đau thắt ngực [32]

- Trong các tế bào ung thư vú HER2-overexpressing, người ta thấy có sự tăng lên rõ rệt của Fatty acid synthetase (FAS) Diosgenin có khả năng ngăn chặn sự xuất hiện của FAS trong các tế bào ung thư vú Diosgenin ưu tiên ức chế sự tăng sinh và gây độc tế bào ung thư HER2-overexpressing Hơn nữa diosgenin ức chế phản ứng phosphoryl hóa Akt, mTOR và JNK Diosgenin có khả năng ức chế sự tồn tại, sự phát triển và gia tăng của các tế bào ung thư vú

[29], [33]

- Ứng dụng quan trọng của diosgenin đó là nguồn nguyên liệu bán tổng hợp ra 16-dehydro pregnenolon acetat (16-DPA), là chất trung gian để tổng hợp các dẫn chất steroid Khoảng 50- 60% dẫn chất steroid dùng làm thuốc trên toàn cầu được sản xuất từ diosgenin Hàng năm ước tính ngành dược cần

10.000 tấn thân rễ Dioscorea để sản xuất diosgenin [34], [36]

Trong số hàng trăm saponin steroid được biết cho đến nay thực tế cũng chỉ 10 chất có giá trị kinh tế lớn vì hai lý do:

- Có nguồn nguyên liệu tự nhiên dồi dào hoặc trồng trọt dễ có năng xuất cao

11

- Hệ thống Spiroketal trong cấu trúc của chúng dễ dàng bị phá để cho ra hợp chất trung gian là dehidropregnenolon acetat (DPA) là khung cơ bản để tổng hợp các thuốc steroid

Diosgenin là chất có ưu thế nhất về 2 phương diện trên [11]

1.2.3 Các loài Dioscorea dùng làm nguồn nguyên liệu chiết xuất

diosgenin

Khoảng 90% các dẫn chất steroid dùng làm thuốc được sản xuất đều đi

từ nguyên liệu là diosgenin Mặc dù diosgenin có gặp trong họ Liliaceae (chi

Trillium), họ Zingiberaceae (chi Costus), họ Taccaceae (chi Tacca) nhưng chỉ

có họ Dioscoreaceae mới có giá trị thực tế [23]

Theo số liệu của Barua và cộng sự năm 1954, 1956 có trên 50 loài

Dioscorea chứa diosgenin [35] Những loài Dioscorea có hàm lượng

diosgenin đáng kể thường có thân quấn ngược chiều kim đồng hồ [23] Phần lớn diosgenin được sản xuất trên thế giới xuất phát từ các loài Trung Mỹ, chủ

yếu là D floribunda và D composita, cả hai đều mọc hoang ở bản địa [35] Trong thân rễ của D floribunda D composita thành phần diosgenin và

yamogenin chiếm gần 90 % glycosid toàn phần, cả hai đều là những tiền chất

steroid có giá trị D deltoidea chứa diosgenin ở trạng thái tinh khiết nhất, nên

có giá trị cao trên thị trường steroid [30]

D nipponica và D zingiberensis chứa diosgenin và được trồng nhiều ở

Trung Quốc, nước sản xuất diosgenin nhiều nhất hiện nay [28]

Bảng 1.3 Các loài Dioscorea quan trọng được sử dụng để sản xuất

diosgenin trong công nghiệp [36]

D composita Hemsl

Mexico

D mexacana Dcheidw

12

D floribunda M Martens & Galeotti

D deltoidea Wall Ex Griseb Ấn Độ

D sylvatica Eckl Nam Phi, Zimbabwe

- D dissimulans (hàm lượng diosgenin 2%)

- D membranacea (hàm lượng diosgenin 2- 2.3%)

- D collettii (hàm lượng diosgenin 2.5- 4.4%)

- D zingiberensis (hàm lượng diosgenin 1.4- 2.4%)

Về mối liên quan giữa hình thái thực vật và thành hóa học, các loài

Dioscorea có hàm lượng saponin steroid đáng kể ở Việt Nam, bên cạnh có

đặc điểm thân rễ và dây leo quấn trái, đều có những cặp gai cong ở cuống lá [14]

Cũng trong thời gian này Viện Dược liệu [19], di thực 3 loài Dioscorea vào Việt Nam: D composita, D floribunda và D deltoidea Đã xác định điều

kiện trồng chăm sóc phù hợp với 3 loài trên Tuy nhiên sapogenin thu được từ

D composita và D floribunda đều có tạp chất pennogenin (hàm lượng

pennogenin trong sản phẩm từ vết đến 35% đối với D composita, và từ 1-5%

13

đối với D floribunda) Các nhà khoa học đã nghiên cứu xử lý tạp chất

penogenin song không thành công Nghiên cứu bán tổng hợp 16-DPA từ hỗn

hợp diosgenin- pentogenin chưa biết tỷ lệ thành phần, chiết xuất từ D

composita và D floribunda cho thấy hiệu suất chỉ bằng 1/2 so với điều chế từ

diosgenin có hàm lượng trên 90% [19]

Các nhà khoa học tại Viện Dược liệu đã xây dựng quy trình chiết xuất

diosgenin từ dược liệu, áp dụng để chiết diosgenin từ D floribunda trên quy

mô phòng thí nghiệm và quy mô bán công nghiệp Từ diosgenin chiết được đã tổng hợp 16- DPA và các dẫn chất steroid [26]

1.2.4 Các phương pháp định lượng diosgenin

 Phương pháp cân

Bột dược liệu được thủy phân bằng acid, chiết bằng dung môi hữu cơ, sau đó bốc hơi dung môi, sấy, cân [21]

 Phương pháp đo quang

Bột dược liệu được thủy phân, chiết bằng dung môi hữu cơ, sau đó ,sau

đó tiến hành sắc ký lớp mỏng để xác minh diosgenin Diosgenin được chiết bằng cloroform, lên màu bằng FeCl3 và H3PO4- H2SO4 (10:1, v/v), đo ở bước sóng 485 nm [21]

 Phương pháp sắc ký khí

Bột dược liệu được ủ men, thủy phân, trung tính hóa, sấy khô, hòa tan trong dung môi với chất nội chuẩn cholesterol rồi phân tích bằng máy sắc ký khí [20]

14

Bột dược liệu được thủy phân, chiết bằng dung môi hữu cơ, bốc hơi dung môi, hòa tan cắn trong cloroform Chấm sắc ký của mẫu, cùng với dãy diosgenin đối chiếu Sau đó đo mật độ quang vết sắc ký bằng Densitometer [1], [27]

Trong 4 phương pháp trên, phương pháp cân đòi hỏi lượng mẫu nhiều và gặp sai số lớn trong quá trình chiết tách mẫu Phương pháp đo quang phụ thuộc vào độ bền màu của diosgenin với hỗn hợp thuốc thử Phương pháp sắc

ký khí có quá trình chuẩn bị mẫu phức tạp Phương pháp HPTLC kết hợp với máy Densitometer cho kết quả nhanh, dễ thực hiện và kết quả khá chính xác thích hợp cho định lượng sơ bộ Phương pháp HPLC được sử dụng phổ biến hiện nay

1.3 Cây Rận Trâu

1.3.1 Đặc điểm thực vật

Thân dây leo (hoặc bò lan trên mặt đất ở những bãi đất trống) quấn sang trái, dài đến 5m, đường kính thân 2-3mm, thân có từng cặp gai cong , dài 1-2mm ở hai gốc cuống lá Lá mọc so le có cuống dài 5-7cm mang 3 lá chét, lá chét ở giữa to và dài hơn, hình trứng nhọn ở đầu, hai lá bên bé hơn, hình trứng lệch, phiến lá có 3 gân xuất phát từ gốc Củ có nhiều nhánh, nhìn hao hao giống củ gừng, có nhiều gai nhọn và rễ con cứng phân bố đều trên mặt củ Cây tập trung ở những khu rừng thưa có ánh sáng hoặc đồi chè, đất pha cát, ven các bờ mương, bờ suối [24]

1.3.2 Thành phần hóa học

Cho đến nay, theo tổng quan tài liệu, chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học của cây Rận Trâu Vì vậy việc nghiên cứu thành phần hóa học của cây Rận Trâu là cần thiết, góp phần tăng giá trị ứng dụng của cây vào thực tế, một nguồn nguyên liệu chiết diosgenin tiềm năng, góp phần làm phong phú hơn những hiểu biết về hóa thực vật của các cây thuộc chi

Dioscorea, bổ sung thêm thông tin vào cơ sở dữ liệu khoa học của Việt Nam

15

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Mẫu cây Rận Trâu được thu hái ở Bà Nà- Đà Nẵng vào tháng 02/2015 Một phần thân, lá, thân rễ được bảo quản trong cồn 600 để nghiên cứu đặc điểm vi phẫu

Một phần thân, lá, thân rễ được rửa sạch, thái lát mỏng, sấy khô ở 600C, nghiền thành bột thô bảo quản nơi khô thoáng

2.1.2 Các hóa chất, máy móc, thiết bị dùng trong nghiên cứu

Các hóa chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của dược điển Việt Nam IV

- Diosgenin đối chiếu của Viện Dược liệu

- Bản mỏng silicagel GF254 (Merck, Germany)

- Silicagel dùng cho sắc ký cột pha thường (Merck, Kielselgel 60, cỡ hạt

là 0,020-0,040 và 0,040-0,063 mm), pha đảo (30-50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd), Dianiom HP-20

 Hóa chất:

- Acid sulfuric, acid clohydric, natri hydroxyd, natri carbonat…

- Các thuốc thử dùng trong phản ứng định tính: TT Mayer, Dragendorff, Buchardat, Diazo…

- Cloramin, cloralhydrat, acid acetic, xanh methylen, đỏ son phèn

- Thuốc thử vanillin trong acid sulfuric đặc

- Dung dịch đệm phosphat- natri clorid

 Dung môi: Cloroform, methanol công nghiệp, methanol Merck, ethanol, aceton, nước cất, Acetonitril (Merck), acid phosphoric (Merck), nước cất 2 lần

16

 Dụng cụ: bát sứ, ống nghiệm, pipet chính xác, bình nón, bình đựng mức, cốc cỏ mỏ, ống đong

 Thiết bị:

- Bếp cách thủy, sinh hàn hồi lưu, bình ngấm kiệt

- Máy đo quang phổ UV khoa Hóa phân tích- Đại học dược Hà Nội

- Máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR AM500 FT-NMR spectrometer

- Máy HPLC Shimadzu LC- 10ATVP tại khoa Hóa phân tích- Tiêu chuẩn Viện Dược liệu

- Cân phân tích Precisa, cân kỹ thuật Sartorius

- Máy đo độ ẩm Satorius

- Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 368 nm

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật

 Đặc điểm hình thái: Quan sát, mô tả đặc điểm hình thái của mẫu

nghiên cứu tại thực địa bằng phương pháp mô tả phân tích, chụp ảnh, thu hái

và làm tiêu bản mẫu khô Mẫu tiêu bản khô được lưu tại phòng tiêu bản, Bộ môn thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội

 Nghiên cứu đặc điểm hiển vi [7]

- Đặc điểm vi phẫu: Vi phẫu được cắt, bằng máy cắt cầm tay, tẩy và nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép, quan sát dưới kính hiển vi để xác định đặc điểm vi phẫu và chụp ảnh dưới kính hiển vi

- Đặc điểm bột: Lá, thân, thân rễ sấy khô ở 600, nghiền nhỏ thành bột mịn bằng cối sứ, rây lấy bột mịn, lên tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi để xác định đặc điểm bột và chụp ảnh dưới kính hiển vi

 Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu:

Giám định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích các đặc điểm hình thái, đặc điểm của bộ phận sinh sản, so sánh đối chiếu với mẫu tiêu bản lưu

2.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học

2.2.2.1 Định tính một số hợp chất hữu cơ trong dƣợc liệu bằng phản ứng hóa học

Chiết xuất, phân tích sơ bộ các nhóm chất hữu cơ trong dịch chiết toàn phần từ bột thân rễ cây Rận trâu bằng các phản ứng hóa học đặc trưng [5], [9]

Định tính các nhóm chất

Sơ bộ định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân rễ Rận Trâu bằng các phản ứng hóa học đặc trưng [7], [11] Định tính các nhóm chất: alcaloid, anthranoid, acid hữu cơ, coumarin, flavonoid, tanin, saponin, glycosid tim, acid amin, chất béo, đường khử, steroid

 Định tính glycosid tim:

Cân khoảng 10g bột dược liệu, cho vào bình nón dung tích 250ml Thêm 100ml ethanol 30%, lắc đều, ngâm 24 giờ Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ, loại tạp bằng một lượng vừa đủ dung dịch chì acetat 30%, lọc bỏ tủa, dịch lọc cho vào bình gạn dung tích 125ml, lắc kỹ với hỗn hợp cloroform-ethanol (2:1) 3 lần, mỗi lần 10ml, gạn lấy dịch cloroform-ethanol, bốc hơi cloroform-ethanol trên nồi cách thủy, loại nước trong hỗn hợp bằng natri sulfat khan, lọc Dịch lọc chia vào 4 ống nghiệm khô, cô cách thủy đến khô, cán thu được tiến hành làm các phản ứng sau:

 Phản ứng Liebermann-Burchardt: Hòa cắn với 1ml dung dịch anhydrid acetic, lắc đều để hòa tan cắn, nghiêng thành ống nghiệm 450, cho từ từ theo thành ống 1ml dung dịch acid H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng ngăn cách có màu biến đổi từ hồng sang xanh lá chứng tỏ có sự hiện diện của khung steroid

18

 Phản ứng Baljet: Hòa tan cắn trong ống nghiệm bằng 1ml ethanol 90%, lắc đều cho hòa tan hết cắn Nhỏ từng giọt khoảng 0.5ml thuốc thử Baljet (acid picric1% và NaOH 10% theo tỷ lệ 1/9) mới pha Dung dịch glycosid tim có màu đỏ cam đậm hơn so với ống chứng (chỉ chứa thuốc thử Baljet)

 Phản ứng Legal: Hòa tan cắn trong ống nghiệm với 1ml ethanol 900

Thêm 5 giọt nitroprussiat 1% và 5 giọt dung dịch NaOH 10% Lắc đều, so với ống chứng không có dịch chiết Dung dịch có glycosid tim cho màu đỏ cam

 Phản ứng Keller-Kiliani: Hòa tan cắn trong ống nghiệm bằng 1ml cồn

900, lắc đều cho tan hết cắn Thêm vài giọt FeCl3 5%/acid acetic, lắc đều để nghiêng ống nghiệm 450 Thêm từ từ đồng lượng H2SO4 đặc (1ml) theo thành ống nghiệm, xuất hiện màu tím đỏ ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng

 Định tính flavonoid

Cân 10g bột dược liệu thô vào bình nón Thêm 50ml cồn 900, đun sôi cách thủy trong 10 phút, lọc nóng qua giấy lọc Dịch lọc đem cô cách thủy đến khi còn khoảng 20ml, dịch lọc được tiến hành làm các phản ứng sau:

 Phản ứng Cyanidin: Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết cồn, thêm một

ít bột Mg kim loại (khoảng 10mg) Nhỏ từng giọt (khoảng 5 giọt) acid HCl đậm đặc vào, sau vài phút quan sát màu Các hợp chất flavonoid sẽ cho màu

từ hồng tới đỏ

 Phản ứng với dung dịch kiềm: lấy 2ml dịch chiết cồn, thêm vài giọt NaOH 10%, dung dịch chứa flavonoid thường có những biến đổi về màu sắc làm cho dung dịch có màu đậm lên hay đổi màu Đa số các flavonoid làm dung dịch chuyển từ không màu hay vàng nhạt chuyển sang màu nâu vàng hay vàng cam

19

 Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho 2ml dịch chiết vào 1 ống nghiệm, thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl3 5% Dung dịch có chứa flavonoid sẽ xuất hiện tủa màu xanh

 Định tính alcaloid

Cho khoảng 10g dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thấm ẩm dược liệu bằng amoniac đặc Đậy kín trong 30 phút, sau đó cho vào đó 50ml cloroform lắc 15 phút, ngâm qua đêm, lọc Dịch lọc lắc kỹ với 20ml dung dịch H2SO4 10%, gộp dịch chiết acid, cô cách thủy còn khoảng 5ml, cho vào

3 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml, tiến hành các phản ứng cới các thuốc thử chung của alcaloid sau:

 Phản ứng với thuốc thử Mayer (K2HgI4): Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt thuốc thử Mayer Các alcaloid sẽ cho tủa vô định hình màu trắng hay vàng ngà

 Phản ứng với thuốc thử Dragendorff (KBiI4): Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff Các alcaloid cho tủa màu đỏ cam đến đỏ

 Phản ứng với thuốc thử Bouchardat (iodo-iodid): Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat Các alcaloid cho tủa màu nâu đến nâu đen

 Định tính coumarin:

Lấy 10g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 50ml còn

900, đun cách thủy tới sôi 5 phút, lọc nóng qua giấy lọc Dịch chiết thu được đem làm các phản ứng sau:

 Phản ứng mở, đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống ngiệm nhỏ, mỗi ống 1ml dịch chiết Ống 1 thêm 0.5ml NaOH, ống thứ 2 thêm một lượng tương đương nước cất Đun cách thủy 2 ống trong vòng 2 phút Để nguội, thêm vào mỗi ống 2ml nước cất, lắc đều rồi quan sát Nếu ống 1 trong hơn ống 2 và khi acid hóa ống này trở lên đục tương đương ống 2 : Có coumarin

20

 Phản ứng với thuốc thử diazo: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết Thêm vào đó khoảng 2ml dung dịch NaOH 10%, lắc kỹ rồi nhỏ vài giọt thuốc thử diazo mới pha Dung dịch có coumarin sẽ có màu đỏ thẫm

 Quan sát hiện tượng huỳnh quang: Nhỏ vài giọt dịch chiết kên giấy lọc, nhỏ chồng tiếp vài giọt dung dịch NaOH 10% sấy nhẹ Che một phần diện tích vết chất bằng một vật chắn rồi đặt dưới ánh sáng tử ngoại 365nm trong vài phút, bỏ vật chắn ra sẽ thấy phần bị che sáng hơn phần không bị che Nếu tiếp tục chiếu tia UV thì 2 bên sẽ sáng như nhau

 Định tính saponin:

 Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho khoảng 1g bột dược liệu vào một ống nghiệm to (15ml), thêm 20ml nước cất Đun sôi nhẹ , lọc nóng vào một ống nghiệm to (15ml) khác, cho thêm nước cất cho đủ khoảng 10ml, bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc trong vòng 5 phút, để yên và quan sát cột bọt và đánh giá kết quả:

+ Bọt bền trong 5 phút: + + Bọt bền trong 30 phút: ++

+ Bọt bền trong 60 phút: +++

 Thử nghiệm Fontan-Kaudel: Lấy khoảng 2g bột dược liệu vào bình nón

có dung tích 100ml, thêm 20ml ethanol Đun sôi trong 5 phút, lọc lấy dịch chiết Bố trí 2 ống nghiệm

Ống 1: 5ml HCl 0.1N + 5 giọt dịch chiết

Ống 2: 5ml NaOH 0.1N + 5 giọt dịch chiết

Lắc mạnh 2 ống nghiệm trong vòng một phút, quan sát và so sánh chiều cao cột bọt giữa 2 ống

- Nếu cột bọt trong 2 ống tương đương nhau: sơ bộ kết luận dược liệu có saponin triterpenoid

- Nếu ống 2 có cột bọt cao hơn ống 1 gấp 2-3 lần : sơ bộ kết luận dược liệu có saponin steroid

21

 Định tính anthranoid

Phản ứng Borntrager: Lấy khoảng 3g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 50ml dung dịch H2SO4 10% Đun sôi cách thủy 15 phút Lọc qua lớp bông mỏng lấy dịch lọc dồn vào bình gạn, lắc 3 lần với cloroform mỗi lần 10ml Gộp dịch chiết cloroform, bốc hơi cách thủy còn khoảng 5ml, thêm 1ml NaOH 10%, lắc nhẹ Lớp NaOH sẽ có màu đỏ

 Định tính đường khử, acid hữu cơ :

Cho 5g bột dược liệu vào một ông nghiệm to (15ml), thêm 10ml nước, đun cách thủy trong 10 phút Lọc lấy dịch lọc đem định tính

 Định tính đường khử: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 3 giọt thuốc thử Fehling A và 3 giọt thuốc thử Fehling B Đun sôi cách thủy trong 5

phút Dịch chiết có đường khử sẽ xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch

 Định tính acid hữu cơ: Cho 2ml dịch chiết ở trên vào ống nghiệm rồi thêm một ít tinh thể Na2CO3 Nếu dịch chiết có chứa acid hữu cơ sẽ có bọt khí

nổi lên

2.2.2.2 Chiết xuất, phân lập các hợp chất trong thân rễ Rận Trâu

 Chiết xuất [11]:

 Xác định độ ẩm: Lấy khoảng 2g bột dược liệu để xác định độ ẩm

Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 1100C Trải đều dược liệu lên đĩa cân, đậy đĩa cân và đợi máy chạy tự động và hiển thị kết quả Tiến hành 3 lần với

3 mẫu ở các 3 vị trí khác nhau để lấy trung bình

 Chiết xuất bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng: Dược liệu

được nghiền nhỏ đến kích thước thích hợp (bột thô) cho vào bình kín, ngâm ở nhiệt độ phòng với cồn 700 (2 ngày x 3 lần), thu được dịch chiết toàn phần Dịch chiết được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn ethanol toàn phần

22

 Chiết phân bố tạo các dịch chiết phân đoạn: Phân tán cao cắn

ethanol toàn phần trong nước, rồi tiến hành lắc phân đoạn lần lượt với các dung môi hữu cơ n-hexan, cloroform, ethylacetat, n-butanol Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm duy trì nhiệt độ nồi cách thủy dưới 600C, thu được lần lượt cao cắn phân đoạn n-hexan, chloroform, ethylacetat, n-butanol và nước tương ứng

 Hàm lượng cắn các phân đoạn được tính theo công thức:

Trong đó: F: hàm lượng chất (%)

b: Khối lượng cắn (g)

M: Khối lượng dược liệu đem chiết (g)

x: độ ẩm dược liệu đem chiết (%)

 Phân lập [11], [12]:

 Định hướng các hợp chất cần phân lập và theo dõi quá trình phân

lập bằng sắc ký lớp mỏng SKLM được được thực hiện trên bản mỏng tráng

sẵn silicagel GF254 (Merck, Germany) Sắc ký đồ được quan sát dưới ánh đèn

tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm Hiện màu bằng thuốc thử vanillin/acid sulfuric đặc

 Phân lập các hợp chất saponin trong thân Rễ rận trâu bằng sắc ký cột Trong đó chất hấp phụ (pha cố định) được nhồi trong cột hình trụ và dung môi pha động được khai triển liên tục với nhiều loại hệ dung môi khác nhau Tùy theo chất được sử dụng trong cột khác nhau mà ta có các cơ chế và tên gọi khác nhau: Cột hấp phụ, cột phân bố, cột trao đổi ion… Sắc ký cột được tiến hành trên cột silicagel pha thường (0,040- 0,063 mm và 0,020- 0.040

+ Chất hấp phụ: Silicagel hấp phụ pha thuận và pha đảo

+ Cột sắc ký: Cột sắc ký có kích thước dài 40cm, đường kính 2,9-3,2

cm

+ Dung môi rửa giải là hỗn hợp dung môi được pha từ các dung môi thường dùng như: n-hexan, cloroform, ethylacetat, dicloromethane, aceton, methanol và nước

Tiến hành phân lập:

+ Chuẩn bị cột: Cố định cột trên giá đỡ, lót một lớp bông mỏng dưới đáy cột Cân một lượng silicagel vừa đủ, phân tán trong hệ dung môi rửa giải thành một hỗn hợp đồng nhất không có bọt khí Mở khóa của cột, rót nhanh hốn dịch silicagel vào cột để cho silicagel lắng tự nhên Bổ sung silicagel liên tục lên cột, chú ý không để cột bị khô hay làm xáo trộn lớp silicagel bề mặt Sau khi silicagel chảy được 2 giờ thì bổ sung dung môi đến gần miệng cột Đậy nút mài và để yên 12 giờ rồi tiến hành đưa mẫu lên cột

+ Nạp mẫu lên cột: Hòa mẫu cần phân lập trong dung môi thích hợp, trộn đều với một lượng vừa đủ silicagel, sấy khô rồi tán thành bột tơi xốp Cho bột lên cột thật đều, rải thành một lớp mỏng đều đặn Sau khi lớp bột mang mẫu ổn định, rắc thêm một lớp mỏng silicagel lên bề mặt và lót một lớp bông mỏng lên trên để tránh xáo động mặt cột khi cho dung môi rửa giải lên cột

24

+ Rửa giải: Phản hấp phụ bằng một hệ dung môi thích hợp, kiểm soát tốc

độ dòng chảy, hứng dịch rửa giải vào các bình nón hoặc ống nghiệm thích hợp Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng, gộp các phân đoạn có thành phần tương tự nhau thành những phân đoạn mới

Tinh chế các chất phân lập:

Sử dụng phương pháp kết tinh lại hoặc rửa nhiều lần bằng dung môi ít hòa tan các chất phân lập

Kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lâp:

Độ tinh khiết của chất phân lập được kiểm tra bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng Mỗi chất phân lập được kiểm tra bằng nhiều hệ dung môi khác nhau

2.2.2.3 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc

 Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được dựa trên các dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D-NMR và 2D-NMR) [11], [12] và so sánh dữ liệu phổ của hợp chất phân lập được với dữ liệu phổ có trong thư viện phổ và các tài liệu tham khảo

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều, phổ proton (1H-NMR hay proton NMR) cho biết môi trường hóa học của proton trong phân tử Các proton có môi trường hóa học khác nhau sẽ có độ dịch chuyển khác nhau Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C13 (13C-NMR) cung cấp các thông tin về môi trường hóa học của các carbon Các kỹ thuật xác định số lượng proton trên carbon cho biết số lượng proton liên kết trên mỗi carbon Nói cách khác các dữ liệu phổ cho biết carbon đó là C, CH, CH2, CH3, gián tiếp cho biết số carbon và hydro trong phân tử Kỹ thuật thường được sử dụng hiện nay là DEPT Trong phổ DEPT-135, C bậc IV không xuất hiện, C bậc II là các đỉnh âm, C bậc I và

H gắn trực tiếp trên nó (thường dùng hiện nay là HSQC), giữa proton của các

C kế cận (phổ COSY), hay phổ tương tác giữa proton và các carbon kế cận (thường dùng phổ HMBC) hoặc giữa các proton gần nhau trong không gian (NOESY, ROESY)

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT)

và 2 chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) được đo trên máy Brucker AM500 FT-NMR Spectrometer (với TMS là chất chuẩn nội), tại Viện hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2.3 Định lƣợng diosgenin trong thân rễ Rận trâu

Tiến hành định lượng diosgenin trong thân rễ Rận trâu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [2], [20], [24] Sắc ký lỏng hiệu năng cao còn được gọi là sắc ký lỏng áp suất cao là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ

sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng Khi phân tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân tách xảy ra ở nhiệt độ thường [2]

Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó Có 4 phương pháp định lượng được sử dụng trong sắc ký: phương pháp chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn nội, phương pháp thêm chuẩn, phương pháp chuẩn hóa diện tích [2]

Y: diện tích pic

a: giao điểm của đường chuẩn với trục tung

b: Độ dốc của đường chuẩn

Cx: Nồng độ của chất thử

Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ của chất thử

Cx =

có cặp gai nhỏ Phiến lá gồm 3 lá chét, hình thuôn hay elíp nhọn đầu, kích thước 6 - 9 x 2 - 3 cm, mép lá nguyên, lá chét giữa lớn hơn 2 lá bên, gốc 2 lá chét bên gần tròn và hơi lệch; 5 gân chính, gân phụ hơi rõ ở mặt dưới (Hình 3.1.1)

- Giám định tên khoa học:

Qua phân tích các đặc điểm hình thái mẫu cây Rận trâu thu được; kết

hợp với việc tra cứu các tài liệu khóa phân loại thuộc chi Dioscorea, căn cứ

vào các tài liệu [4], [8], [13], [40], so sánh mẫu tiêu bản thực vật với mẫu tiêu bản thực vật số hiệu P00642258 của phòng Tiêu bản Thực vật – Bảo tàng lịch

sử tự nhiên Paris (Phụ lục 1.2) và với sự giúp đỡ của TS Nguyễn Hoàng, Bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội (Phụ lục 1.3) thấy mẫu Rận trâu thu hái tại Đà Nẵng có các đặc điểm hình thái thực vật giống tới 95%

loài có tên khoa học là Dioscorea dissimulans Prain & Burk Tuy nhiên có

một đặc điểm cần lưu ý đó là cây Rận trâu có cặp gai cong ở gốc cuống lá trong khi loài này chỉ có cặp u nhỏ Vì vậy quá trình thẩm định chính xác tên khoa học của cây Rận trâu vẫn đang tiếp tục

Kết luận mẫu cây Rận trâu nghiên cứu là một loài thuộc chi Dioscorea,

họ Củ Nâu (Dioscoreaceae)

28

Hình 3.1.1: Một số đặc điểm hình thái của cây Rận trâu

A Đoạn thân có lá, B Cận cảnh đoạn thân, C,D Cặp gai cong ở gốc cuống lá; E Cuống lá, F, G Mặt trên của lá; H Mặt dưới của lá,

L Rễ; O, N, M Thân rễ

29

- Mẫu tiêu bản cây Rận trâu đã được lưu tại Phòng tiêu bản cây thuốc, Bộ môn thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội, số hiệu tiêu bản: HNIP/18151/16 (Phụ lục 1.4)

rễ thường nhẵn hơn, có màu vàng nâu rõ hơn Mặt cắt màu vàng nhạt, chất cứng và dai Dược liệu cứng và dai, mùi thơm nồng đặc biệt, vị đắng chát

3.1.2 Hình ảnh, đặc điểm vi phẫu của lá, thân và thân rễ cây Rận trâu 3.1.2.1 Đặc điểm vi phẫu lá

Phần gân lá: mặt trên lồi ít, mặt dưới lồi nhiều Biểu bì trên (1) là một

lớp tế bào tròn, nhỏ, đều đặn xếp thành một hàng Sát biểu trên là mô dày (2) gồm 1 lớp tế bào hình tròn, thành dày Bó libe gỗ gân giữa nằm trong vòng

mô cứng (3) gồm những mạch gỗ to (4) xếp ngẫu nhiên ở giữa, libe (5) tạo thành những đám nhỏ xếp thành vòng bao quanh các mạch gỗ Mô dày dưới (6) gồm 4-5 lớp tế bào hình tròn, thành dày xếp thành từng hàng Biểu bì dưới (7) là 1 lớp tế bào hình tròn xếp thành hàng đều đặn

Phần phiến lá: biểu bì giống phần gân lá Mô giậu (8) gồm 1-2 hàng tế

bào xếp đứng vuông góc với bề mặt biểu bì Mô mềm (9) gồm những tế bào khá tròn xếp lộn xộn với nhau (Hình 3.1.2)

1 Biểu bì trên, 2 Mô dày trên, 3 Vòng mô cứng, 4 Libe, 5.Gỗ, 6 Mô dày

dưới, 7.Biểu bì dưới, 8 Mô giậu, 9 Mô mềm

3.1.2.2 Đặc điểm vi phẫu thân

Đi từ ngoài vào trong, ngoài cùng là lớp biểu bì (1) gồm một hàng tế bào hình gần tròn xếp đều đặn Mô mềm vỏ (2) gồm 6-8 lớp tế bào hình đa giác hoặc hình trứng dài nằm ngang xếp khá đều đặn thành từng hàng Nội bì (3) là một lớp tế bào mỏng nằm sát lớp trụ bì hóa mô cứng ở bên trong

Phần trụ giữa chiếm phần lớn trong toàn bộ cấu tạo thân gồm:

Trụ bì hóa mô cứng (4) gồm 3-5 hàng tế bào thường là hình chữ nhật, xếp thành dãy không đều nhau, các dãy cũng không rõ ràng

Libe-gỗ: Các bó libe (5), bó gỗ (6) là những bó chồng, những bó này sắp xếp một cách lộn xộn trong mô mềm ruột Ở ngoài là những bó có thiết diện nhỏ, vào trong các bó libe-gỗ to hơn và nhiều lên Ở bó libe là những tế bào mảnh, nhỏ, màng mỏng

Mô mềm ruột: gồm 2 lớp tế bào Lớp ngoài (7) là những tế bào hình đa giác dài, xếp thành dãy dọc và không theo một trật tự nào, đôi chỗ có thể thấy

8

9

31

các tế bào xếp thành dãy xuyên tâm khá đều đặn, những tế bào này xếp sát nhau, hầu như không có khoảng gian bào, kích thước khá lớn Lớp trong (8) gồm những tế bào hình đa giác tròn, sắp xếp lộn xộn, giữa chúng có khoảng gian bào khá nhỏ, các tế bào có màng mỏng (Hình 3.1.3)

Hình 3.1.3 Vi phẫu thân Rận trâu

1 Biểu bì, 2 Mô mềm vỏ, 3 Nội bì, 4 Trụ bì hóa mô cứng, 5 Libe, 6 Gỗ,

7 Mô mềm ruột (lớp ngoài), 8 Mô mềm ruột (lớp trong)

3.1.2.3 Đặc điểm vi phẫu thân rễ

Đi từ ngoài vào trong ngoài cùng là lớp bần (1) gồm nhiều tế bào hình đa giác xếp lộn xộn Mô mềm (2) gồm những tế bào hình đa giác hoặc hình trứng, kích thước lớn, xếp lộn xộn, các tế bào mô khuyết (3) Bó sợi (4) xếp rải rác trong mô mềm Bó libe (5), bó gỗ (6) (Hình 3.1.4)

5 5

8