Các phương pháp phân tích thủy phân thu nhận hoạt tính sinh học từ dầu dừa

Dầu dừa dễ dàng được chuyển hóa trong cơ thể một cách nhanh chóng bởi vì nó dễ được hấp thụ và dễ được vận chuyển. Acid béo chính có trong dầu dừa là acid lauric, chiếm khoảng 45 – 53%. Những nghiên cứu chi tiết đã chỉ ra rằng, phần lớn axit lauric khi đưa vào cơ thể sẽ được vận chuyển trực tiếp đến gan, ở đó nó được chuyển hóa trực tiếp thành năng lượng và các chất chuyển hóa khác thay vì được lưu trữ trong chất béo. Sản phẩm chuyển hóa bao gồm các chất hóa học hòa tan trong nước, có thể được sử dụng bởi các mô ngoài gan, chẳng hạn như não và tim, như một thành phần trực tiếp sinh năng lượng. Ngoài giá trị sinh học như nguồn cung cấp năng lượng, lauric acid và monolaurin còn có hoạt tính sinh học đặc biệt đó là khả năng kháng khuẩn. Lauric acid và monolaurin có hoạt tính kháng vi sinh vật cao, đặc biệt là chống lại vi khuẩn gram dương và một số nấm và virus. Ngày nay có rất nhiều sản phẩm thương mại sử dụng acid lauric và monolaurin như tác nhân kháng khuẩn

PHỤ LỤC

I GIỚI THIỆU DẦU DỪA TINH KHIẾT 3

I.1 ĐẶC TÍNH DẦU DỪA VCO 3

I.2 NHỮNG ĐẶC TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA ACID LAURIC VÀ MONOLAURIN 5

I.3.MỘT VÀI CHỨC NĂNG KHÁC CỦA DẦU DỪA TINH KHIẾT 10

II SƠ ĐỒ QUÁ TRÌNH ĐỒNG HÓA 10

II.2.GIẢI THÍCH SƠ ĐỒ: 12

II.2.1 Đồng hóa: 12

II.2.1.1 Đồng hóa bằng áp lực cao: 12

a Cơ sở khoa học: 12

b Thiết bị đồng hóa sử dụng áp lực cao: 12

c Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả đồng hóa 15

II.2.1.2 Đồng hóa cơ học: 16

a Cơ sở khoa học: 16

b Thiết bị: Có cấu tạo khá đơn giản: motor và đầu khuấy mẫu, thiết bị cầm tay thích hợp cho sử dụng trong phòng thử nghiệm, thiết bị có tốc độ khuấy 10.000 – 30.000 vòng/phút 16

II.2.1.3 Các yếu tố chung ảnh hưởng đến kích thước giọt phân tán 17

a Kiểu và nồng độ chất nhủ hóa 17

b Năng lượng cung cấp bởi thiết bị đồng hóa 18

c Thuộc tính của thành phần các pha 18

d Nhiệt độ 19

II.2.1.4 Đánh giá hiệu quả của quá trình đồng hóa 19

II.2.2.Thủy phân: sử dụng enzyme Lipase 20

II.2.2.1 Tổng quan về Enzyme Lipase 20

a Nguồn trích ly enzyme lipase 20

b Cơ chế hoạt động của lipase 23

c Tính đặc hiệu của enzyme 25

II.2.3 Tinh sạch: Sử dụng dung môi hữu cơ n – Hexan để trích ly 26

II.2.3.1 Bản chất của phương pháp trích ly chất béo 26

II.2.4 Phân tích dịch dầu dừa sau thủy phân bằng kỹ thuật sắc ký: 28

II.2.4.1 Giới thiệu phương pháp: 28

a Định nghĩa sắc ký (Chromatography) 28

2

b Phân loại: 28

II.2.4.2 Giới thiệu phương pháp: 30

a Cơ sở lý thuyết chung của phương pháp sắc ký: 30

b Phân tích các axit béo trong dầu dừa bằng sắc ký khí: 34

II.2.5 Thử kháng khuẩn 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

I Giới thiệu dầu dừa tinh khiết

Dầu dừa nguyên chất còn có tên gọi là dầu dừa tinh khiết xuất phát từ phương pháp thu nhận giảm thiểu sự biến đổi của dầu dừa Dầu dừa nguyên chất không màu, trong gần như nước và có hương thơm tự nhiên của dừa, hương thơm này dao động tùy thuộc vào phương pháp công nghệ.

Hình 1.3 Dầu dừa tinh khiết

I.1 Đặc tính dầu dừa VCO

Bảng 3.1: Thành phần hóa học và chỉ số chất lượng của dầu VCO

Thành phần

Các chất dễ bay hơi ở 1200 C (%) Max 0.2

Thành phần không xà phòng hóa (%w/w) Max 0.2 - 0.5

Trọng lượng riêng ở 30 deg./30 deg C 0.915 – 0.920

(Theo APCC, 2010)

Bảng 3.2: Giới hạn kim loại nặng trong dầu dừa VCO

4

(Theo APCC, 2010) I.2 Hoạt tính sinh học của acid lauric và lauryl ester [1]

Dầu dừa dễ dàng được chuyển hóa trong cơ thể một cách nhanh chóng bởi vì nó dễ được hấp thụ và dễ được vận chuyển Acid béo chính có trong dầu dừa là acid lauric, chiếm khoảng 45 – 53%

Những nghiên cứu chi tiết đã chỉ ra rằng, phần lớn axit lauric khi đưa vào cơ thể sẽ được vận chuyển trực tiếp đến gan, ở đó nó được chuyển hóa trực tiếp thành năng lượng

và các chất chuyển hóa khác thay vì được lưu trữ trong chất béo Sản phẩm chuyển hóa bao gồm các chất hóa học hòa tan trong nước, có thể được sử dụng bởi các mô ngoài gan, chẳng hạn như não và tim, như một thành phàn trực tiếp sinh năng lượng Ngoài giá trị sinh học như nguồn cung cấp năng lượng, lauric acid và monolaurin còn có hoạt tính sinh học đặc biệt đó là khả năng kháng khuẩn Lauric acid và monolaurin có hoạt tính kháng visinh vật cao, đặc biệt là chống lại vi khuẩn gram dương và một số nấm và virus Ngày nay

có rất nhiều sản phẩm thương mại sử dụng acid lauric và monolaurin như tác nhân kháng khuẩn Do có sự khác biệt đáng kể về đặc tính của acid lauric so với các axit béo chuỗi dài

có mạch cacbon ≥ C14, nó thường được phân vào nhóm các axit béo chuỗi trung bình bao gồm các axit từ C6 đến C12

Acid Caprylic, C8

Acid Capric, C10

Acid Lauric, C12

I.2 Những đặc tính kháng khuẩn của acid lauric và monolaurin

Nhiều báo cáo đã được công bố về các nghiên cứu đặc tính kháng khuẩn của acid lauric và

monolaurin cả in - vitro và in - vivo Trong số các acid béo bão hòa, acid lauric đã được chứng

minh là rất tích cực kháng lại vi khuẩn gram dương, một số virus và nấm

Các hoạt động kháng khuẩn của acid lauric, monolaurin, và các dẫn xuất ester khác có thể được phân loại theo ba cơ chế chính: (1) phá hủy màng tế bào được bao phủ bởi lipid của vi khuẩn gram dương và virus theo cơ chế hóa lý, (2) xâm nhập vào tế bào làm ảnh hưởng đến các quá trình sinh học, chẳng hạn như việc truyền tín hiệu và phiên mã; (3) Làm mất tính ổn định của màng tế bào

Bảng 1 liệt kê những nghiên cứu đại diện các đặc tính kháng khuẩn của axit lauric và dẫn xuấtcủa nó

Bảng 1: Khả năng kháng khuẩn của acid lauric và các dẫn xuất của nó

K

Staphylococcus aureus, S epidermidis,

beta-hemolytic streptococci (nhóm A

và không thuộc nhóm A), nhóm D liên

cầu, Bacillus subtilis, Sarcina lutea,

Micrococcus sp., Candida albicans,

Nocardia asteroides, Corynebacterium

sp., và phế cầu

Nghiên cứu sàng lọc in-vitro

Trong số các axit béo được thử nghiệm từ C6-C18:

C12 có hoạt động ức chế cao nhấtC18: 2 có hoạt tính ức chế cao hơn C12

Nghiên cứu sàng lọc in - vitro

Trong số các axit béo được thử nghiệm từ C6-C18:

C12 có hoạt động ức chế cao nhấtC18: 2 có hoạt tính ức chế cao hơn C12

Candida và S aureus là kháng nhất trong

Staphylococcus aureus, Candida

C2-C18; C18: 1, C18: 2:

MLG-1 có hoạt tính ức chế cao nhấtMLG-1 hoạt động cao gấp 2 lần MLG-2

[46]

Streptococcus nhóm A, B, F, and G Ứng dụng ở người

MLG hoạt động từ 10-20 mg / mLMLG giảm sản xuất exotoxin, bao gồm cả ngoại độc tố gây sốt và chất phá hủy các tếbào máu, giải phóng hemoglobin

Trong số các axit béo được thử nghiệm:

C4-C17:

chỉ có C12 là axit béo diệt khuẩnMLG là monoglyceride diệt khuẩn tích mạnh nhất

[39], [41]

Staphylococcus aureus MLG ức chế sự biểu hiện của các độc tố

C12 được sản xuất từ quá trình thủy phân MLG cho thấy hoạt động giống hệt như MLG

[45]

Candida albicans Nghiên cứu ứng dụng trên người

Axit béo được thử nghiệm: C8-C14, C16:

1, C18: 1C10 gây ra vụ giết người nhanh nhất và hiệu quả nhất

C12 là tích cực nhất ở nồng độ thấp hơn vàthời gian ủ bệnh lâu hơn

Các monoglycerides tương ứng khác không hoạt động

[42]

Helicobacter pylori Nghiên cứu ứng dụng trên con người

Axit béo được thử nghiệm: C4-C16, C14:

1, C16: 1, C18: 1, C18: 2, C18: 3C12, C18: 2, C18: 3 có hoạt tính diệt khuẩn mạnh Trong số các monoglyceridesthử nghiệm: C12-C16:

MLG và mono myristyl (C14) glycerol có các hoạt động diệt khuẩn mạnh nhất, mạnhgấp 2 lần các axit béo tương ứng;

monopalmitin (C16) glyceride có hoạt động yếu hơn năm lần

[40]

Clostridium perfringens Nghiên cứu sử dụng trong các động vật

Axit béo được thử nghiệm: C8-C14, C18:

1Thứ tự kháng khuẩn: C12> C14> C10>

kháng vi khuẩn của axit béo in – vitro, monoglycerides và diglycerides cho thấy axit lauric

chống lại vi khuẩn gram dương cực nhất [30] và 1-monolaurin hoạt động mạnh hơn acid lauric [31] Acid lauric có tác dụng kháng virus viêm miệng mụn nước, nếu loại bỏ acid lauricthì tác dụng kháng virus này biến mất Ngoài ra, chiều dài chuỗi acid béo bão hòa được chứngminh là rất quan trọng, với chiều dài chuỗi acid béo ngắn hay dài thì hiệu quả kháng virus có hoặc không [32] Tuy nhiên, hoạt tính của axit lauric bị giảm bởi ion Mg2+ và Ca 2+ trong khi

pH thấp thường gia tăng hoạt động của nó Những quan sát cho rằng sự hấp thu của acid lauric được chi phối bởi tính chất hóa lý của cả hai là acid đó và bề mặt tế bào vi khuẩn [33, 34] Đối với việc chăm sóc răng miệng, axit lauric làm giảm sự hình thành các mảng bám và

ức chế việc tan men răng [35]

Bên cạnh hoạt động kháng khuẩn của nó, monolaurin cũng có hiệu quả trong việc ngăn chặn hoặc trì hoãn việc sản xuất ngoại độc tố do vi khuẩn gram dương gây bệnh [36] Cơ chế mà monolaurin ức chế sự tổng hợp của các độc tố tụ cầu và exoprotein khác được thể hiện ở mức

độ phiên mã Hơn nữa, monolaurin có thể ngăn chặn sự cảm ứng của beta-lactamase bằng cách can thiệp truyền tín hiệu [37] Monolaurin ức chế sự biểu hiện độc tính trong

Staphylococcus aureus và kháng sinh trong Enterococcus faecalis Có ý kiến cho rằng,

monolaurin đã hành động bằng cách ngăn chặn việc truyền tín hiệu [38]

Trong số hàng loạt các acid béo và monoglyceride, acid lauric và monolaurin đã được chứng

tỏ là hoạt động mạnh mẽ chống lại Helicobacter pylori [39] Tính nhạy cảm của Candida

albicans đối với một số axit béo và dẫn xuất 1-monoglycerides của chúng cho thấy C10 đã

hoạt động nhanh nhất trong khi C12 là tích cực nhất ở nồng độ thấp hơn và thời gian ủ bệnh lâu hơn Hơn nữa, các axit béo cho thấy không có độc tính đối với da và niêm mạc nên nó lý tưởng để bôi ngoài da [40] So sánh trong số các axit béo bão hòa C10-C18 chống lại sự lây nhiễm virus Junin (JUNV), axit lauric thể hiện là chất ức chế hoạt động nhiều nhất Từ những nghiên cứu cơ học, kết luận rằng axit lauric ức chế một giai đoạn trưởng thành muộn trong chu trình nhân lên của JUNV [41]

Cơ chế tác động của axit lauric và các dẫn xuất của nó, bao gồm monolaurin, đã thu hút sự

quan tâm đáng kể Sự truyền tải hình ảnh bằng kính hiển vi điện tử của Clostridium

perfringens khi nó đã được điều trị bằng acid lauric cho thấy việc tách màng bên trong và bên

ngoài và sự vô tổ chức của tế bào chất của tế bào Một lần nữa, acid lauric được tìm thấy là các axit béo bão hòa tích cực nhất trong series C8-C14 [42] Trong một nghiên cứu so sánh giữa các chuỗi carbon bão hòa với các nhóm cation, anion và phi anion, Kabara kết luận rằng,nhóm cation (ví dụ, với nhóm amoni) là hoạt động nhiều hơn anion và phi ion và độ dài chuỗitối ưu là 10-16 nguyên tử carbon Tuy nhiên, độc tính của nhóm cation cao hơn so với nhóm

anion [43] Các monoglyceride không chứa ion đã thể hiện được hoạt động, đặc biệt là khi cácnhóm este là lauryl [44].

I.3.Một vài chức năng khác của dầu dừa tinh khiết

Dầu dừa chứa một sự kết hợp độc đáo của các axit béo có dược tính mạnh mẽ, đặc biệt đối với trẻ sơ sinh chưa có khả năng nhai hoặc nuốt

Hầu hết các axit béo trong thực phẩm là các axit béo chuỗi dài, trong khi các axit béo chuỗi trung bình trong dầu dừa được chuyển hóa theo những cách khác nhau Axit béo này có thể

đi thẳng vào gan qua đường tiêu hóa, nơi nó trở thành một nguồn năng lượng và biến thành Keton: Điều quan trọng nhất là nó có thể có tác dụng điều trị rối loạn về não

như Cerebral Palsy, Bệnh động kinh và bệnh Alzheimer Là một loại thực phẩm, nó có thể cung cấp đủ dinh dưỡng cho trẻ em khó khăn trong ăn uống, nhai hoặc nuốt

Axit Lauric trong dầu dừa có thể tăng cường chức năng não ở trẻ: Một số nghiên cứu cho thấy rằng các axit béo chuỗi trung bình trong dầu dừa có thể làm tăng nồng độ Ketone trong máu của cơ thể, cung cấp năng lượng cho các mô não cũng như tăng cường trí nhớ (khả năng hồi tưởng của não trong bệnh suy giảm trí nhớ)

Tinh sạch

Do khe hẹp có cấu tạo với tiết diện giảm dần, tốc độ chuyển động của hệ nhũ tương sẽ tiếp tục tăng cao khi chãy qua khe hẹp Giá trị cao nhất của tốc độ dòng sẽ phụ thuộc chủ yếu vào

áp lực bơm hệ nhũ tương đến khe hẹp

Người ta giải thích cơ chế của phương pháp đồng hóa áp lực theo nguyên lý chảy rối và nguyên lý xâm thực khí

Nguyên lý chảy rối: khi hệ nhũ tương được bơm với tốc độ cao đến khe hẹp Nhiều dòng chảy rối với các vi lốc xoáy xuất hiện Tốc độ bơm càng lớn thì số dòng chảy rối xuất hiện sẽ càng nhiều và kích thước của các vi lốc xoáy càng nhỏ Chúng sẽ va đập vào các hạt của pha phân tán và làm cho các hạt này vỡ ra Dựa vào nguyên lý này ta có thể giải thích được ảnh hưởng của áp lực đồng hóa đến hiệu quả của quá trình

Nguyên lý xâm thực khí: hệ nhũ tương được bơm với tốc độ cao đến khe hẹp với tốc độ cao

sẽ làm xuất hiện các bong bóng hơi trong hệ Chúng sẽ va đập vào các hạt của pha phân tán và làm vỡ hạt Theo nguyên lý này sự đồng hóa diễn ra khi hệ nhũ tương rời khỏi khe hẹp, do đó đối áp giữ vai trò quan trọng và sẽ làm ảnh hưởng đến hiệu quả quá trình đồng hóa Các kết quảnghiên cứu thực nghiệm đã khặng định điều này Tuy nhiên, sự đồng hóa vẫn có thể diển ra mà không cần có sự xuất hiện các bong bóng hơi nhưng hiệu quả của quá trình sẽ thấp hơn

Ngoài ra, do cấu tạo của thiết bị khi thoát khỏi khe hẹp, các hạt phân tán sẽ tiếp tục đập vào một bề mặt cứng Hiện tượng này cũng góp phần làm vỡ và giảm kích thước của hạt

b Thiết bị đồng hóa sử dụng áp lực cao:

Thiết bị đồng hóa sử dụng áp lực cao gồm có 2 hệ thống chính: bơm cao áp và hệ thống tạo đối áp

Bơm piston cao áp được vận hành bởi động cơ điện (1) thông qua một trục quay (4) và bộ truyện động (2) để chuyển đổi chuyển động quay của động cơ thành chuyển động tịnh tiến của piston Các piston (5) chuyển động trong xilanh ở áp suất cao

Đầu tiên, mẫu nguyên liệu sẽ được đưa vào thiết bị đồng hóa bởi một piston Bơm sẽ tăng áp lực cho hệ nhũ tương từ 3 bar lên đến 100-250 bar hoặc cao hơn tại đầu vào của khe hẹp(5) Người ta sẽ tạo một đối áp lên hệ nhũ tương bằng cách hiệu chỉnh khoảng cách khe hẹp trong thiết bị giữa bộ phận sinh lực(1) và bộ phận tao khe hẹp (3) Đối áp này được duy trì bởi một

Thử kháng khuẩn

bơm thủy lực sử dụng dầu Khi đó, áp suất đồng hóa sẽ cân bằng với áp suất dầu tác động lên bơm thủy lực.

Vòng đập (2) được gắn với bộ phận tạo khe hẹp (3) sao cho mặt trong của vòng đập vuông góc với lối thoát ra của hệ nhũ tương khi rời khỏi khe hẹp Như vậy, một số hạt phân tán sẽ tiếptục va vào vòng đập (2) bị vỡ ra và giãm kích thước Bộ phận tạo khe hẹp (3) được chế tạo với góc nghiêng trung bình 50 trên bề mặt để gia tốc hệ nhũ tương theo hướng vào khe hẹp và tránh

sự ăn mòn các chi tiết có liên quan Thông thường, người ta chọn khe hẹp có chiều rộng khoảng

100 lần lớn hơn đường kính hạt phân tán Đi ngang qua khe hẹp, tốc độ chuyển động của hệ nhũ tương có thể tăng lên 100-400 m/s và quá trình đồng hóa chỉ diển ra trong khoảng 10-15 giây Trong suốt thời gian này, toàn bộ năng lượng áp suất được cung cấp từ piston sẽ được chuyển hóa thành động năng Một phần năng lượng này sẽ được chuyển thành áp suất để đẩy

hệ nhũ tương đi tiếp sau khi rời khỏi khe hẹp Một phần khác được thoát ra dưới dạng nhiệt năng Theo tính toán, chỉ có 1% năng lượng được sử dụng cho mục đích phá vỡ các hạt phân tán

Hình 1 Thiết bị đồng hóa sử dụng áp lực cao Bao gồm: (1) motor chính, (2) bộ phận

truyền đai, (3) đồng hồ đo áp suất,(4) trục quay,(5) piston, (6) hộp piston, (7) bơm, (8) van, (9) bộ phận đồng hóa, (10) hệ thống tạo áp suất thủy lực

c

12

Hình 2 các bộ phận chính trong thiết bị đồng hóa áp suất cao

Bao gồm: (1) bộ phận sinh lực thuộc hệ thống tạo đối áp, (2) vòng đập,

(3)bộ phận tạo khe hẹp,(4) hệ thống thủy lực tạo đối áp, (5) khe hẹp

c Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả đồng hóa

Tỷ lệ phần trăm giữa pha phân tán và tổng thể nhũ tương: Nếu thể tích pha phân tán chỉ chiếm một phần nhỏ so với thể tích của toàn bộ hệ nhũ tương thì quá trình đồng hóa sẽ thực hiện dễ dàng và hệ nhũ tương sẽ có độ bền cao

Nhiệt độ: Nhiệt độ mẫu càng thấp thì quá trình đồng hóa càng kém hiệu quả do một số chất béochuyển sang pha rắn Ngược lại, nếu nhiệt độ quá cao, chi phí năng lượng cho quá trình sẽ gia tăng Hơn nữa, các phản ứng hóa học không cần thiết sẽ ảnh hưởng đến chất lượng nhũ tương nên chọn nhiệt độ thích hợp cho quá trình

Lưu ý rang khi nhiệt độ gia tăng thì độ nhớt của hệ nhũ tương sẽ giảm, các phân tử sẽ chuyển động nhanh hơn, sức căng bề mặt sẽ giảm và nhờ đó, hệ nhũ tương sẽ dể tạo thành và ổn định hơn

Áp suất: áp suất đồng hóa càng lớn, hiện tượng chảy rối và hiện tượng xâm thực khí càng dễ xuất hiện, như thế các hạt phân tán được tạo thành có kích thước nhỏ và hệ nhũ tương có độ bền cao

Chất nhũ hóa: cần phải chon chất nhũ hóa thích hợp cho từng loại nhũ tương, chất nhủ hóa ảnh hưởng đến kích thước giọt phân tán và độ bền của hệ nhũ tương

II.2.1.2 Đồng hóa cơ học:

a Cơ sở khoa học:

Trong quá trình hoạt động, các hạt của phân tán va đập vào cánh khuấy và bị giảm kích thước đồng thời sự quay nhanh của cánh khuấy làm xuất hiện gradient vận tốc theo chiều dọc, quay vòng và xuyên tâm đi trong lòng nhũ tương làm nhũ tương được trộn lẩn và bị chia nhỏ làm các hạt bé hơn Tuy nhiên, hiệu quả đồng hóa không cao khi sử dụng phươngpháp này Phương pháp này dùng để đồng hóa sơ bộ hệ nhũ tương trước khi chuyển vào đồng hóa bằng các phương pháp khác

b Thiết bị: Có cấu tạo khá đơn giản: motor và đầu khuấy mẫu, thiết bị cầm tay thích hợp cho

sử dụng trong phòng thử nghiệm, thiết bị có tốc độ khuấy 10.000 – 30.000 vòng/phút

14

II.2.1.3 Các yếu tố chung ảnh hưởng đến kích thước giọt phân tán

a Kiểu và nồng độ chất nhủ hóa

Với một nồng độ cố định của pha dầu và nước, chất nhủ hóa thì ở đây sẽ có một diện tích cựcđại ở bề mặt pha dầu nước Trong quá trình đồng hóa kích thước giọt phân tán sẽ giảm và diện tích tiếp xúc giữa 2 pha dầu và nước sẽ được tăng Nếu những giọt phân tán thiếu chất nhũ hóa

để phủ hoàn toàn và bề mặt của chúng thì các giọt phân tán có xu hướng kết hợp với các giọt

kế bên, kích thước bền vững nhỏ nhất của các giọt phân tán có thể được tính theo lý thuyết trong quá trình đồng hóa ( giả thuyết ở đây là chỉ có một pha phân tán) phụ thuộc vào kiểu và nồng độ chất nhũ hóa:

Trong đó гsat là nồng độ quá bảo hòa của chất nhủ hóa(kg/m2), ϕ là phần thể tích của pha phântán, Cs là nồng độ của chất nhủ hóa trong trong hệ nhũ tương (kg/m3), Cs’ là nồng độ của chất

nhũ hóa trong pha phân tán (kg/m3)

Phương trình trên chỉ cho ta biết kích thước nhỏ nhất của hạt phân tán có thể giảm bớt bằng cách tăng nồng độ chất nhũ hóa, giảm bớt nồng độ của các hạt phân tán trong hệ nhũ tương hayviệc sử dụng chất nhũ hóa với nồng độ nhỏ hơn nồng độ quá bảo hòa của chúng

Kiểu nồng độ chất nhũ hóa ảnh hưởng đến kích thước giọt phân tán phụ thuộc vào tốc độ hấpphụ, làm giảm lực căng mặt ngoài, màng bảo vệ các giọt phân tán chống lịa sự kết tụ

Sự ảnh hưởng của của nồng độ chất nhũ hóa được chia làm 2 khoảng nồng độ khác nhau:

- Thiếu chất nhũ hóa: khi nồng độ chất nhũ hóa có một giá trị nào đó thì kích thước giọt phân tán điều chỉnh chủ yếu bởi nồng độ chất nhủ hóa hơn là năng lượng thêm vào của thiết bị đồng hóa

- Dư chất nhũ hóa: ngược với trường hợp trên khi nồng độ chất nhũ hóa dư( dư thừa để phân bố tại bề mặt liên pha) thì kích thước giọt phân tán phụ thuộc chủ yếu vào năng lượng thêm vào trong quá trình đồng hóa Dưới điều kiện này, kích thước trung bình của giọt phân tán phụ thuộc vào loại dòng chảy được tạo ra trong quá trình đồng hóa

b Năng lượng cung cấp bởi thiết bị đồng hóa

Xét trường hợp nồng độ chất nhũ hóa đủ để phân bố tại bề mặt liên pha( đủ để bao quanh các giọt phân tán)

Kích thước giọt phân tán có thể giảm bằng cách tăng cường độ năng lượng hay khoảng thời gian

mà năng lượng được thêm vào đủ dài để phá vở các giọt phân tán Pham vi cung cấp năng lượng này phụ thuộc vào thiết bị và hiệu quả của năng lượng này để phá vở các giọt phân tán phụ thuộcvào loại thiết bị đồng hóa sử dụng Năng lương cung cấp có thể tăng hay giãm bằng một số cách phụ thuộc vào bản chất của thiết bị đồng hóa

Tuy nhiên, dưới một điều kiện đồng hóa nhất định ( năng lượng thêm vào, thành phần nhũ tương,nhiệt độ) thì kích thước giọt phân tán không thể giãm bớt hơn khi tăng số lần của nhũ tương qua thiết bị đồng hóa

c Thuộc tính của thành phần các pha

Cấu tạo, thành phần các pha dầu và nước đều ảnh hưởng đến kích thước giọt phân tán trong suốt quá trình đồng hóa

Các kiểu pha dầu hay pha nước đều làm thay đổi tỉ lệ độ nhớt pha phân tán/ độ nhớt pha liên tục

Tỉ lệ này chỉ rỏ kích thước nhỏ nhất đạt được của các hạt phân tán trong quá trình đồng hóa.Các pha dầu khác nhau sẽ có lực căng mặt ngoài khác nhau tại bề mặt tieps xúc với pha nước Thành phần của pha dầu có chứa nhiều chất như acid béo tự do, monoacylglycerols hoặc

diacylglycerols, ảnh hưởng đến sức căng mặt ngoài của chúng, từ đó ảnh hưởng đến năng lượng cần cung cấp để phá vở các giọt phân tán

Pha của nước có nhiều chất như: khoáng, acid, base, biopolymer, đường ethanol, bọt khí…các thành phần này sẽ ảnh hưởng đến kích thước giọt phân tán trong suốt quá trình đồng hóa Vì chúng sẽ ảnh hưởng đến tính lưu biến, lực căng mặt ngoài, trạng thái ổn định hay kết tụ, hay động học của sự hấp phụ Chẳng hạn: khi có mặt của ethanol thì kích thước giọt phân tán được giãm bớt làm giãm lực căng mặt ngoài Sự có mặt của biopolymer sẻ làm tăng kích thước giọt phân tán vì chúng có khả năng ngăn cản hình thành các xoáy nước trong dòng chảy hỗn loạn

16

d Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng đến kích thước của giọt phân tán bằng một số cách ảnh hưởng lớn nhất là tỉ

lệ độ nhớt pha phân tán/ độ nhớt pha liên tục Khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dầu giảm nhanh

so với nước từ đó ảnh hưởng đến tỉ lệ trên

Khi nhiệt độ tăng thì sức căng bề mặt ngoài cũng giảm nên hiệu quả đồng hóa sẽ cao hơn nên kích thước hạt phân tán đạt được là nhỏ Tuy nhiên, cần lưu ý là nhiệt độ tăng thì hiệu quả của một số chất nhũ hóa sẽ giảm hoạt tính Ví dụ: đối với các chất bề mặt phân tử nhỏ thì khả năng chống lại kết tụ sẽ giảm khi tăng nhiệt độ Vì chúng sẻ có thể được tập hợp lại khi nhiệt độ đến gần nhiệt độ chuyển đổi pha Đối với protein hình cầu chúng sẽ giải thoát màng bảo vệ các hạt phân tán và kết hợp lại với nhau khi nhiệt độ vượt qua một giá trị tới hạn nào đó Nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến độ hấp phụ của chất hoạt động bề mặt

II.2.1.4 Đánh giá hiệu quả của quá trình đồng hóa

Hiệu quả của quá trình đồng hóa được đánh giá theo tốc độ phân lớp của 2 pha dầu và nước trong hệ nhũ tương hoặc theo đường cong phân bố kích thước các hạt thuộc pha phân tán trong

hệ Sau đây là một số phương pháp đánh giá hiệu quả của quá trình đồn hóa

Phương pháp xác định tốc độ phân lớp 2 pha dầu nước trong hệ nhũ tương:

- Phương pháp cổ điển:lấy một ít mẫu bảo quản ở 4-60C trong 2 ngày, xác định hàm lượng béo trong 100ml trên cùng với 900ml ở phần còn lại của mẫu Lập tỉ lệ hàm lượng béo này Nếu tỉ lệ < 0,9 là đạt yêu cầu Nhược điểm của phương pháp này là thờigian dài, mẫu phải được vô trùng

- Phương pháp nizo: hiện nay phương pháp này được sử dụng phổ biến Xét trường hợp

hệ nhũ tươn dầu trong nước Lấy 25ml mẫu đem ly tâm với tốc độ 1000v/phút, trong thời gian 30 phút ở 400C Bán kính vòng quay là 250mm Tách 20ml mẫu thu được ở phần đáy ống ly tâm để xác định hàm lượng béo Tỷ lệ % giữa giữa khối lượng chất béo trong 20ml đáy ống ly tâm và khối lượng chất béo trong 25ml ban đầu gọi là tỷ số nizo

Phương pháp xác định đường cong phan bố theo kích thước của hạt thuộc pha phân tán trong hệ nhũ tương: sử dụng phương pháp nhiễu xạ laser

- Nguyên tác của phương pháp này là chiếu chum tia laser di qua mẫu đựng trong cuver Phụ thuộc vào kích thước và số lượng các hạt phân tán trong mẫu mà ánh sang sẻ bị phát tán với mức độ khác nhau và sẽ được các đầu dò ghi lại kết quả

Kết quả được biểu hiện dưới dạng đường con phân bố theo kích thước của hạt thuộc pha phân tán trong hệ nhũ tương

Hình Phân tích kích thước của pha phân tán trong hệ nhũ

tương bằng phương pháp nhiễu xạ laser.

II.2.2.Thủy phân: sử dụng enzyme Lipase

II.2.2.1 Tổng quan về Enzyme Lipase

a Nguồn trích ly enzyme lipase

Enzyme Lypase (EC 3.1.1.3) là enzyme quan trọng liên quan đến việc tiêu hóa chất béo trong động vật có xương sống, bằng cách chuyển triacylglycerol không tan trong nước thành các sản phẩm hòa tan trong nước, các acid béo và monoacylglycerol mà dễ dàng được tiêu hóa bởi cơ thể Quá trình phân giải lipid được thực hiện bởi enzyme lypase có trong dạ dày, nó thủy phân chất béo trong khẩu phần ăn hàng ngày thành các acid béo và các

diacylglycerol, diacylglycerol tiếp tục được chuyển hóa bởi enzyme lypase từ tuyến tụy trong ruột thành các acid béo và monoacylglycerol Hầu hết enzyme lypase có pH tối ưu là môi trường kiềm, duy chỉ có lypase được phân lập từ tuyến lưỡi hoặc mô dạ dày có pH tối ưu là môi trường acid [1]

Enzyme lipase được thu nhận từ 3 nguồn khác nhau:

- Từ động vật: Enzyme lipase được thu nhận từ mô dạ dày còn sống của con bê, cừu, con

người và mô tuyến tụy của động vật dưới dạng dịch chiết [1] Lipase tuyến tụy được tiết ra ở

tá tràng, xúc tác cho sự thủy phân triacylglycerol thành acid béo và glycerol Enzyme lipase trích ly từ tuyến tụy của con lợn là 1 chuỗi glycoprotein gồm 450 amino acid, có khối lượng phân tử 50,084 dalton, có 6 cầu nối disulfide là Cys4-Cys10, Cys91-Cys102, Cys238-Cys262,Cys286-297, Cys300-Cys305, Cys434-450 và 2 cystein tự do là Cys104 và Cys182 [2,3]

18

Loại enzyme này có gắn đường tại vị trí N (N – glycosyl) ở Ans 167 Vùng glycosyl hóa ở vị trí Ans 167 – Gly 168 – Thr 169 trong lợn cũng được tìm thấy ở người, ở chó Cấu trúc glycancủa lypase tuyến tụy ở lợn đã được giải mã Trái với lypase tuyến tụy ở người, lợn và chó, lypase trích ly từ ngựa, bò và cừu thì không glycosyl hóa [10].

- Từ thực vật: lipase từ thực vật chủ yếu thu nhận từ những hạt có dầu Trong hạt có dầu

nẩy mầm, các acid béo được dự trữ để cung cấp năng lượng và nguồn C cho sự phát triển của phôi Enzyme thủy phân lipid xúc tác bước đầu tiên trong việc huy động chất béo, trong và sau giai đoạn nảy mầm (Quettier và Eastmond, 2009; Borgston e Brockman, 1984) Một số loại thực vật được nghiên cứu trích ly enzyme lipase: đậu (Enujiugha et al., 2004), hạt hướng dương (Sagiroglu and Arabaci, 2005; Sadeghipour and Bhatla, 2003), hạt lanh (Sammour, 2005), đậu phộng (Huang and Moriau, 1978), hạt bông (Rakhimov et al., 1970) Lipase từ đậuhoạt động ở pH gần trung tính, nhiệt độ 30oC, đặc hiệu với acid mạch ngắn và trung bình

Enujiugha et al (2004) nghiên cứu enzyme lipase trích ly từ hạt đậu phi (Pentaclethra

macrophylla Benth) hoạt động tốt với các loại dầu chứa acid béo mạch ngắn, đặc biệt là dầu

dừa, nhiệt độ tối thích là 30oC, pH gần trung tính, có xúc tác Ca2+ Loại enzyme này bị ức chế bởi EDTA, NaCl và HgCl2 Sagiroglu and Arabaci (2005) nghiên cứu lipase trích ly từ hạt hoa

hướng dương (Heliantus annuus L.) có phân tử lượng 22kDa, pI = 8.0, Km là 1,33mM, Vmax

là 555U/mg, pH kiềm, nhiệt độ 35 – 50oC

- Từ vi sinh vật:

+ Vi khuẩn: Pseudomonas spp, Achromobacter spp, Staphylococcus spp

+ Nấm men: Torulopsis spp, Candida spp

+ Nấm mốc: Aspergillus spp, Mucor spp, Rhizopus spp, Penicillium spp, Geotrichum spp

Nhìn chung, enzyme lypase được thu nhận từ việc lên men có kiểm soát vi sinh vật được quan tâm và sản xuất nhiều nhất theo qui mô công nghiệp dưới dạng bột hay dung dịch [9]

-Enzyme lipase trích ly từ vi sinh vật: Mốc Rhizomucor miehei (Mucor miehei) sản sinh

enzyme lypase ngoại bào mà thủy phân nhiều loại cơ chất lipid trong động vật, thực vật Loại enzyme này được sinh tổng hợp dưới dạng tiền chất chứa 1 đoạn peptide tín hiệu và 1

propeptide, nó chứa 269 amino acid, phân tử lượng 29,472 dalton [4] Dịch chiết lipase được tinh sạch thành 2 dạng đồng phân có điểm đẳng điện lần lượt là pI = 3.9 (dạng A); pI = 4.3 (dạngB), phụ thuộc vào mức độ deglycosyl hóa trong quá trình dịch mã[12] Loại enzyme này cũng giống như lipase từ tuyến tụy, là protein dạng α/β, vùng lưới β trung tâm có 8 dải β liên kết song song cuộn lên trên vùng xoắn lưỡng cực [19, 20] Tất cả cấu trúc xoắn đều nằm 1 bên lưới β, 3 liên kết disulfide Cys29 – Cys268, Cys40 – Cys43, Cys235 – Cys244 có tác dụng làm cho toàn

bộ cấu trúc enzyme ổn định Trung tâm hoạt động chứa bộ 3 xúc tác Ser144, His257, Asp203 nhưng bị che phủ bởi phần không phân cực của cấu trúc xoắn lưỡng cực “lid” Khi enzyme

lipase hấp phụ trên bề mặt phân chia dầu – nước, “lid” cuộn vào bên trong để lộ vùng trung tâm hoạt động tiếp xúc với cơ chất

Hình 2.1: Candida rugosa lipase (PDBid: 1trh)

Lipase được sinh tổng hợp từ Geotrichum candidum cũng tồn tại 2 dạng đồng phân, loại I

(PI = 4.56) và loại II (PI = 4.46) [13] Cả 2 dạng đồng phân này đều chứa 544 acid amin, khối lượng phân tử 59,085 dalton, có lần lượt từ 2 đến 3 vị trí N – glycosyl hóa [14] Tuy nhiên enzyme lipase dạng I và II hơn 84% được mã hóa bởi 2 đoạn gen khác nhau [15, 16] Cấu trúc của enzyme có dạng α/β với lưới hỗn hợp β hình thành bởi 11 dải, trong đó có 7 dải song song nhau [17, 18] Những cấu trúc cuộn xoắn kết nối với các dải đều nằm ở 2 bên lưới β Hai liên kết disulfide được tìm thấy là Cys61 – Cys105, Cys276 – Cys288 Trong vùng hoạt động có bộ 3 xúc tác Ser271 – His463 – Glu354 bị che khuất bởi 2 cấu trúc xoắn α gần như song song với nhau

Nấm men Candida rugosa sản sinh enzyme lipase ngoại bào tồn tại ở nhiều dạng, có 5

giá trị pI tương ứng là lipase I (pI = 4.5), II (pI = 4.9), III (pI = 5.1), IV (pI = 5.7), và V (pI = 5.5) [21, 22] Tất cả chúng đều có phân tử lượng là 57kDa và 534 amino acid

Một số cấu trúc phân tử enzyme lipase thu nhận từ Candida rugosa [ 2 3 ] , C

antarctica[24], Rhizopus delmar [ 25], Pseudomonas glumae [26], Ps.aeruginosa [27]

cũng được nghiên cứu Tuy nhiên, sự khác biệt quan trọng về cấu trúc giữa lipase tuyến tụy và lipase từ vi sinh vật chính là đầu C được dùng để liên kết với colipase

20