Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lậ- 123docz.net

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học

2.2.2.3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được

 Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được dựa trên các dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D-NMR và 2D- NMR) [11], [12] và so sánh dữ liệu phổ của hợp chất phân lập được với dữ liệu phổ có trong thư viện phổ và các tài liệu tham khảo.

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều, phổ proton (1H-NMR hay proton NMR) cho biết môi trường hóa học của proton trong phân tử. Các proton có môi trường hóa học khác nhau sẽ có độ dịch chuyển khác nhau. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C13 (13C-NMR) cung cấp các thông tin về môi trường hóa học của các carbon. Các kỹ thuật xác định số lượng proton trên carbon cho biết số lượng proton liên kết trên mỗi carbon. Nói cách khác các dữ liệu phổ cho biết carbon đó là C, CH, CH2, CH3, gián tiếp cho biết số carbon và hydro trong phân tử. Kỹ thuật thường được sử dụng hiện nay là DEPT. Trong phổ DEPT-135, C bậc IV không xuất hiện, C bậc II là các đỉnh âm, C bậc I và

III là các đỉnh dương. Ở phổ DEPT-90, chỉ có C bậc III là các đỉnh dương trong phổ.

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều: các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều còn cho thêm các thông tin về tương tác giữa C và H gắn trực tiếp trên nó (thường dùng hiện nay là HSQC), giữa proton của các C kế cận (phổ COSY), hay phổ tương tác giữa proton và các carbon kế cận (thường dùng phổ HMBC) hoặc giữa các proton gần nhau trong không gian (NOESY, ROESY).

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và 2 chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) được đo trên máy Brucker AM500 FT-NMR Spectrometer (với TMS là chất chuẩn nội), tại Viện hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2.3. Định lƣợng diosgenin trong thân rễ Rận trâu

Tiến hành định lượng diosgenin trong thân rễ Rận trâu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [2], [20], [24]. Sắc ký lỏng hiệu năng cao còn được gọi là sắc ký lỏng áp suất cao là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng.

Khi phân tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân tách xảy ra ở nhiệt độ thường [2].

Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc:

nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó. Có 4 phương pháp định lượng được sử dụng trong sắc ký: phương pháp chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn nội, phương pháp thêm chuẩn, phương pháp chuẩn hóa diện tích [2].

Định lượng diosgenin trong thân rễ Rận trâu sử dụng phương pháp chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn hóa nhiều điểm. Tiến hành qua các bước sau:

- Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký.

Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn.

- Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn sự tương quan diện tích S (hoặc chiều cao H) pic với nồng độ chất chuẩn.

- Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định. Có thể thực hiện việc tính toán theo hai cách:

+ Áp dữ kiện diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đường chuẩn sẽ suy ra được nồng độ của dung dịch thử.

+ Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao của pic) với nồng độ của chất cần xác định.

Y= a + bCx Trong đó:

Y: diện tích pic

a: giao điểm của đường chuẩn với trục tung b: Độ dốc của đường chuẩn

Cx: Nồng độ của chất thử

Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ của chất thử.

Cx=

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Đặc điểm thực vật và dƣợc liệu

3.1.1. Mô tả đặc điểm thực vật, đặc điểm dƣợc liệu và giám định tên khoa học của cây Rận trâu

- Mô tả đặc điểm thực vật:

Dây leo bằng thân quấn về bên trái; dài 1,5 - 3m, đường kính thân leo 0,25 - 0,35 cm. Thân rễ nạc, nằm ngang, phân nhánh, màu vàng nhạt. Rễ chùm nhiều, cứng. Lá có cuống, mọc so le, cuống dài 2 - 4 cm, gốc cuống lá có cặp gai nhỏ. Phiến lá gồm 3 lá chét, hình thuôn hay elíp nhọn đầu, kích thước 6 - 9 x 2 - 3 cm, mép lá nguyên, lá chét giữa lớn hơn 2 lá bên, gốc 2 lá chét bên gần tròn và hơi lệch; 5 gân chính, gân phụ hơi rõ ở mặt dưới (Hình 3.1.1).

- Giám định tên khoa học:

Qua phân tích các đặc điểm hình thái mẫu cây Rận trâu thu được; kết hợp với việc tra cứu các tài liệu khóa phân loại thuộc chi Dioscorea, căn cứ vào các tài liệu [4], [8], [13], [40], so sánh mẫu tiêu bản thực vật với mẫu tiêu bản thực vật số hiệu P00642258 của phòng Tiêu bản Thực vật – Bảo tàng lịch sử tự nhiên Paris (Phụ lục 1.2) và với sự giúp đỡ của TS. Nguyễn Hoàng, Bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội (Phụ lục 1.3) thấy mẫu Rận trâu thu hái tại Đà Nẵng có các đặc điểm hình thái thực vật giống tới 95%

loài có tên khoa học là Dioscorea dissimulans Prain & Burk. Tuy nhiên có một đặc điểm cần lưu ý đó là cây Rận trâu có cặp gai cong ở gốc cuống lá trong khi loài này chỉ có cặp u nhỏ. Vì vậy quá trình thẩm định chính xác tên khoa học của cây Rận trâu vẫn đang tiếp tục.

Kết luận mẫu cây Rận trâu nghiên cứu là một loài thuộc chi Dioscorea, họ Củ Nâu (Dioscoreaceae).

Hình 3.1.1: Một số đặc điểm hình thái của cây Rận trâu

A. Đoạn thân có lá, B. Cận cảnh đoạn thân, C,D. Cặp gai cong ở gốc cuống lá; E. Cuống lá, F, G. Mặt trên của lá; H. Mặt dưới của lá,

L. Rễ; O, N, M. Thân rễ.

- Mẫu tiêu bản cây Rận trâu đã được lưu tại Phòng tiêu bản cây thuốc, Bộ môn thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội, số hiệu tiêu bản:

HNIP/18151/16 (Phụ lục 1.4).

- Mô tả bộ phận dùng:

Bộ phận dùng là thân rễ đã được sấy khô của cây Rận trâu (Dioscorea sp.), họ Củ nâu (Dioscoreaceae).

Mô tả: Thân rễ không có hình dạng nhất định, thường phân nhánh, chiều dài khoảng từ 6-10 cm, dày khoảng 2-3 cm, tạo thành khối. Ở tận cùng các nhánh có những lớp bần tụ thành từng đám vẩy màu đen; vỏ ngoài có màu vàng nâu hoặc xám, xù xì, lồi lõm, mang rất nhiều rễ con dạng sợi cứng, đường kính vài milimet, dài 8-15 cm, phần sát với thân rễ có vết tích của lớp bần bị bong ra, tạo thành những ống ôm lấy rễ con, rễ con chỉ tồn tại ở những phần thân rễ còn non, ở những phần già rễ con tự rụng đi làm cho bề mặt thân rễ thường nhẵn hơn, có màu vàng nâu rõ hơn. Mặt cắt màu vàng nhạt, chất cứng và dai. Dược liệu cứng và dai, mùi thơm nồng đặc biệt, vị đắng chát.

3.1.2. Hình ảnh, đặc điểm vi phẫu của lá, thân và thân rễ cây Rận trâu 3.1.2.1. Đặc điểm vi phẫu lá

Phần gân lá: mặt trên lồi ít, mặt dưới lồi nhiều. Biểu bì trên (1) là một lớp tế bào tròn, nhỏ, đều đặn xếp thành một hàng. Sát biểu trên là mô dày (2) gồm 1 lớp tế bào hình tròn, thành dày. Bó libe gỗ gân giữa nằm trong vòng mô cứng (3) gồm những mạch gỗ to (4) xếp ngẫu nhiên ở giữa, libe (5) tạo thành những đám nhỏ xếp thành vòng bao quanh các mạch gỗ. Mô dày dưới (6) gồm 4-5 lớp tế bào hình tròn, thành dày xếp thành từng hàng. Biểu bì dưới (7) là 1 lớp tế bào hình tròn xếp thành hàng đều đặn.

Phần phiến lá: biểu bì giống phần gân lá. Mô giậu (8) gồm 1-2 hàng tế bào xếp đứng vuông góc với bề mặt biểu bì. Mô mềm (9) gồm những tế bào khá tròn xếp lộn xộn với nhau (Hình 3.1.2).

1 3 4 7

Hình 3.1.2: Vi phẫu lá Rận trâu

1. Biểu bì trên, 2. Mô dày trên, 3. Vòng mô cứng, 4. Libe, 5.Gỗ, 6. Mô dày dưới, 7.Biểu bì dưới, 8. Mô giậu, 9. Mô mềm.

3.1.2.2. Đặc điểm vi phẫu thân

Đi từ ngoài vào trong, ngoài cùng là lớp biểu bì (1) gồm một hàng tế bào hình gần tròn xếp đều đặn. Mô mềm vỏ (2) gồm 6-8 lớp tế bào hình đa giác hoặc hình trứng dài nằm ngang xếp khá đều đặn thành từng hàng. Nội bì (3) là một lớp tế bào mỏng nằm sát lớp trụ bì hóa mô cứng ở bên trong.

Phần trụ giữa chiếm phần lớn trong toàn bộ cấu tạo thân gồm:

Trụ bì hóa mô cứng (4) gồm 3-5 hàng tế bào thường là hình chữ nhật, xếp thành dãy không đều nhau, các dãy cũng không rõ ràng.

Libe-gỗ: Các bó libe (5), bó gỗ (6) là những bó chồng, những bó này sắp xếp một cách lộn xộn trong mô mềm ruột. Ở ngoài là những bó có thiết diện nhỏ, vào trong các bó libe-gỗ to hơn và nhiều lên. Ở bó libe là những tế bào mảnh, nhỏ, màng mỏng.

Mô mềm ruột: gồm 2 lớp tế bào. Lớp ngoài (7) là những tế bào hình đa giác dài, xếp thành dãy dọc và không theo một trật tự nào, đôi chỗ có thể thấy 8 9

các tế bào xếp thành dãy xuyên tâm khá đều đặn, những tế bào này xếp sát nhau, hầu như không có khoảng gian bào, kích thước khá lớn. Lớp trong (8) gồm những tế bào hình đa giác tròn, sắp xếp lộn xộn, giữa chúng có khoảng gian bào khá nhỏ, các tế bào có màng mỏng (Hình 3.1.3).

1 3 4

Hình 3.1.3. Vi phẫu thân Rận trâu

1. Biểu bì, 2. Mô mềm vỏ, 3. Nội bì, 4. Trụ bì hóa mô cứng, 5. Libe, 6. Gỗ, 7. Mô mềm ruột (lớp ngoài), 8. Mô mềm ruột (lớp trong)

3.1.2.3. Đặc điểm vi phẫu thân rễ.

Đi từ ngoài vào trong ngoài cùng là lớp bần (1) gồm nhiều tế bào hình đa giác xếp lộn xộn. Mô mềm (2) gồm những tế bào hình đa giác hoặc hình trứng, kích thước lớn, xếp lộn xộn, các tế bào mô khuyết (3). Bó sợi (4) xếp rải rác trong mô mềm. Bó libe (5), bó gỗ (6) (Hình 3.1.4).

5 5

1 2 3

5 6

Hình 3.1.4: Vi phẫu thân rễ Rận trâu

1. Bần, 2. Mô mềm, 3. Mô khuyết, 4. Bó sợi, 5. Libe, 6. Gỗ 3.1.3. Đặc điểm bột lá, thân, thân rễ Rận trâu

3.1.3.1. Đặc điểm bột lá

Bột màu xanh đậm, không mùi, không vị. Quan sát dưới kính hiển vi thấy: có nhiều mảnh xoắn (1), bó sợi (2) và tinh thể calxi oxalat hình kim (3) kết lại thành từng bó. Lỗ khí hình hạt đậu (4), nằm riêng lẻ hoặc nằm trong mảnh biểu bì. Mảnh phiến lá (5), mảnh mang màu (6), mảnh biểu bì (7) và các mảnh mô mềm hình đa giác (8) (Hình 3.1.5)

Hình 3.1.5: Một số đặc điểm bột lá Rận trâu

1- Mảnh mạch, 2- Bó sợi, 3- Tinh thể calxi oxalat hình kim, 4- Lỗ khí, 5- Mảnh phiến lá, 6- Mảnh mang màu, 7- Mảnh biểu bì, 8- Mảnh mô mềm 3.1.3.2. Đặc điểm bột thân

Bột thân có màu xanh nhạt, không mùi, không vị. Quan sát dưới kính hiển vi thấy: có nhiều mảnh mạch vạch (1), mảnh mạch điểm (2), bó sợi đứng riêng lẻ (3), tinh thể calxi oxalat hình kim xếp thành từng bó (4), mảnh mang màu (5), mảnh mô mềm hình đa giác (6), mản biểu bì (7), tế bào mô cứng (8) (Hình 3.1.6).

Hình 3.1.6: Một số đặc điểm bột thân Rận Trâu

1-Mảnh mạch mạng, 2-Mảnh mạch điểm, 3-Bó sợi, 4-Tinh thể calxi oxalat hình kim, 5-Mảnh mang màu, 6-Mảnh mô mềm, 7-Mảnh biểu bì,

8-Tế bào mô cứng 3.1.3.3. Đặc điểm bột thân rễ

Bột thân rễ có màu vàng nhạt, lốm đốm nâu, mùi thơm dịu, vị đắng.

Quan sát dưới kính hiển vi thấy: rất nhiều hạt tinh bột đơn (1) hình trứng, rốn hạt chạy dọc hạt, vân đồng tâm. Các mảnh mạch điểm (2), tinh thể calxi oxalat kết thành từng bó (3), mảnh biểu bì (4), mảnh bần (5), sợi và bó sợi (6), mảnh mô mềm mang hạt tinh bột (7) (Hình 3.1.7).

8 4

1 2

Hình 3.1.7: Một số đặc điểm bột thân rễ Rận Trâu

1-Hạt tinh bột, 2- Mảnh mạch, 3-Tinh thể calxi oxalat hình kim, 4-Mảnh biểu bì, 5-Mảnh bần, 6- Sợi và bó sợi, 7- Mảnh mô mềm mang hạt tinh bột 3.2. Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học

3.2.1. Xác định sơ bộ thành phần các nhóm chất có trong dƣợc liệu nghiên cứu

Trong thân rễ Rận trâu sơ bộ có các nhóm chất: Glycosid tim, alcaloid, saponin, flavonoid, đường khử và acid hữu cơ. Kết quả định tính các nhóm chất chính trong thân rễ Rận trâu được tóm tắt trong bảng 3.1

1 2

3 4

Bảng 3.1. Kết quả định tính sơ bộ các chất trong thân rễ Rận trâu.

STT Nhóm

chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận

1 Glycosid tim

Phản ứng Liebermann-Burchardt +++

Có glycosid tim

Phản ứng Baljet +

Phản ứng Legal ++

Phản ứng Keller-kiliani +

2 Flavonoid

Phản ứng Cyanidin ++

Có flavonoid

Phản ứng với kiềm ++

Phản ứng FeCl3 5% ++

3 Alcaloid

Phản ứng với TT. Mayer +

Có alcaloid Phản ứng với TT. Dragendorff +

Phản ứng TT. Bouchardat +

4 Coumarin

Phản ứng mở, đóng vòng Lacton -

Không có coumarin

Phản ứng diazo hóa -

Quan sát hiện tượng huỳnh

quang -

5 Saponin Khả năng tạo bọt +++

Có saponin Hiện tượng phá huyết +++

6 Anthranoid Phản ứng Borntrager - Không có anthranoid 7 Đường khử Phản ứng với TT. Fehling ++ Có đường

khử 8 Acid hữu

cơ Phản ứng vơi tinh thể Na2CO3 ++ Có acid hữu cơ

9 Tanin

Phản ứng FeCl3 5% +

Có tanin Phản ứng chì acetat 10% +

Phản ứng gelatin 1% +

Chú thích: (-) Phản ứng âm tính (++) Phản ứng dương tính rõ (+) Phản ứng dương tính (+++) Phản ứng dương tính rất rõ Nhận xét: Trong thân rễ Rận trâu có saponin, glycosid tim, alcaloid, flavonoid, tanin, đường khử, acid hữa cơ.

3.2.2. Chiết xuất, phân lập các hợp chất saponin có trong thân rễ Rận trâu

3.2.2.1. Chiết xuất

- Thân rễ cây Rận trâu tươi có khối lượng m= 29,50 kg, rửa sạch, bỏ rễ con, thái lát mỏng, đem phơi sấy khô và xay thô còn M= 3,25 kg bột dược liệu thô khô.

- Đo độ ẩm được liệu (x%): lấy khoảng 2g bột dược liệu đo độ ẩm.

Thực hiện lặp lại 3 lần được kết quả độ ẩm dược liệu lần lượt là x1=11.5 %, x2= 10,8; x3=12,0%. Vậy độ ẩm trung bình của dược liệu là x= (x1+x2+x3) : 3= 11,43%.

- Chiết bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng với dung môi cồn 700, thể tích cồn 700 là 10lít/1lần/ 2 ngày x 3 lần. Gộp các dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 600C thu được cắn ethanol toàn phần có khối lượng mcắn ethanol =120,20g. Cắn được phân tán vào 2 lít nước cất nóng rồi chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần lần lượt là: n-hexan (2lx 3 lần), cloroform (2l x 3 lần), ethylacetat (2l x 3 lần), n-butanol (2l x 3 lần) thu được 4 phân đoạn dịch chiết. Các dịch chiết được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến khối lượng không đổi thu được cắn các phân đoạn tương ứng. Quá trình chiết xuất được tiến hành như trong hình 3.2.1.Hiệu suất của cắn 3 phân đoạn so với cắn toàn phần được trình bày trong bảng 3.2.

Bảng 3.2. Hàm lượng cắn các phân đoạn chiết xuất từ thân rễ Rận trâu STT Phân đoạn Khối lượng

cắn (g)

% so với cắn toàn phần (%)

% so với nguyên liệu thô (%)

1 n-hexan 30,24 26,82 1,05

2 Cloroform 12,26 10,20 0,43

3 Ethylacetat 22,45 18,68 0,78

4 n-buthanol 35,89 29,85 1,25

Hình 3.2.1. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ thân rễ Rận trâu 3.2.2.2. Phân lập các hợp chất saponin.

Phân lập các hợp chất từ cắn ethylacetat.

Cắn ethylacetat (22,45 g) được hòa tan với một lượng methanol tối tiểu, thêm lượng silicagel vừa đủ, trộn đều. Sau đó cất loại bỏ dung môi đến khi thu được bột khô tơi mịn. Bột này được đưa lên cột silicagel pha thường (cỡ

Dược liệu (3,25kg)

Cắn EtOH (120,20 g)

Cắn n-hexan (30,24 g)

Chiết với EtOH (10 lít x 3 lần) Cô thu hồi dung môi

Hòa tan trong 2 lít nước nóng Chiết phân đoạn với n-hexan, cloroform, ethyl acetat, n-butanol Cô thu hồi dung môi

Cắn cloroform (12,26 g)

Cắn ethylacetat (22,45 g)

Cắn n-butanol (35,89 g)

hạt 0,040-0,063 mm) đã được chuẩn bị bằng phương pháp nhồi cột ướt, ổn định cột bằng hệ dung môi rửa giải.

Quá trình rửa giải sử dụng hệ dung môi dicloromethane: methanol với độ phân cực tăng dần đến tỷ lệ DCM: MeOH: H2O (5:1:0.1, v/v). Hứng dịch rửa giải vào các bình tam giác và kiểm tra dịch rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng.

Những bình có thành phần như nhau trên sắc ký lớp mỏng được gom chung cất thu hồi dung môi thu được 7 phân đoạn ký hiệu: E1-> E7.

Trên sắc ký pha thường với hệ dung môi DCM: MeOH: H2O (5:1:0.1) thấy phân đoạn E4 có số lượng vết ít nhất, trong đó có hai vết đậm lớn, màu tím hồng, dự kiến là vết saponin.

Triển khai sắc ký bản mỏng pha đảo phân đoạn E4 với hệ dung môi MeOH: H2O (5:1) thấy 2 vết tách rõ. Do đó phân đoạn E4 (1.7g) được hòa tan trong lượng tối thiểu MeOH và được đưa lên cột pha đảo với hệ dung môi rửa giải MeOH:H2O (5:1, v/v). Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm. Kiểm tra dịch rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng. Gom các ống nghiệm có thành phần như nhau trên sắc ký lớp mỏng. Thu được 4 phân đoạn ED1, ED2, ED3, ED4.

Phân đoạn ED2 phát hiện trên sắc ký lớp mỏng pha thường với hệ dung môi DCM:MeOH: H2O (5:1:0.1) và pha đảo với hệ dung môi MeOH:H2O (5:1) vết duy nhất đậm, màu tím hồng. Tinh chế bằng cách để kết tinh qua đêm phân đoạn ED2 thu được hợp chất RT01 (105,20 mg) dạng bột màu trắng.

Phân đoạn ED3 phát hiện trên sắc ký lớp mỏng pha thường với hệ dung môi DCM:MeOH: H2O (5:1:0.1) và pha đảo với hệ dung môi MeOH:H2O (3:1) vết duy nhất đậm, màu tím hồng. . Tinh chế bằng cách để kết tinh qua đêm phân đoan ED2 thu được hợp chất RTO2 (16,15 mg) dạng bột màu trắng.

Sơ đồ phân lập hai hợp chất RT01 và RT02 thể hiện trong hình 3.2.2.