Các phương pháp phân tích dịch lên men GABA từ bột hạt bụt giấm

GABA (gamma amino butyric acid), là một amino acid phi protein có 4 carbon, được tìm thấy trong các loài vi khuẩn đơn giản đến cây trồng và ở ngay cả động vật có vú. GABA được phát hiện trong cây từ hơn nửa thế kỷ trước. Tuy nhiên vai trò của nó ở trong thế giới thực vật vẫn chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ, nhưng trong thế giới động vật thì các nhà khoa học đã tìm ra được vai trò của GABA: là một chất dẫn truyền thần kinh ức chế quan trọng nhất trong não bộ, ức chế sự dẫn truyền thần kinh gây kích thích, có rất nhiều hoạt tính sinh học như giảm stress, chống oxy hóa, giảm thiểu nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch và thần kinh. Ở vi khuẩn và thực vật GABA đóng vai trò trao đổi chất trong chu trình Krebs, còn ở động vật có xương sống nó đóng vai trò như một máy phát tín hiệu thần kinh mạnh.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO MÔN HỌC

CÁC PP PHÂN TÍCH TRONG NGHIÊN CỨU THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI:

LÊN MEN THU NHẬN GABA TỪ BỘT HẠT BỤP GIẤM

GVHD: TS Phan Ngọc Hòa

HVTT: Nhóm 3

MỤC LỤC

O

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Công thức cấu tạo của GABA

Hình 2 Chu trình chuyển hóa GABA

Hình 3 Các trạng thái biến đổi của phân tử vật chất khi tương tác với bức xạ…………21

Hình 4 Sơ đồ biến đổi Raman……… Hình 5 Sơ đồ cấu tạo của laser Nd-YAG

Hình 6 Cấu hình tán xạ 900 và 1800

Hình 7 Sơ đồ máy đơn sắc đơn

Hình 8 Sơ đồ chuyển năng lượng trong khuếch đại Raman

Hình 9 Cấu trúc bộ khuếch đại Raman

Hình 10 Sơ đồ máy quang phổ Raman

Hình 11 Phân vùng bức xạ ánh sáng theo bước sóng

Hình 12 Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ UV-Vis Hình 13 Bước sóng hấp thu cực đại của các nhóm chức hữu cơ Hình 14 Mô hình đường chuẩn để định lượng Hình 15 Nguyên lý hoạt động của HPLC

Hình 16 Sắc ký đồ của một số hợp chất

Hình 17 Cấu tạo hệ thống HPLC DANH MỤC BẢNG Bảng 2 Thành phần hóa học của hạt bụp giấm (Hainida và cộng sự, 2008)………

Bảng 3 Thành phần amino acid trong hạt bụp giấm (El-Adawy, 1994)………

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU VỀ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU

1.1 Giới thiệu về GABA

GABA (gamma amino butyric acid), là một amino acid phi protein có 4 carbon, được tìm thấy trong các loài vi khuẩn đơn giản đến cây trồng và ở ngay cả động vật có

vú GABA được phát hiện trong cây từ hơn nửa thế kỷ trước Tuy nhiên vai trò của nó ở trong thế giới thực vật vẫn chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ, nhưng trong thế giới động vật thì các nhà khoa học đã tìm ra được vai trò của GABA: là một chất dẫn truyền

thần kinh ức chế quan trọng nhất trong não bộ, ức chế sự dẫn truyền thần kinh gây kíchthích, có rất nhiều hoạt tính sinh học như giảm stress, chống oxy hóa, giảm thiểu nguy cơmắc các bệnh về tim mạch và thần kinh Ở vi khuẩn và thực vật GABA đóng vai trò traođổi chất trong chu trình Krebs, còn ở động vật có xương sống nó đóng vai trò như mộtmáy phát tín hiệu thần kinh mạnh.

Hình 1 Công thức cấu tạo của GABA

GABA chủ yếu được hình thành bằng phản ứng α–decarboxylation không nghịchđảo của acid L–glutamic hoặc muối của nó, được xúc tác bởi enzyme glutamic acid

decarboxylase (GAD) Enzyme này được tìm thấy ở vi khuẩn như Lactobacillus (Bertoldi

và cộng sự, 1999), Escherichia (Rice và cộng sự, 1993), Streptococcus, Aspergillus (Kato

và cộng sự, 2002) và Neurospora (Kubicek và cộng sự, 1979); ở trong thực vật như trà

(Zhao và cộng sự, 2011), cà chua (Yoshimura và cộng sự, 2010), đậu nành (Serraj vàcộng sự, 1998), gạo lứt nảy mầm (Daixin và cộng sự, 2008); và trong não của động vật có

vú (Nathan và cộng sự, 1994) Tuy nhiên vi khuẩn Lactobacillus và nấm men là hai loại

phổ biến nhất để sản xuất GABA Ngoài ra, GABA còn được tìm thấy ở côn trùng nhưgián, châu chấu, sâu bướm và ong mật (Anthony và cộng sự, 1993)

1.2 Các chức năng sinh lý quan trọng của GABA

Ngày nay GABA được nghiên cứu nhiều do nó có hoạt tính sinh học mạnh, cónhiều chức năng sinh lý và nhiều tác động tích cực có lợi cho sức khỏe con người

Bảng 1 Các chức năng sinh lý của GABA (Diana và cộng sự, 2014)

Bệnh tâm thần

Tăng cường trí nhớLàm giảm các rối loạn tâm trạngTác dụng thư giãn

Làm giảm triệu chứng mất ngủGiảm phiền muộn

Phòng ngừa và điều trị các chứng nghiện rượuCác cơ quan quan trọng

Bảo vệ và chống lại bệnh thận mãn tínhKích hoạt chức năng gan

Cải thiện chức năng thị giácTăng tốc độ tổng hợp protein trong não

Bảo vệ và phòng chống ung thư Làm chậm và ức chế tế bào ung thư tăng sinhKích thích các tế bào ung thư tự hủy diệt

Ức chế các khối u

Điều chỉnh tế bào Chống viêm và tăng sinh tế bào nguyên bào sợiTổng hợp acid hyaluronic

Nâng cao hiệu suất của các nguyên bào sợi da

Hệ hô hấp Kiểm soát bệnh suyễnKiểm soát đường hô hấp

Điều chỉnh nội tiết tố

Tăng hormone tăng trưởngKiểm soát bài tiết hormoneKiểm soát progesteroneKiểm soát hormone tuyến giápNgăn ngừa béo phì

1.3 Cơ chế hình thành GABA

Trong cây và trong động vật, GABA được hình thành qua 3 enzyme: enzymeglutamate decarboxylase (GAD), enzyme GABA transaminase (GABA–T) và enzymesuccinic seminaldehyde dehydrogenase (SSADH)

Hình 2 Chu trình chuyển hóa GABA

Bảng 3 Thành phần amino acid trong hạt bụp giấm (El-Adawy, 1994)

Amino acid Hàm lượng (%)

• Tạo điều kiện tối ưu để ngũ cốc nảy mầm

• Lên men đậu tương, đậu xanh, cám gạo… bằng vi sinh vật

Trong đó, quá trình sản xuất GABA bằng lên men vi sinh vật (vi khuẩn

Lacobacillus, nấm men) đang được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả cao trên thế giới

Đề tài “Khảo sát điều kiện lên men chuyển hóa acid glutamic thành GABA từ hạt

bụp giấm bằng Lactobacillus Plantarum” với mong muốn khảo sát những điều kiện tối

ưu để sản xuất GABA từ nguyên liệu, xem xét tiềm năng để sản xuất GABA từ bột hạt

bụp giấm bằng vi khuẩn Lactobacillus Plantarum Đồng thời khảo sát cho khà năng sản

xuất GABA với giá thành thấp hơn từ bột hạt bụp giấm

CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SỬ DỤNG

2.1 Các phương pháp xác định thành phần hóa học của hạt bụp giấm

2.1.1 Xác định độ ẩm

 Phương pháp: Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy tới khối lượng không đổi.

 Nguyên tắc: Dùng không khí nóng làm bay hơi nước trong nguyên liệu, từ chênh

lệch khối lượng của mẫu trước và sau khi sấy tính được độ ẩm của nguyên liệu

 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị:

• Dụng cụ: Chén sấy có nắp, đũa thủy tinh, bình hút ẩm

• Thiết bị: Cân phân tích 4 số lẻ, tủ sấy điều chỉnh được nhiệt độ

 Tiến hành:

Bước 1: Chuẩn bị thiết bị, dụng cụ

• Bật tủ sấy, cài đặt nhiệt độ 100 – 105 °C

• Rửa sạch, sấy khô và làm nguội chén sấy trong bình hút ẩm

• Cân khối lượng chén sấy: mo (g)

• Tiếp tục sấy đến khi khối lượng chén không đổi (chênh lệch khối lượng giữa hailần cân liên tiếp không quá 0.0005 g)

Bước 2: Chuẩn bị mẫu

• Cân 5 – 10 g mẫu (đã được xay nghiền) chính xác đến 0.0001 g vào chén sấy

• Cân khối lượng chén sấy đã có mẫu: m1 (g)

Bước 3: Tiến hành sấy

• Cho chén sấy chứa mẫu vào tủ sấy ở 100 – 105 °C trong 2 giờ

• Làm nguội trong bình hút ẩm trong 30 phút rồi cân

• Tiếp tục sấy đến khi khối lượng mẫu không đổi (chênh lệch khối lượng giữa hailần cân liên tiếp không lớn hơn 0.0005 g)

• Thời gian sấy mỗi lần tiếp theo là 30 phút

• Cân mẫu khi kết thúc quá trình sấy: m2 (g)

m m

Trong đó:

m0: khối lượng chén sấy (g)

m1: khối lượng chén sấy và mẫu trước khi sấy (g)

m2: khối lượng chén sấy và mẫu sau khi sấy (g)Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 3 kết quả thử song song, tính chính xácđến 0.1% Chênh lệch kết quả giữa 3 lần thử không được lớn hơn 0.3%

2.1.2 Xác định hàm lượng tro

 Phương pháp: Vô cơ hóa mẫu.

 Nguyên tắc: Tro hóa mẫu bằng nhiệt sau đó xác định hàm lượng tro bằng phương

pháp khối lượng

 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị:

• Dụng cụ: Chén nung thạch anh hoặc sứ, bình hút ẩm

• Thiết bị: Cân phân tích 4 số lẻ, tủ sấy, lò nung điều chỉnh được nhiệt độ từ 500 –

600 °C

 Tiến hành:

Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị

Rửa sạch chén nung bằng nước sạch, sấy trong tủ sấy 105 °C trong 30 phút sau đónung trong lò nung ở 525 ± 25 °C trong 30 phút Làm nguội trong bình hút ẩm trong 30phút và cân chính xác đến 0.0001 g Quá trình nung được lập lại cho đến khi khối lượngchén không đổi (chênh lệch giữa hai lần cân không quá 0.0005 g)

Bước 2: Chuẩn bị mẫu

• Cân 10 – 20 g mẫu với độ chính xác 0,0001 g và cho vào chén nung đã chuẩn bị

• Cân khối lượng chén nung đã chứa mẫu

• Sấy trong tủ sây ở nhiệt độ 105 °C đến khô ( khoảng 2 – 3 giờ)

• Đốt cẩn thận trên bếp điện đến than hóa

Bước 3: Tiến hành nung

• Nung ở nhiệt độ 525 ± 25 °C cho đến khi thu được tro màu trắng ngà (khi có mặtsắt sẽ có màu đỏ gạch, khi có mặt đồng và mangan sẽ có màu xanh nhạt)

• Làm nguội trong bình hút ẩm Quá trình nung được lặp lại cho đến khi chén nung

có khối lượng không đổi (chênh lệch giữa hai lần cân không lớn hơn 0.0005 g)

m m

Trong đó: m0: khối lượng chén nung (g)

m1: khối lượng chén nung và mẫu trước khi nung (g)

m2: khối lượng chén nung và mẫu sau khi nung (g)Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 3 kết quả thử song song, tính chính xácđến 0.01% Chênh lệch kết quả giữa 3 lần thử không được lớn hơn 0.02%

2.1.3 Xác định hàm lượng Nitơ tổng bằng phương pháp Kjeldalh

 Nguyên tắc

Mẫu được vô cơ hoá bằng H2SO4đđ ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác Các phảnứng của quá trình vô cơ hoá mẫu xảy ra như sau:

Các nguyên tố khoáng khác như P, K, Ca, Mg,…chuyển thành dạng oxit: P2O5,

K2O, CaO, MgO…tuy tồn tại trong dung dịch mẫu nhưng không ảnh hưởng đến kết quảphân tích

Đuổi amoniac ra khỏi dung dịch bằng NaOH

(NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + H2O + 2NH3

NH3 bay ra cùng với nước sang bình hứng Bình hứng có chứa H3BO3 do đó

NH3 bay ra sẽ tác dụng ngay với H3BO3 theo phản ứng:

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

• Sấy mẫu ở 80oC cho đến khi đạt trọng lượng không đổi

Bước 2: Vô cơ hoá mẫu

• Cân 0,3 – 1 g mẫu khô đã được nghiền mịn

• Cho mẫu vào tận đáy của ống Kjeldahl (chu ý không để dính trên thành ống)

• Cho 5g hỗn hợp xúc tác K2SO4 và CuSO4 theo tỉ lệ 10:1

• Dùng pipet hút 15ml H2SO4 đậm đặc (d=1,84) cho vào ống vô cơ hoá mẫu có chứahỗn hợp trên

• Lắp ống trên vào hệ thống vô cơ hoá mẫu

• Việc vô cơ hoá mẫu hoàn toàn khi toàn bộ dung dịch trong ống vô cơ hoá mẫu cómàu xanh trong suốt

Bước 3: Chưng cất mẫu

• Lắp ống vô cơ hoá mẫu vào bộ chưng cất, lắp bình hứng chứa 10-60ml H3BO3 4%

và 7 giọt dung dịch chỉ thị màu

Thông qua số ml HCl 0,25N, người ta biết được số lượng axit boric kết hợp với

NH3, từ đó biết lượng NH3 giải phóng từ mẫu

Dựa vào phản ứng màu của protein với thuốc thử Folin Cường độ màu của dung

dịch tỷ lệ thuận với nồng độ protein Tính hàm lượng protein của mẫu nghiên cứu dựa vào đường chuẩn của protein với thuốc thử Folin

Phản ứng gồm 2 bước:

• Cu2+ tạo phức với các liên kết peptide trong protein ở pH kiềm

• Phức hợp protein-Cu2+ sẽ xúc tác cho phản ứng oxy hóa các nhóm phenol có trongtyrosine hay trytophan bằng thuốc thử Folin-phenol: (Na2MoO4 + Na2WO4 +

H3PO4 trong phenol) tạo phức hợp có màu xanh dương đậm hấp thụ ánh sáng ởbước sóng 750nm

 Tiến hành:

dung dịch Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N

• Dung dịch 2: Dung dịch Folin có nồng độ 1N

Cho dung dịch 1 vào dung dịch protein nghiên cứu, tiếp tục cho thêm dung dịch 2,

đo trên máy so màu ở bước sóng 750nm

Lập đường chuẩn protein với các giá trị OD theo nồng độ, từ đó xác định đượchàm lượng protein trong mẫu

2.1.5 Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet.

 Nguyên tắc:

Dùng dung môi kỵ nước trích ly hoàn toàn lipid từ nguyên liệu đã được nghiềnnhỏ Một số thành phần hòa tan trong chất béo cũng được trích ly theo bao gồm sắc tố,các vitamin tan trong chất béo, các chất mùi,… Tuy nhiên hàm lượng của chúng thấp Do

có lẫn tạp chất, phần trích ly được gọi là lipid tổng Hàm lượng lipid tổng được tính bằngcách cân trực tiếp lượng dầu sau khi chưng cất loại sạch dung môi hoặc tính gián tiếp từkhối lượng bã còn lại

 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị:

• Hóa chất: Dung môi trích ly diethyl ether

• Dụng cụ, thiết bị: Bộ soxhlet (bình cầu, trụ chiết, ống sinh hàn), tủ sấy, cân phântích, bình hút ẩm, bếp điện

 Tiến hành:

Sấy khô nguyên liệu đến khối lượng không đổi, cân chính xác 5 g mẫu đã đượcnghiền nhỏ, cho vào bao giấy đã được sấy khô và biết khối lượng Chú ý gói phải có bềrộng nhỏ hơn đường kính ống trụ, chiều dài ngắn hơn chiều cao ống chảy tràn Đặt bao

giấy vào trụ chiết, lắp trụ chiết vào bình cầu và gắn ống sinh hàn Qua đầu ống sinh hàndùng phễu cho dung môi vào trụ chiết sao cho một lượng dung môi đã chảy xuống bìnhcầu và một lượng trên trụ chiết còn đủ ngập mẫu Dùng bông làm nút đầu ống sinh hàn.

Mở nước lạnh vào ống sinh hàn Mở bếp điện và bắt đầu trích ly lipid Thực hiện trong 8– 12 giờ cho đến khi trích ly hoàn toàn hết chất béo

• Thử bằng cách lấy vài giọt ether ở cuối ống xiphong nhỏ lên giấy lọc, dung môibay hơi không để lại vết dầu loang thì kết thúc

• Cho ether chảy xuống hết bình cầu Lấy bao giấy ra đặt dưới tủ hút cho bay hơi ởnhiệt độ thường rồi cho vào tủ sấy, sấy ở 100 – 105 °C trong 1.5 giờ, để nguộitrong bình hút ẩm, cân xác định khối lượng

Trong đó: m1: khối lượng bao giấy và mẫu ban đầu (g)

m2: khối lượng bao giấy và mẫu sau khi trích ly lipid và sấy khô (g) m: khối lượng mẫu ban đầu (g)

2.1.6 Xác định hàm lượng đường khử bằng Ferrycyanure

 Nguyên tắc: Ferrycyanure K3Fe(CN)6 ban đầu màu vàng chanh, khi phản ứng vớiđường khử thu được ferrocyanure có màu vàng rơm Dựa vào phản ứng này ta cóthể suy ra lượng đường khử có mặt trong dung dịch cần xác định Việc chuẩn độđược tiến hành trong môi trường kiềm NaOH, khi đun nóng với chỉ thị methyleneblue

 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị:

• Hóa chất: K3Fe(CN)6 1%, Glucose 0,5% (w/v), NaOH 5%; NaOH 2.5 N, HCl5%, CCl3COOH 10%, methylen red 1%, methylen blue 0.04%

• Dụng cụ, thiết bị: Bếp điện, kẹp, lưới amiang, nồi cách thủy, phễu, ống đong, bìnhđịnh mức, becher, erlen, burette, pipette.

 Tiến hành:

Bước 1: Xử lý nguyên liệu

Cân 5 – 10g mẫu Kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch CCl3COOH 10%,sau đó trung hòa bằng dung dịch NaOH 5% với chỉ thị methylen red (màu đỏ chuyểnsang vàng) Thêm nước cất tới vạch định mức, lọc qua giấy lọc vào cốc hay bình khô,nước qua lọc là dung dịch mang đi định lượng

Bước 2: Định lượng đường khử

Dung dịch mẫu sau khi thu được cho vào burete và chuẩn độ với 10 ml K3Fe(CN)6

và 2.5 ml dung dịch NaOH 2.5N Đun sôi và chuẩn độ ngay trên bếp Dung dịch ban đầu

có màu vàng chanh của ferrycyanure, điểm dừng chuẩn độ xác định khi màu vàng chanhbiến mất, dung dịch trong suốt không màu trong 30 giây và chuyển sang màu vàng rơmrất nhạt của ferrocyanure Trong trường hợp khó nhận biết điểm chuyển màu có thể kiểmtra điểm kết thúc bằng cách nhỏ một giọt chỉ thị methylen blue khi đó giọt đường thừađầu tiên sẽ làm mất màu xanh

Bước 3: Định lượng glucose chuẩn 0.5%

Tiến hành thí nghiệm tương tự với dung dịch đường chuẩn là dung dịch glucose0.5% Thay lượng đường khử trên burette bằng dung dịch glucose chuẩn 0.5% và chuẩn

độ tương tự như định lượng đường khử

 Tính kết quả:

Hàm lượng đường khử được tính bằng phần trăm theo công thức:

m V

V V X

.0

Trong đó:

Xk: hàm lượng đường khử (%)

Vg: thể tích dung dịch glucose 0.5% dùng chuẩn độ (ml)

Vk: thể tích dung dịch đường khử dùng chuẩn độ (ml)V: thể tích bình định mức (ml)

m: lượng mẫu thí nghiệm (g)

2.2 Phát hiện GABA trong mẫu bằng phổ tán xạ Raman

2.2.1 Giới thiệu về phương pháp quang phổ

 Khái niệm: Cơ sở của phương pháp phổ là quá trình tương tác của các bức xạ điện

từ đối với các phân tử vật chất Khi tương tác với các bức xạ điện từ, các phân tử

có cấu trúc khác nhau sẽ hấp thụ và phát xạ năng lượng khác nhau Kết quả của sựhấp thụ và phát xạ năng lượng này chính là phổ, từ phổ chúng ta có thể xác địnhngược lại cấu trúc phân tử hoặc định lượng các chất cần nghiên cứu

 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

 Phương pháp phổ khối lượng

 Sự tương tác của bức xạ điện từ với phân tử vật chất

 Bức xạ điện từ: là dạng năng lượng truyền đi trong không gian Bức xạ

điện từ có bản chất sóng và hạt Bản chất sóng thể hiện qua bước sóng (λ),chu kỳ (T), tần số (ν) , số sóng (σ) , vận tốc truyền sóng, sự giao thoa Bảnchất hạt đặc trưng bởi các quang tử (photon) mang năng lượng E

• Bước sóng λ : khoảng cách giữa hai đầu mút của một sóng Những

bức xạ điện từ khác nhau có độ dài bước sóng khác nhau Bước sóngđược coi là đại lượng đặc trưng cho mỗi sóng Chiều dài bước sóngđược đo bằng các đơn vị độ dài: m, cm, nm, A0 …

• Tốc độ truyền sóng c hay tốc độ ánh sáng, c=300km/s

• Tần số ν Hz): là số lần bước sóng truyền qua một điểm trong không

gian trong một đơn vị thời gian ν = c/ λ

• Chu kỳ T (s): thời gian ngắn nhất truyền một bước sóng qua một

điểm trong không gian T=1/ ν

• Số sóng σ (cm -1 ) : là đại lượng nghịch đảo của bước sóng, để đo

chiều dài của bước sóng trong quang phổ, σ =1/ λ

• Năng lượng sóng: Các bức xạ điện từ cũng mang năng lượng, các

bức xạ có chiều dài buớc sóng càng nhỏ thì năng lượng của chúng

càng lớn và tuân theo định luật E = h ν = h.c/ λ Trong đó: h là hằng

số planck h = 6,6262.10-34 J.s Năng lượng E được đo bằng đơn vị

eV, kcal/mol, cal/mol

 Năng lượng của phân tử vật chất:

E = Eđt + Edđ + EqEđt: năng lượng điện tửEdđ: năng lượng do dao động tương tác giữa các nguyên tử trong phân tửEq: năng lượng do sự quay của phân tử xung quanh trục của nó

Khi các bức xạ điện từ tương tác với các phân tử vật chất, có thể xảy ra theo haikhả năng: trạng thái năng lượng của phân tử thay đổi hoặc không thay đổi Khi có sự thayđổi năng lượng thì phân tử có thể hấp thụ (phổ hấp thụ) hoặc bức xạ năng lượng (phổ

phát xạ) Nếu gọi trạng thái năng lượng ban đầu của phân tử là E1, sau khi tương tác vớibức xạ điện từ là E2 ∆E là năng lượng biến thiên của phân tử vật chất sau tương tác

∆E = 0: năng lượng phân tử không thay đổi khi tương tác với bức xạ diện từ ∆E >0: phân tử hấp thụ năng lượng; ∆E < 0: phân tử bức xạ năng lượng

Khi các phân tử hấp thụ năng lượng từ bên ngoài có thể dẫn đến các quá trình thayđổi trong phân tử (quay, dao động, kích thích electron phân tử…) hoặc trong nguyên tử(cộng hưởng spin electron, cộng hưởng từ hạt nhân)

Hình 3 Các trạng thái biến đổi của phân tử vật chất khi tương tác với bức xạ

Mỗi một quá trình như vậy đều dòi hỏi một năng lượng ∆E > 0 nhất định đặc trưngcho nó, nghĩa là đòi hỏi bức xạ điện từ có một tần số riêng gọi là tần số quay νq , tần sốdao dộng νdđ và tần số kích thích diện từ νđt Vì thế khi chiếu một chùm bức xạ điện từvới các tần số khác nhau vào phân tử thì các phân tử chỉ hấp thụ được các bức xạ điện từ

có tần số đúng bằng các tần số tạo nên các quá trình biến đổi trong phân tử Sự hấp thụchọn lọc này là đặc trưng cho các phân tử khác nhau, do đó khi chiếu chùm bức xạ điện

từ với một dải tần số khác nhau đi qua môi trường vật chất thì sau khi đi qua, chùm bức

xạ này sẽ bị mất đi một số bức xạ có tần số xác định nghĩa là các tia này đã bị phân tửhấp thụ

2.2.2 Giới thiệu về quang phổ Raman

Ánh sáng bao gồm các photon mang năng lượng xác định bằng E = h ν = h.c/ λ

trong đó h là hằng số Plank còn ν là tần số các photon của ánh sáng

Khi ánh sáng truyền qua môi trường vật chất thì phần lớn ánh sáng truyền thẳng vàmột phần nhỏ bị tán xạ Dựa vào tần số ánh sáng tán xạ sau khi chiếu nguồn ánh sáng lênmẫu, người ta chia ra nhiều loại tán xạ khác nhau: tán xạ Rayleigh (tần số ν không đổi),tán xạ Raman (ν thay đổi), do đó chỉ có tán xạ Raman là hữu ích trong nghiên cứu đặcđiểm phân tử vật chất.

Quang phổ Raman là một kỹ thuật quang phổ dựa trên sự tán xạ không đàn hồicủa ánh sáng đơn sắc thường được phát từ một nguồn laser, khi ta chiếu nguồn sáng vàomẫu phân tích Tán xạ không đàn hồi là hiện tượng tần số của các photon trong ánh sángđơn sắc bị thay đổi khi tương tác với mẫu Các photon của ánh sáng laser được mẫu hấpthụ rồi sau đó lại được phát xạ lại Tần số của các photon phát xạ lại bị thay đổi tăng hoặcgiảm so với tần số ánh sáng đơn sắc ban đầu, được gọi là hiệu ứng Raman Sự thay đổinày cho biết thông tin về sự dao động, xoay vòng và các thay đổi tần số thấp khác trongphân tử Quang phổ Raman có thể được sử dụng để nghiên cứu các mẫu khí, lỏng và rắn Hiệu ứng Raman dựa trên sự biến dạng của phân tử trong điện trường E được xácđịnh bởi khả năng phân cực α (hệ số phân cực) của phân tử Chùm sáng laser có thể đượccoi là một sóng điện từ dao động với vector điện E Khi tương tác với mẫu nó sẽ giảmmomen lưỡng cực điện P = αE và làm biến dạng phân tử Do hiện tượng biến dạng theochu kỳ, phân tử sẽ bắt đầu dao động với tần số đặc trưng νm.

Biên độ dao động được gọi là chuyển vị hạt nhân Nói một cách khác, ánh sánglaser đơn sắc với tần số ν0 kích thích các phân tử và chuyển chúng thành các lưỡng cựcdao động Các lưỡng cực dao động này phát ra ánh sáng ở 3 bước sóng khác nhau:

 Một phân tử không có chế độ hoạt động Raman hấp thụ một photon với tần

số ν0 Phân tử được kích thích sẽ trở lại trạng thái dao động cơ bản ban đầu

và phát xạ ánh sáng với cùng tần số ν0 như nguồn kích thích Loại tương tácnày được gọi là tán xạ Rayleigh đàn hồi

 Một photon có tần số ν0 được hấp thụ bởi một phân tử hoạt động Ramanđang ở trạng thái dao động cơ sở tại thời điểm diễn ra tương tác Một phầnnăng lượng của photon được truyền sang trạng thái hoạt động Raman νm và

kết quả là tần số của ánh sáng tán xạ giảm đi thành (ν0 – νm) Tần số Ramannày được gọi là tần số Stokes.

 Một photon có tần số ν0 được hấp thụ bởi một phân tử hoạt động Raman đã

ở trạng thái dao động kích thích tại thời điểm tương tác Năng lượng thừacủa chế độ hoạt động Raman kích thích được giải phóng, phân tử quay trởlại trạng thái dao động cơ sở ban đầu và kết quả là tần số của ánh sáng tán

xạ tăng thành (ν0 + νm) Tần số Raman này được gọi là tần số Phản Stokes(Anti-Stokes)

Khoảng 99,999% các photon tới trong Raman tự phát trải qua tán xạ Rayleigh đànhồi Loại tín hiệu này không sử dụng được cho mục đích mô tả đặc điểm phân tử Chỉkhoảng 0,001% ánh sáng tới tạo ra tín hiệu Raman không đàn hồi với tần số (ν0 ± νm).Tán xạ Raman tự phát rất yếu và phải có phương pháp đặc biệt để phân biệt nó với tán xạchiếm ưu thế Rayleigh Các thiết bị như bộ lọc khấc bỏ dải, bộ lọc điều chỉnh được, khechặn laser, các hệ thống quang phổ kế đôi hoặc ba được sử dụng để làm giảm tán xạRayleigh và thu nhận các phổ Raman chất lượng cao

Hình 4 Sơ đồ biến đổi Raman 2.2.3 Cấu tạo, nguyên lý hoạt động của thiết bị quang phổ Raman

 Cấu tạo của thiết bị quang phổ Raman gồm 5 bộ phận chính:

• Nguồn ánh sáng kích thích (Tia laser)

• Hệ thống chiếu sáng mẫu và hệ thống quang thu ánh sáng tán xạ

• Bộ chọn bước sóng (bộ lọc nhiễu, máy đơn sắc)

• Đầu dò (đầu dò chuỗi diode quang, CCD hoặc PMT)

• Bộ phận khuếch đại và thiết bị hiển thị tín hiệu Raman

 Nguồn ánh sáng kích thích

Một mẫu thường được chiếu sáng bởi một chùm laser trong vùng tử ngoại (UV),khả kiến (Vis) hoặc cận hồng ngoại (NIR) Có các loại laser sau:

• Laser khí liên tục: hoạt chất sử dụng là các khí phát bức xạ ở các bước

sóng đặc trưng: Argon (351,1 – 514,5 nm), Krypton (337,4 – 676,4 nm),

Heli-Neon (632,8 nm) Trong đó thường dùng nhất là Argon với hai vạchphát xạ mạnh tại bước sóng 514 và 488 nm.

• Laser màu: được dùng để mở rộng bước sóng tăng cường hiệu ứng Raman.

Gồm các loại: laser được bơm bằng laser khí liên tục, laser được bơm bằnglaser xung và laser được bơm bằng đèn Flash Các hoạt chất màu được bổsung vào nguồn phát laser Việc lựa chọn hợp lý chất màu, dung môi sẽđiều chỉnh bước sóng laser phát ra, cho đến nay có khoảng 200 chất màukhác nhau được sử dụng làm hoạt chất laser màu, dải bước sóng của nhữngchất màu này trong miền 300-1300nm

• Laser rắn: Nd-YAG phát ra bức xạ ở bước sóng 1064 nm, làm việc ở dạng

sóng liên tục, hoạt chất sử dụng là Y3Al5O12 , có bổ sung 2-5% Neodym(Nd) Đây là loại laser cho ra bức xạ đều, dẫn nhiệt và chịu nhiệt tốt, độ bền

cơ học cao, thời gian phục vụ cao Có thể phát liên tục tới 100W hoặc phátxung với tần số 1000-10000Hz

• Laser diode: thường sử dụng dạng laser xung, có nhiều bước sóng phát xạ

hơn các loại laser trên, nhưng hay dùng nhất là ở bước sóng 976, 830, và785nm

Các Laser khí có bước sóng ngắn dễ gây ra hiện tượng nhiễu do phát xạ huỳnhquang của mẫu và gây phân hủy mẫu do năng lượng ánh sáng Các Laser rắn Nd-YAG,laser diode có bước sóng dài, có thể hoạt động ở công suất cao mà không gây phân hủymẫu và loại bỏ hoặc giảm đáng kể hiện tượng phát xạ huỳnh quang gây nhiễu

Laser là nguồn kích thích lí tưởng cho phổ Raman do các đặc tính sau:

• Công suất lớn, các vạch đơn của laser liên tục có thể dễ dàng đạt công suất

1 - 2W, còn laser xung có thể cung cấp dòng điện cực đại lên đến 10-100W

• Chùm laser có độ đơn sắc cao ( ví dụ: độ rộng của laser Ar là 0,1cm-1)

• Chùm tia laser thì có bán kính nhỏ (1-2mm) và có thể giảm xuống còn0,1mm bằng cách sử dụng hệ thấu kính đơn giản Do đó, toàn bộ thônglượng bức xạ của nguồn kích thích có thể hội tụ lên mẫu kích thước nhỏ, rấtthuận lợi trong việc nghiên cứu các chất lỏng có thể tích rất bé (cỡ µl) và

các tinh thể (cỡ 1mm3) Trong quang phổ micro-Raman người ta có thểnghiên cứu các mẫu nhỏ có bán kính cỡ 2 µm.

• Chùm tia laser thì hầu như là phân cực hoàn toàn, do đó nó rất lý tưởng cho việc đo tỷ số phân cực

• Có thể tạo những chùm laser có khoảng thay đổi bước sóng rộng bằng cách

sử dụng laser màu và các thiết bị khác

Hình 5 Sơ đồ cấu tạo của laser Nd-YAG

 Hệ thống chiếu sáng mẫu và thu ánh sáng tán xạ

Do tán xạ Raman rất yếu nên chùm laser phải được hội tụ chính xác vào mẫu vật

và bức xạ tán xạ phải thu nhận một cách hiệu quả nhất

Việc hội tụ chùm laser vào mẫu vật có thể thực hiện một cách dễ dàng bởi đườngkính của chùm laser rất nhỏ (cỡ 1mm), ngoài ra có thể sử dụng các thấu kính để tăng khảnăng hội tụ ánh sáng laser vào mẫu

Sự kích thích và thu nhận bức xạ tán xạ từ mẫu vật có thể được thực hiện theo mộtvài cấu hình quang học khác nhau như cấu hình bố trí cho tán xạ với góc 900và với góc

1800 Cấu hình tán xạ ngược1800 được sử dụng phổ biến nhất vì các ưu diểm sau:

• Tránh được hiện tượng hấp thu ở các mẫu dung dịch màu

• Có thể đo tán xạ Raman và hấp thu trong vùng UV – khả kiến một cáchđồng thời.

• Có thể thu được phổ Raman đơn tinh thể của các tinh thể nhỏ mà chỉ cầnmột mặt tốt trên tinh thể cho mỗi hướng

• Có thể thu được phổ ở nhiệt độ thấp với mẫu rất nhỏ

• Tuy nhiên tán xạ ngược cũzng có những hạn chế, chẳng hạn tiếng ồn do sựtán xạ Raman của bản thân thủy tinh của lớp bọc hay cuvét chứa mẫu

Hình 6 Cấu hình tán xạ 90 0 và 180 0

Ngoài sự bố trí cấu hình quang học như trên, người ta cũng có thể sử dụng một hệthấu kính tiêu sắc để thu bức xạ tán xạ Raman gồm: một thấu kính dùng để thu bức xạ vàmột thấu kính dùng để hội tụ bức xạ Khả năng hội tụ ánh sáng được đặc trưng bởi hệ số

F = f/D Trong đó f: là tiêu cự của thấu kính, D: là đường kính của thấu kính F càng nhỏthì khả năng hội tụ càng lớn Giá trị của F phải phù hợp với bộ đơn sắc để thu nhận đượclượng ánh sáng nhiều nhất và tận dụng được hết khả năng của hệ cách tử trong bộ đơnsắc

Trong quang phổ Raman hiện đại ngày nay để chùm laser hội tụ vào mẫu mộtcách chính xác người ta sử dụng một cơ cấu chỉnh vi cấp 3 chiều để điều khiển vị

trí của mẫu vật Chúng ta vừa chỉnh vị trí mẫu vừa quan sát tín hiệu Raman để chọn vị trítối ưu nhất (tín hiệu lớn nhất)

hơn nhiều so với cường độ của tín hiệu Raman khả dụng ở khoảng rất gần với bước sónglaser Để khắc phục vấn để gây nhiễu cho tín hiệu Raman người ta sử dụng các phươngpháp sau:

• Sử dụng bộ lọc nhiễu: trong nhiều trường hợp, vấn đề ánh sáng lạc được

giải quyết một cách đơn giản bằng cách cắt đi dải phổ gần với vạch laser làvùng ánh sáng lạc có ảnh hưởng lớn nhất Người ta sử dụng bộ lọc nhiễu(ví dụ bộ lọc Notch Filter) để cắt dải phố ± 80-120 cm-1 từ vạch laser.Phương pháp này hiệu quả trong việc loại bỏ ánh sáng lạc nhưng không chophép đo được các chế độ Raman tần số thấp trong khoảng dưới 100 cm-1

• Sử dụng máy đơn sắc đôi, máy đơn sắc ba: đây là phương pháp phổ biến

nhất để thu nhận tín hiệu Raman không bị nhiễu Máy đơn sắc sẽ giúp lựachọn bước sóng của ánh sáng tán xạ Raman, loại bỏ ánh sáng gây nhiễu

Hình 7 Sơ đồ máy đơn sắc đơn

Cấu tạo và nguyên lý hoạt động máy đơn sắc đơn (hình 7):

Ở vị trí D là cách tử, C , E là các gương phản xạ Bức xạ sau khi đi qua khe vào B(input) sẽ đến gương rồi đến cách tử D, chùm bức xạ sẽ bị tách ra các thành phần đơnsắc Các ánh sáng đơn sắc sẽ được chỉnh hướng bởi gương E và đi ra ngoài qua khe ngõ

ra F (output) Thông thường người ta kết hợp một môtơ bước để làm quay cách tử, việcđiều chỉnh góc quay của cách tử cho ta thu được bước sóng ở ngõ ra theo ý muốn

Trong máy đơn sắc đơn khó có thể loại trừ hết ánh sáng không bị nhiễu xạ mà tán

xạ trên bề mặt cách tử

Máy đơn sắc đôi:

Ánh sáng tán xạ Raman thường yếu nên sẽ bị ánh sáng nhiễu này che lấp Để giảiquyết vấn đề này người ta dùng máy đơn sắc đôi

Trong hệ đơn sắc đôi người ta ghép nối tiếp hai hệ đơn sắc giống hệt nhau, phổ lối

ra của máy đơn sắc thứ nhất được tán sắc lần nữa bởi máy đơn sắc thứ hai Việc ghép nốitiếp giúp tăng quang trình, việc tán sắc trên 2 cách tử sẽ tăng độ phân giải Về lý thuyếtnếu loại trừ được quang sai, hệ đơn sắc đôi cho độ tán sắc gấp hai lần hệ đơn Đồng thờivới cách bố trí thích hợp ta có thể hạn chế ánh sáng nhiễu

Máy đơn sắc ba:

Máy đơn sắc ba có khả năng khử ánh sáng nhiễu mạnh hơn máy đơn sắc đôi Nócho phép quan sát được các dải Raman gần sát vạch Rayleigh

• Sử dụng cách tử holographic:

Ánh sáng lạc phát sinh từ quang phổ kế chủ yếu do tán xạ ánh sáng trên cách tử vàphụ thuộc rất nhiều vào chất lượng cách tử Đặc thù của quang phổ kế Raman là sử dụngcách tử holographic (tạo thành bằng cách chiếu 2 chùm tia lazer giống nhau từ 1 gócthích hợp lên bề mặt thủy tinh có tẩm chất cản quang), có các rãnh đồng đều về hình dáng

và kích thước, có độ sai khác khi sản xuất ít hơn nhiều so với cách tử dòng Ánh sáng lạctạo bởi cách tử holographic có cường độ thấp hơn so với ánh sáng lạc phát sinh từ cách tửdòng với cùng mật độ rãnh

• Sử dụng tán xạ nhiều cấp:

Là một cách khác để giảm ảnh hưởng của ánh sáng lạc Quang phổ kế cấp 2 hoặccấp ba cho phép thu được phổ Raman mà không cần sử dụng các bộ lọc nhiễu Trongnhững hệ thống như thế, các chế độ Raman hoạt động ở tần số thấp 3–5cm-1 có thể đượcphát hiện hiệu quả

Hiện nay, biện pháp sử dụng kết hợp giữa bộ lọc nhiễu và máy đơn sắc với cách

tử holographic thường được sử dụng để loại bỏ tối đa tín hiệu gây nhiễu Rayliegh

 Đầu dò (detector)

Có tác dụng phát hiện bức xạ điện từ tán xạ và chuyển lượng bức xạ này thànhdòng điện.

Trước đây người ta chủ yếu sử dụng các đầu dò đơn điểm chẳng hạn như Ốngnhân quang đếm photon (PMT) Tuy nhiên một phổ Raman đơn thu được từ đầu dò PMT

ở chế độ quét số sóng tốn thời gian, làm chậm qui trình thực hiện các công việc dựa trên

kỹ thuật phân tích Raman

Hiện nay, các nhà nghiên cứu sử dụng ngày càng phổ biến các đầu do đa kênh nhưđầu dò chuỗi diot quang (PDA) hay phổ biến hơn là các cảm biến điện tích kép (CCD) đểphát hiện ánh sáng tán xạ Raman Độ nhạy và hiệu suất của các đầu dò CCD hiện đạingày càng được nâng cao Trong nhiều trường hợp CCD trở thành đầu dò được lựa chọncho quang phổ Raman

 Bộ phận khuếch đại tín hiệu Raman

• Nguyên lý hoạt động:

Làm cho các tinh thể sợi quang Silica phát ra bức xạ cùng bước sóng và cùng phavới tín hiệu Raman đi vào bộ khuếch đại, tín hiệu Raman được nhận thêm năng lượngbức xạ nên được tăng cường Khi cung cấp năng lượng cho các nguyên tử của sợi quang

từ nguồn một laser bơm có bước sóng thấp hơn bước sóng của tín hiệu Raman cầnkhuếch đại, các nguyên tử của sợi quang sẽ hấp thụ năng lượng từ laser bơm và chuyểnlên mức cao hơn Khi có tín hiệu Raman đến, các nguyên tử sợi quang đang ở mức nănglượng cao (trạng thái kích thích) chuyển sang trạng thái năng lượng thấp hơn (trạng thái

cơ bản) và giải phóng ra một năng lượng dưới dạng photon ánh sáng có cùng bước sóng

và cùng pha với tín hiệu Raman đến Do đó, tín hiệu đã được khuếch đại

Hình 8 Sơ đồ chuyển năng lượng trong khuếch đại Raman

Dựa trên giản đồ năng lượng trên, tần số ánh sáng bơm ν bơm và tần số ánh sáng được khuếch đại νkhuếch đại được tính như sau:

ν bơm = (E3E1)/h;

νkhuếch đại = (E2-E1)/h Trong đó: h là hằng số Plank; E3, E2, E1 lần lượt là năng lượng của các trạng thái năng lượng cao, trạng thái năng lượng trung gian và trạng thái năng lượng thấp của các nguyên tử trong sợi quang

Trong khuếch đại Raman, tín hiệu quang được khuếch đại dọc theo toàn bộ chiềudài của sợi quang Silica bình thường Cấu trúc của một bộ khuếch đại Raman được minhhọa trong hình 9

Hình 9 Cấu trúc bộ khuếch đại Raman

• Sợi quang (Fiber): là nơi xảy ra quá trình khuếch đại

• Bộ ghép (Fiber Coupler): dùng để ghép các bước sóng tín hiệu Raman

vào sóng bơm

• Bộ lọc (Filter): Đặt ở hai đầu của bộ khuếch đại quang để ngăn chặn tín

hiệu phản xạ ở hai đầu bộ khuếch đại Đồng thời nó cũng giúp loại trừnhiễu theo hướng ngược về phía đầu vào có thể gây ảnh hưởng đến tín hiệuđầu vào

 Nguyên lý hoạt động máy quang phổ Raman

Nguồn ánh sáng laser chiếu vào mẫu sẽ đi qua một thấu kính hội tụ để tập trungnguồn ánh sáng vào mẫu, một phần bức xạ ánh sáng bị hấp thụ bởi mẫu hoặc phần lớn đixuyên qua mẫu, một phần nhỏ ánh sáng bị tán xạ trở lại (tán xạ Rayliegh và tán xạRaman) Ánh sáng tán xạ được chuyển hướng bởi gương đi qua bộ lọc nhiễu loại bỏ một

phần tán xạ Rayliegh Tán xạ Raman thu được sau khi đi qua bộ lọc nhiễu sẽ đi qua hệthấu kính để thu và hội tụ bức xạ vào các máy đơn sắc Các máy đơn sắc gồm gương vàcách tử để loại bỏ các bước sóng gây nhiễu Rayleigh lần 2, chọn vùng bước sóng để thuđược tín hiệu Raman rõ nhất Tín hiệu Raman thu được sẽ đi qua bộ phận đầu dò đểchuyển thành tín hiệu điện, tiếp tục qua bộ phận khuếch đại để tăng cường tín hiệu mạnhhơn Cuối cùng qua bộ phận hiển thị tín hiệu ta có thể thấy rõ biểu đồ tín hiệu thu đượccủa mẫu phân tích.

Hình 10 Sơ đồ máy quang phổ Raman

2.2.4 Các kỹ thuật Raman hiện nay

Tín hiệu Raman thường yếu và con người không ngừng cải tiến các kỹ thuật quangphổ Raman Có nhiều phương pháp chuẩn bị mẫu, chiếu mẫu hoặc phát hiện ánh sáng tán

xạ được được phát minh để nâng cao cường độ tín hiệu Raman Ở đây sẽ xem xét một sốphương pháp này

 Raman kích thích

Người ta đã phát hiện ra rằng nếu mẫu được chiếu sáng bởi một xung laser rấtmạnh sẽ xuất hiện hiện tượng “phi tuyến tính” trong tín hiệu Raman Khi so sánh nguồnxung laser có cường độ điện trường khoảng 104 V/cm, với xung laser ở điện trườngkhoảng 109V/cm sẽ chuyển một phần lớn hơn nhiều của ánh sáng tới thành ánh sáng tán

xạ Raman hữu dụng và tăng đáng kể tỷ số tín hiệu trên nhiễu (signal-to-noise)

Tán xạ Raman kích thích là một ví dụ về quang phổ Raman “phi tuyến” Mộtxung laser rất mạnh với cường độ điện trường > 109V/cm chuyển tới 50% năng lượngxung laser vào vạch liên kết ở tần số Stokes (υ0 - υm) đầu tiên Chùm Stokes ngược hướngvới chùm laser tới Chỉ có chế độ υm, là phổ mạnh nhất trong phổ Raman thông thườngđược khuếch đại đáng kể Tất cả các chế độ hoạt động Raman khác yếu hơn đều khôngđược hiển thị Tần số Stokes rất mạnh và có vai trò như một nguồn kích thích thứ cấp vàtạo ra vạch Stokes thứ 2 với tần số (υ0 - 2υm) Vạch Stokes 2 lại tạo ra vạch Stokes 3 vớitần số (υ0 - 3υm) Kỹ thuật Raman kích thích có được tín hiệu Raman có độ lớn hơn 4 –

5 lần so với tán xạ Raman thông thường

 Raman phản Stokes kết hợp (CARS)

Raman phản Stokes kết hợp (Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy-CARS),

là một dạng quang phổ Raman “phi tuyến” khác Thay vì chỉ có một nguồn laser truyềnthống, 2 nguồn laser cộng tuyến rất mạnh được chiếu vào mẫu Tần số của chùm laser thứnhất thường không đổi còn tần số của chùm laser thứ hai có thể được điều chỉnh để hiệu

số tần số của 2 chùm laser bằng đúng tần số của chế độ hoạt động Raman của mẫu nghiêncứu Chế độ đặc biệt này là chế độ mạnh nhất trong tín hiệu Raman

Với CARS, chỉ có thể nhận được một đỉnh Raman duy nhất Trong trường hợpnày, không nhất thiết phải có bộ đơn sắc, chỉ cần một bộ lọc nhiễu dải rộng và một đầu

dò đặt sau bộ lọc là đủ

Hai chùm laser với tần số υ1 và υ2 (υ1 > υ2) tác động một cách kết hợp lên mẫu,

do sự trộn sóng tạo ra ánh sáng tán xạ mạnh với tần số (2υ1 - υ2) Nếu hiệu số tần số của 2chùm laser (υ1 - υ2) bằng với tần số υm của chế độ hoạt động Raman của mẫu (dao độnghoặc xoay vòng hoặc chế độ khác) thì sẽ phát xạ trở lại một ánh sáng mạnh có tần số (υ1

+ υm) Nói cách khác, để thu được tín hiệu Raman mạnh thì tần số chùm laser thứ cấpphải điều chỉnh sao cho υ2 = υ1 - υm Sau đó, tần số của ánh sáng tán xạ sẽ là (2υ1 - υ2 =2υ1- (υ1 - υm) = υ1 + υm), lớn hơn tần số kích thích υ1 và do đó được coi là tần số đốiStokes Thuật ngữ Raman đối Stokes kết hợp xuất phát từ việc sử dụng 2 chùm laser kếthợp và tạo ra tín hiệu có tần số đối Stokes

 Raman cộng hưởng (RR)

Nhiều hợp chất, nhất là các chất có màu, có thể hấp thụ năng lượng chùm laser vàsinh ra huỳnh quang mạnh, làm nhiễu phổ Raman Đây là một trong những vấn đề quantrọng trong quang phổ Raman, nhất là khi sử dụng laser trong vùng UV.

Tuy nhiên, người ta đã phát hiện ra trong một số điều kiện cụ thể, một số dạngphân tử màu có thể tạo ra tán xạ Raman mạnh thay vì tạo ra huỳnh quang Hiệu ứng nàyđược gọi là hiệu ứng cộng hưởng Raman Hiệu ứng xảy ra khi tần số laser kích thíchđược chọn sao cho bằng tần số của trạng thái kích thích điện tử của mẫu và cộng hưởngvới chúng Cường độ của dải Raman phát sinh từ sự chuyển đổi điện tử giữa 2 trạng tháinày được tăng lên 3 – 5 lần Không phải tất cả các dải của phổ Raman tức thời được tănglên Chỉ có nhóm mang màu, nhóm tạo thành màu của phân tử được tăng lên nhiều nhất.Nguyên nhân là nhóm mang màu thường có mức hấp thụ ánh sáng cao nhất

Cường độ lớn nhất của tín hiệu Raman cộng hưởng có được khi tần số chùm laserbằng với trạng thái kích thích điện tử thứ nhất hoặc thứ 2 Do vậy, nguồn laser điều chỉnhđược, là lựa chọn phù hợp nhất cho kỹ thuật RR Mặc dù kể cả khi tần số của chùm laserkhông bằng chính xác trạng thái kích thích điện tử thì tín hiệu Raman vẫn xuất hiện đángkể

 SERS và SERRS

Quang phổ Raman tăng cường bề mặt SERS sử dụng hiệu ứng sau Tín hiệuRaman từ các phân tử được hấp thụ trên bề mặt của một kim loại xác định có thể đượctăng lên 5 – 6 lần so với tín hiệu Raman của cùng phân tử đó khi ở dạng thể tích khối.Nguyên nhân chính xác của hiện tượng tăng đáng kể này còn đang được thảo luận Tuynhiên, do cường độ của tín hiệu Raman tỷ lệ với bình phương moment lưỡng cực điện P

= αE, nên có thể có 2 nguyên nhân hoặc do tăng hệ số phân cực α hoặc cường độ điệntrường E tăng

Trường hợp thứ nhất hệ số phân cực tăng có thể xuất hiện do ảnh hưởng dịchchuyển điện tích hoặc hình thành liên kết hóa học giữa bề mặt kim loại và phân tử đangnghiên cứu Đây được gọi là tăng cường hóa học

Trường hợp thứ 2 liên quan đến tương tác giữa chùm laser với bề mặt không đồngđều của kim loại như với các vi hạt kim loại hoặc bề mặt sần sùi Người ta tin rằng ánhsáng laser làm kích tích điện tử dẫn trên bề mặt kim loại dẫn tới cộng hưởng plasma bềmặt và làm tăng mạnh cường độ điện trường E Đây còn được gọi là tăng cường điện từ