CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học
2.2.2.2. Chiết xuất, phân lập các hợp chất trong thân rễ Rận Trâu
Chiết xuất [11]:
Xác định độ ẩm: Lấy khoảng 2g bột dược liệu để xác định độ ẩm.
Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 1100C. Trải đều dược liệu lên đĩa cân, đậy đĩa cân và đợi máy chạy tự động và hiển thị kết quả. Tiến hành 3 lần với 3 mẫu ở các 3 vị trí khác nhau để lấy trung bình.
Chiết xuất bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng: Dược liệu được nghiền nhỏ đến kích thước thích hợp (bột thô) cho vào bình kín, ngâm ở nhiệt độ phòng với cồn 700 (2 ngày x 3 lần), thu được dịch chiết toàn phần.
Dịch chiết được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn ethanol toàn phần.
22
Chiết phân bố tạo các dịch chiết phân đoạn: Phân tán cao cắn ethanol toàn phần trong nước, rồi tiến hành lắc phân đoạn lần lượt với các dung môi hữu cơ n-hexan, cloroform, ethylacetat, n-butanol. Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm duy trì nhiệt độ nồi cách thủy dưới 600C, thu được lần lượt cao cắn phân đoạn n-hexan, chloroform, ethylacetat, n-butanol và nước tương ứng.
Hàm lượng cắn các phân đoạn được tính theo công thức:
F= x 100
Trong đó: F: hàm lượng chất (%) b: Khối lượng cắn (g)
M: Khối lượng dược liệu đem chiết (g) x: độ ẩm dược liệu đem chiết (%)
Phân lập [11], [12]:
Định hướng các hợp chất cần phân lập và theo dõi quá trình phân lập bằng sắc ký lớp mỏng. SKLM được được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 (Merck, Germany). Sắc ký đồ được quan sát dưới ánh đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm. Hiện màu bằng thuốc thử vanillin/acid sulfuric đặc.
Phân lập các hợp chất saponin trong thân Rễ rận trâu bằng sắc ký cột. Trong đó chất hấp phụ (pha cố định) được nhồi trong cột hình trụ và dung môi pha động được khai triển liên tục với nhiều loại hệ dung môi khác nhau.
Tùy theo chất được sử dụng trong cột khác nhau mà ta có các cơ chế và tên gọi khác nhau: Cột hấp phụ, cột phân bố, cột trao đổi ion…. Sắc ký cột được tiến hành trên cột silicagel pha thường (0,040- 0,063 mm và 0,020- 0.040
23
mm, Merck), silicagel pha đảo YMC (30- 50 àm, FuJisilisa Chemical Ltd.), Dianiom HP- 20.
Các bước tiến hành:
Chuẩn bị:
+ Chất hấp phụ: Silicagel hấp phụ pha thuận và pha đảo.
+ Cột sắc ký: Cột sắc ký có kích thước dài 40cm, đường kính 2,9-3,2 cm.
+ Dung môi rửa giải là hỗn hợp dung môi được pha từ các dung môi thường dùng như: n-hexan, cloroform, ethylacetat, dicloromethane, aceton, methanol và nước.
Tiến hành phân lập:
+ Chuẩn bị cột: Cố định cột trên giá đỡ, lót một lớp bông mỏng dưới đáy cột. Cân một lượng silicagel vừa đủ, phân tán trong hệ dung môi rửa giải thành một hỗn hợp đồng nhất không có bọt khí. Mở khóa của cột, rót nhanh hốn dịch silicagel vào cột để cho silicagel lắng tự nhên. Bổ sung silicagel liên tục lên cột, chú ý không để cột bị khô hay làm xáo trộn lớp silicagel bề mặt.
Sau khi silicagel chảy được 2 giờ thì bổ sung dung môi đến gần miệng cột.
Đậy nút mài và để yên 12 giờ rồi tiến hành đưa mẫu lên cột.
+ Nạp mẫu lên cột: Hòa mẫu cần phân lập trong dung môi thích hợp, trộn đều với một lượng vừa đủ silicagel, sấy khô rồi tán thành bột tơi xốp.
Cho bột lên cột thật đều, rải thành một lớp mỏng đều đặn. Sau khi lớp bột mang mẫu ổn định, rắc thêm một lớp mỏng silicagel lên bề mặt và lót một lớp bông mỏng lên trên để tránh xáo động mặt cột khi cho dung môi rửa giải lên cột.
24
+ Rửa giải: Phản hấp phụ bằng một hệ dung môi thích hợp, kiểm soát tốc độ dòng chảy, hứng dịch rửa giải vào các bình nón hoặc ống nghiệm thích hợp. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng, gộp các phân đoạn có thành phần tương tự nhau thành những phân đoạn mới.
Tinh chế các chất phân lập:
Sử dụng phương pháp kết tinh lại hoặc rửa nhiều lần bằng dung môi ít hòa tan các chất phân lập.
Kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lâp:
Độ tinh khiết của chất phân lập được kiểm tra bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. Mỗi chất phân lập được kiểm tra bằng nhiều hệ dung môi khác nhau.