BÀI GIẢNG VI SINH THỰC PHẨM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ SÀI GÒN KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÀI GIẢNG THỰC HÀNH HỆ CAO ĐẲNG Năm học 2010-2011 NỘI QUI PHÒNG THÍ NGHIỆM Một số vi sinh vật sử dụng thí nghiệm gây bệnh cho người động vật, nội qui ban hành để ngăn ngừa nguy nhiễm bệnh cho sinh viên cán phòng thí nghiệm Bất kỳ cá nhân không tuân thủ tốt nội qui hay gây nguy hại cho người khác không phép vào phòng thí nghiệm Khi có thắc mắc cần phải yêu cầu hướng dẫn giáo viên cán phòng thí nghiệm Các qui định chung + Sinh viên vào phòng thí nghiệm phải mặc trang phục bảo hộ (áo khoác trắng) có bảng tên (thẻ sinh viên) + Sinh viên phải tham dự 100% buổi thí nghiệm + Sinh viên phải đến giờ, đến trễ 15 phút, sinh viên không phép vào phòng thí nghiệm xem vắng mặt không lý + Nếu lý bất khả kháng sinh viên không tham dự buổi thí nghiệm, sinh viên phải báo trước (hoặc vào buổi thí nghiệm) cho cán trách nhiệm + Khi làm hư hỏng trang thiết bị/dụng cụ phòng thí nghiệm, sinh viên có nghĩa vụ phải hoàn trả lại + Sinh viên phải đọc kỹ trước vào thí nghiệm không mang tài liệu thí nghiệm vào phòng + Khi làm đổ/tràn dung dịch làm bể dụng cụ thủy tinh phải báo cáo cho cán phòng thí nghiệm xin ý kiến giải + Sinh viên phải nắm vững thao tác vô trùng + Giảm thiểu hình thành khí dung thao tác + Rửa tay trước sau thí nghiệm + Không ăn/uống/nghe nhạc/đọc sách-báo phòng thí nghiệm + Đọc kỹ nội qui/qui định có cửa phòng thí nghiệm + Vệ sinh bàn/ghế/kệ dụng cụ trước sau thí nghiệm + Đổ bỏ rác thải qui định + Không ngậm đồ dùng (viết, kiếng…) miệng hay gắn vào tai + Đọc ký tên vào qui định/nội qui để chắn sinh viên đọc hiểu + Trả đầy đủ dụng cụ sau hoàn thành xong thí nghiệm Dụng cụ phải rửa + Vệ sinh phòng thí nghiệm theo yêu cầu người phụ trách Các yêu cầu an toàn + Cột tóc, mặc phục trang bảo hộ (áo khoác trắng, găng tay chống nhiệt…) dùng dụng cụ/thiết bị lúc, nơi + Nghiêm cấm dùng miệng hút pipette Trong tình khẩn cấp + Lưu ý vị trí trang bị cấp cứu cần (dụng cụ y tế, bình cứu hỏa, vòi nước, điện thoại số điện thoại cấp cứu) + Báo cáo tình khẩn cấp cho giáo viên hướng dẫn cán phòng thí nghiệm + Bình tĩnh có tình khẩn cấp PTN Chất lượng Thực phẩm PHẦN I: ĐẠI CƯƠNG VỀ VI SINH VẬT HỌC Bài 1: CÁC THAO TÁC CƠ BẢN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH Môi trường , pha chế chuẩn bị môi trường 1.1 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Để phân lập, nuôi cấy hay bảo quản giống vi sinh vật, người ta phải sử dụng môi trường dinh dưỡng đặc (hoặc lỏng) Môi trường dinh dưỡng không chứa thành phần cần cho phát triển ví sinh vật mà phải đảm bảo điều kiện lý hóa thích hợp cho trao đổi chất vi sinh vật với môi trường bên Vì vậy, để thiết lập môi trường cần phải biết rõ nhu cầu vi sinh vật chất dinh dưỡng đặc điểm trao đổi chất chúng Cần lưu ý nồng độ chất hòa tan môi trường phải cân áp suất thẩm thấu tế bào vi sinh vật đảm bảo phát triển tối ưu chúng Môi trường thường đặt tên theo người sáng tạo chúng (ví dụ môi trường Kzapek, môi trường Hansen) hay theo thành phần dinh dưỡng đặc trưng môi trường (ví dụ môi trường dịch trích giá đậu, khoai tây) 1.2 Nguyên tắc pha chế môi trường: Nguyên tắc để pha chế môi trường phải đảm bảo nhu cầu vi sinh vật (nguồn C, N khoáng) Ngoài có số nguyên tắc sau: a Tùy theo nhu cầu nghiên cứu hay học tập mà pha chế môi trường phù hợp: - Nếu muốn nuôi cấy vi sinh vật để quan sát hình thái phải nuôi cấy môi trường đặc - Nếu muốn tìm hiểu trao đổi chất vi sinh vật thi dùng môi trường lỏng - Môi trường chưa cao thịt, pepton dùng nuôi cấy vi khuẩn hoại sinh b Tùy vào nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt vi sinh vật để bổ sung thành phần khác đó: - Cần nuôi cấy vi sinh vật phân giải cellulose cần bổ sung cellulose vào môi trường - Cần nuôi cấy vi sinh vật chuyển hóa N, cần bổ sung hợp chất chứa N vào môi trường - Hay bổ sung kháng sinh vào môi trường nhằm nuôi cấy vi sinh vật có khả kháng lại kháng sinh 1.3 Phân loại môi trường i Dựa vào thành phần - Môi trường tự nhiên: Các loại môi trường hợp chất tự nhiên như: khoai tây, cám gạo, bã khoai mì, phế phẩm chế biến thịt, dịch sữa…thành phần môi trường thường phức tạp không ổn định - Môi trường tổng hợp: sử dụng loại hóa chất hữu vô tinh khiết để pha chế môi trường với tỷ lệ xác - Môi trường bán tổng hợp: sử dụng hóa chất tinh khiết lẫn thành phần tự nhiên ii Dựa vào tính chất vật lý - Môi trường lỏng - Môi trường rắn: thường có từ 1,5-2% agar gelatine - Môi trường bán lỏng: có khoảng 0,3-0,7% agar iii Dựa vào công dụng: - Môi trường đặc trưng hay chọn lọc: môi trường có chứa thành phần đặc biệt phù hợp với nhóm vi sinh vật Ví dụ môi trường dùng để phân lập vi sinh vật chuyển hóa đạm, chuyển hóa lân… - Môi trường kiểm định: dùng để xác định tính chất vi sinh vật Người ta thương bổ sung hợp chất đặc biệt có biến đổi nhìn thấy trình nuôi cấy vi sinh vật chất thị màu 1.4 Cách pha chế môi trường Pha chế môi trường khâu quan trọng cần phải xác Gồm bước sau: - Cân thành phần môi trường - Nếu môi trường lỏng: pha thành phần vào nước, ý thứ tự pha chế - Nếu môi trường đặc: hòa tan thành phần vào nước thêm 1,5-2% agar đun đến agar tan chảy - Lọc: thường lọc môi trường qua vải - Chỉnh pH: tùy theo yêu cầu vi sinh vật yêu cầu nghiên cứu, thường điều chỉnh pH phù hợp Thường dùng loại hóa chất như: H2SO4, H3PO4, KOH, NaOH… - Phân phối vào dụng cụ chứa: bình chứa cho vào khoảng 2/3 thể tích bình, làm môi trường thạch dĩa cho vào khoảng 10-15ml/dĩa, làm thạch nghiêng cho vào 1/4-1/5 chiều cao ống nghiệm - Tiệt trùng môi trường: thường dùng phương pháp chủ yếu nhiệt ẩm với áp suất cao (121oC, 1atm) nhằm tiêu diệt tất bào tử vi sinh vật không mong muốn có sẵn môi trường Thực pha chế môi trường Mỗi nhóm thực hành pha chế hai môi trường dùng để nuôi cấy vi sinh vật sau: - Môi trường (môi trường dịch trích giá đậu): + Giá đậu: 200g + Glucose: 10g + Trypton: 5g + Yeast extract: 1g + Agar: 15g + H2O: đủ 1000 ml - Môi trường (Môi trường dịch trích khoai tây): + Khoai tây: 200g + Saccharose: 50g + Pepton: 5g + Yeast extract: 1g + Agar: 20g + H2O: đủ 1000 ml Cách thực hiện: giá đậu khoai tây đun với H2O để sôi 20 phút, lọc lấy dịch trong, bổ sung thành phần lại Sau tiếp tục đun đến agar tan hoàn toàn Phân phối vào bình chứa đem tiệt trùng 121oC 15 phút Các dụng cụ sử dụng vi sinh vật học 2.1 Dụng cụ dùng cấy chuyền Các loại dụng cụ sử dụng cấy chuyền nhằm mục mục đích chuyển vi sinh vật từ môi trường cũ sang môi trường cho nhu cầu khác nhau: cấy chuyền, nhân giống, phân lập vi sinh vật Tất dụng cụ dùng cấy chuyền phải đảm bảo vô trùng nhiều cách khác nhau, nhằm tránh việc đưa vào môi trường vi sinh vật không mong muốn thường sử dụng phương pháp tiệt trùng nhiệt khô 140-150oC Các dụng cụ kể chủ yếu dùng chuyển đổi vi sinh vật từ môi trường lỏng sang môi trường khác Để chuyển vi sinh vật từ môi trường rắn sang môi trường khác, người ta chủ yếu sử dụng que cấy vòng/ thẳng que cấy móc Que cấy thẳng (a) que cấy vòng (b) Khi sử dụng que cấy, thường que cấy tiệt trùng lửa đèn cồn đèn Bunsel Khi tiệt trùng phải đảm bảo đầu que cấy thành phần que cấy phải tiệt trùng hoàn toàn cách đốt nóng đỏ 2.2 Các phương pháp phân lập cấy chuyền vi vi sinh vật: Phân lập vi sinh vật việc phân tách chủng vi sinh vật môi trường tự nhiên cô lập chúng nhằm chọn lựa giống vi sinh vật khiết cho mục đích khác Để phân lập vi sinh vật, người ta thường tiến hành nuôi cấy vi sinh vật môi trường chọn lọc nhằm ưu tiên phát triển loại vi sinh vật Nếu môi trường đặc trưng thường người ta nuôi vi sinh môi trường rắn làm cách tách rời tế bào vi sinh vật cho chúng phát triển riêng rẽ môi trường rắn để tạo thành khuẩn lạc (colony) với hình dáng đặc trưng việc chọn lựa tiến hành khuẩn lạc Một số hình dạng khuẩn lạc mọc môi trường rắn: hàng (nhìn từ xuống), hàng (nhìn ngang), hàng (dạng rìa khuẩn lạc) Các phương pháp cấy Cách cấy ống thạch nghiêng Cấy đĩa môi trường thạch que cấy vòng Cấy đĩa môi trường thạch que trãi Bài 3: ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN Giới thiệu Coliform Coliforms trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí kị khí tùy ý, có khả lên men lactose sinh acid sinh 37oC 24 – 48 Trong thực tế phân tích, Coliforms định nghĩa vi khuẩn có khả lên men sinh khoảng 48 ủ 37oC môi trường lỏng Lauryl Sulfate môi trường Brilliant Green Lactose Bile Salt Nhóm Coliforms diện rộng rãi tự nhiên, ruột người động vật Coliforms xem nhóm vi sinh vật thị: số lượng diện chúng thực phẩm, nước hay có loại môi trường dùng để thị khả diện vi sinh vật gây bệnh khác Nhiều nghiên cứu cho thấy số Coliforms thực phẩm cao khả diện vi sinh vật gây bệnh khác cao Tuy nhiên, mối liên hệ vi sinh vật gây bệnh vi sinh vật thị nhiều tranh cãi Coliforms gồm giống: Escherichia với loại E.coli, Citrobacter, Clebsiella, Enterobacter Tính chất sinh hoá đặc trưng nhóm thể qua thử nghiệm indol (I), Methy Red (MR), Voges-Proskauer (VP) Citrate (iC) thường gọi tóm tắt chung IMViC Coliforms chịu nhiệt Coliforms có khả lên men lactose sinh khoảng 24 ủ 44oC môi trường lỏng EC Coliforms phân (faecal coliforms hay E.coli giả định)là Coliforms chịu nhiệt có khả sinh indole ủ khoảng 24 44.5oC môi trường lỏng Trypton Coliforms phân thành phần hệ vi sinh đường ruột người động vật máu nóng khác sử dụng để thị mức độ vệ sinh trình chế biến, bảo quản, vận chuyển, thực phẩm, nước uống để thị ô nhiễm phân mẫu môi trường E.coli Coliforms phân cho kết thử nghiệm IMViC ++ (Indol + , Methyl Red + ,Voges-Proskauer -, Citrate -) Phương pháp MPN (Most Probable Number) Phương pháp MPN (phương pháp số có xác suất cao nhất, số tối khả) gọi phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ Đây phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn diện đơn vị thể tích mẫu Đây phương pháp định lượng dựa kết định tính loạt thí nghiệm lặp lại số độ pha loãng khác Thông thường, việc định lượng thực lặp lại lần độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng x = ống nghiệm Qui trình thực định lượng theo phương pháp sau: cho vào ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho tăng trưởng đối tượng vi sinh vật cần định lượng thể tích xác dung dịch mẫu nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp (ví dụ 10-1, 10-2, 10-3) Ủ nhiệt độ thời gian thích hợp Dựa vào kết biểu kiến chứng minh tăng trưởng vi sinh vật cần kiểm định ống nghiệm (thường tượng sinh hơi, đổi màu, đục…) Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính độ pha loãng Sử dụng số liệu dựa vào bảng Mac Crady suy mật độ vi sinh vật trình bày dạng số MPN/100 ml, MPN/1 g mẫu Độ xác trị số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại độ pha loãng: số lượng ống nghiệm lặp lại cao độ xác trị số vi sinh vật nuôi cấy môi trường lỏng chọn lọc cho kết biểu kiến thích hợp Ví dụ, môi trường BGBL 37oC định lượng nhóm coliforms, môi trường 45oC cho phép định lượng coliforms phân môi trường Mannitol Salt Broth dùng để định lượng Staphylococcus… Định lượng Coliforms phương pháp MPN Tuần tự cấy ml dịch mẫu pha loãng 10-1 vào ống nghiệm giống nhau, ống chứa 10 ml môi trường LST ống Durham úp ngược Thực tương tự với dịch mẫu pha loãng 10-2, 10-3 đến 10-10…Ủ ống nghiệm 48 37oC Ống dương tính ống có sinh khí bọt khí ống Durham) Ghi nhận số ống dương tính Thử nghiệm khẳng định: dùng que cấy vòng chuyển dịch mẫu từ ống LST dương tính sang ống chứa môi trường BGBL ủ 37oC 48 Ghi nhận số ống dương tính ứng với độ pha loãng Lưu ý: cần loại bỏ ống nghiệm có chứa bọt khí ống Durham sau tiệt trùng môi trường Các ống có khả diện Coliforms ống dương tính môi trường LST lẫn BGBL Các thao tác Lựa chọn độ pha loãng để tính kết Mỗi mẫu kiểm nghiệm chọn độ pha loãng liên tiếp ứng với trường hợp sau cho thích hợp Tiến hành thứ tự theo trường hợp bước (a, b,c…) sau: Trường hợp a Chọn độ pha loãng cao (tức dịch pha loãng có nồng độ mẫu nhỏ nhất) cho ống dương tính, với hai độ pha loãng cao (tức độ pha loãng có nồng độ mẫu 1/10 1/100 độ pha loãng thứ chọn (xem ví du) b Xem trường hợp c Nếu dịch pha loãng dịch pha loãng cao cho ống dương tính chọn tiếp độ pha loãng cao dãy (tức độ pha loãng có nồng độ mẫu nhỏ nhất) (xem bảng 1, ví dụ 2) Trường hợp a Nếu trường hợp áp dụng, chọn độ pha loãng cao dãy (tức độ pha loãng có nồng độ mẫu nhỏ nhất), số thu kết dương tính (xem bảng 1, ví dụ 3) b Xem trường hợp Trường hợp (trường hợp đặc biệt) Trong tất trường hợp, có nhiều độ pha loãng chọn theo trường hợp ống dương tính, chọn độ pha loãng có độ pha loãng thấp ống dương tính (tức độ pha loãng có nồng độ mẫu cao nhất) độ pha loãng thấp dãy pha loãng (tức có nồng độ mẫu gấp 10 lần 100 lần độ pha loãng thứ chọn), (xem bảng 1, ví dụ & 5), trừ ống dương tính tìm thấy mức pha loãng chuẩn bị từ mẫu thử Trong trường hợp cuối này, cần chọn độ pha loãng để tính MPN, chí loạt ống bao gồm độ pha loãng ống dương tính Ví dụ lựa chọn kết dương tính việc tính toán MPN Xác định số MPN Sử dụng kết phần để tra bảng Kết (MPN/ml) = kết trang bảng x f/10 f: độ pha loãng thấp chọn (10n) Ví dụ Bảng tra MPN dùng cho loạt ống nghiệm nồng độ pha loãng liên tiếp BÀI 4: ĐỊNH LƯỢNG TRỰC TIẾP TẾ BÀO VI SINH VẬT Định lượng trực tiếp tế bào buồng đếm Có thể sử dụng buồng đếm để định lượng vi sinh vật có kích thước tế bào lớn nấm men, bào tử nấm mốc…với độ phóng đại x100 đến x400 Với tế bào vi khuẩn, kích thước nhỏ, nên phải sử dụng buồng đếm Petroff-Hasser Phương pháp đếm trực tiếp giúp quan sát hình thái tế bào…Kết đếm tổng số tế bào có mẫu, không phân biệt tế bào sống hay tế bào chết (chỉ phân biệt tế bào nấm men chết tiến hành nhuộm với dung dịch methylen blue ) Cấu tạo buồng đếm hồng cầu Buồng đếm hồng cầu phiến kính dày hình chữ nhật, phần lõm phẳng, có kẻ lưới gồm 400 ô vuông nhỏ có diện tích tổng cộng 1mm2.Bao gồm 25 ô vuông lớn; ô vuông lớn gồm có 16 ô vuông nhỏ Vì thế, diện tích hình vuông nhỏ 1/400 mm2 hình vuông lớn 1/25 mm2 Cách tiến hành a Pha loãng huyền phù tế bào vi sinh vật cho ô lớn từ 10 – 50 tế bào) b Lắc mạnh dịch huyền phù tế bào (đã pha loãng), dùng pippet Pasteur để hút dịch huyền phù Đậy buồng đếm phiến kính mỏng Nhẹ nhàng dùng đầu pippet (chứa giọt huyền phù vi sinh vật), đặt vào cạnh buồng đếm (nơi tiếp giáp với phiến kính mỏng) Dịch huyền phù vào buồng đếm nhờ chế mao dẫn Buồng đếm chuẩn bị có vùng không gian nằm kính buồng đếm phủ dịch huyền phù tế bào, rãnh chung quanh không bị dính ướt Di chuyển nhẹ nhàng khung đếm để dịch huyền phù tràn đầy khoang Khi đó, dịch nằm khoang có độ dày khoảng 0.1mm Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, sử dụng vật kính x10 để tìm buồng đếm Chỉnh thật rõ, sau chuyển qua vật kính x40 để đếm Điều chỉnh cường độ ánh sáng cửa sập để quan sát rõ ràng tế bào lẫn đường kẻ Tuỳ vào số lượng tế bào mà chọn cách đếm tất tế bào có ô trung tâm hay đếm tế bào có số ô vuông lớn đại diện Thông thường ta chọn ô trung tâm ô nằm bìa ô theo đường chéo (các ô đánh dấu X) Bắt đầu đếm tế bào sau nhỏ giọt dịch từ – phút; phải đếm tế bào nằm đường kẻ kề chọn ô PHẦN 3: ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG CHẾ BIẾN THỰC PHẨM Bài 1: LÊN MEN RƯỢU VANG QUẢ Giới thiệu: Danh từ rượu vang dùng để loại rượu lên men từ dịch ép trái (nho, dâu, thơm, táo ) số chủng nấm men Rượu vang thu không qua chưng cất, có hương vị thơm ngon trái tự nhiên, có độ cồn nhẹ (10 – 15%) loại nước giải khát thơm ngon, giàu chất bổ dưỡng, đặt biệt thích hợp phụ nữ Tùy theo lượng đường khử lại rượu vang sau lên men xong, người ta phân biệt: (a) rượu vang khô: 10 g đường/l, (b) nửa khô: 20 – 30 g đường/l, (c) ngọt: 45 g đường/l, (d) rượu ngọt: 80 – 110 g đường/l Trong rượu vang có chứa acid hữu vô (acid tartric, acid malic, acidcitric, acid oxalic ) pH rượu vang khoảng từ 2.9 – 3.9 Qui trình thí nghiệm Rửa (2~3kg) Làm dập (nho, ) xay dập (thơm, xoài, ) cắt thành lát mỏng Với chuối, nên tiến hành xắt lát sấy khô trước Với loại khác, ta xay dập, vắt lấy nước túi vải lọc Cho (hoặc dịch quả) vào hũ plastic loại L rửa (chọn loại có nắp vặn chắc) Bổ sung thêm nước (1~2 L) cho đạt 2/3 thể tích bình chứa Bổ sung đường cát trắng cho dung dịch đạt nồng độ chất khô 25oBx (khuấy để đường tan hoàn toàn) Điều chỉnh pH 5.0 (sử dụng giấy quỳ tím acid citric) Bổ sung môi trường chứa huyền phù Saccharomyces oviformis qua nhân giống 30oC /48 với thể tích phù hợp Kết thúc trình lên men nồng độ chất khô không tiếp tục giảm hình thành bọt khí bình lên men (khoảng –7 ngày) Ta có rượu non Lọc bỏ xác vải lọc thưa 10 Tiến hành trình lên men phụ chai plastic (chai pet loại 1.25–1.50 L) nhiệt độ 15 – 18oC (ngăn mát tủ lạnh) Thỉnh thoảng mở nắp vặn để xả bớt lượng khí CO2 tích lũy chai (phòng tránh phồng/nổ chai) 11 Sau ngày, lọc bỏ cặn nhiều lần (qua gòn loại thấm nước) để có rượu sống 12 Tiếp tục ủ chín chai plastic 15 – 18oC với thời gian vài tháng để có rượu vang chín Gợi ý: tùy điều kiện, sinh viên dùng 100% dịch (không bổ sung thêm nước) để có hương vị rượu tốt Để có loại rượu với hương vị tốt, sinh viên nên sử dụng nho thơm để làm thí nghiệm Sinh viên sử dụng rượu sống tiếp tục ủ chín để có rượu vang chín với hương vị tốt Theo dõi trình lên men qua số tiêu sau Trong giai đoạn lên men chính: a Nồng độ chất khô (oBx): kiểm tra ngày/lần b pH c Sự tạo thành bọt khí bên hũ nhựa (ghi nhận kết quan sát được) d Độ cồn: mẫu rượu sau kết thúc lên men chưng cất xác định độ cồn phương pháp chuẩn độ (hoặc phương pháp dùng bình tỉ trọng) Các kết ghi nhận vào bảng biểu vẽ đồ thị theo thời gian Bài 2: LÊN MEN GIẤM Giới thiệu: Theo khái niệm Tổ Chức Nông Lương Thế Giới (FAO), giấm định nghĩa sau: “Giấm (vinegar) dung dịch acid loãng mà người sử dụng thông qua đường tiêu hóa Giấm phải sản xuất từ nguyên liệu có nguồn gốc từ nông nghiệp chứa tinh bột, đường, lên men chuyển đường thành rượu sau tiếp tục lên men acetic chuyển rượu thành acid acetic (thành phần chủ yếu giấm)” Đây khái niệm sử dụng phổ biến giới ngày Một số ứng dụng quan trọng giấm công nghệ thực phẩm là: − Chất gia vị làm tăng giá trị cảm quan số sản phẩm thực phẩm như: xốt, tương cà, tương ớt, mayonaise, salad trộn, rau dầm giấm (dưa chuột dầm giấm, rau cải dầm giấm, hành dầm giấm, hương thảo dầm giấm…) − Phụ gia bảo quản, khử mùi thịt cá trước chế biến Ngày nay, giấm đa dạng hóa từ nhiều nguyên liệu khác Ở Nhật, vai trò tăng giá trị cảm quan, người ta sản xuất số loại giấm chức giấm từ gạo lức giàu acid amin, giấm từ củ hành giàu acid amin, K, Mg Hàng năm, giới, sản lượng giấm tiêu thụ lớn Quy trình thử nghiệm i Tiến hành làm rượu vang (dứa, nho…) rượu gạo, rượu nếp than, rượu từ dịch chiết malt … để thu rượu non ii Lọc bỏ bã vải lọc iii Hiệu chỉnh nồng độ rượu 5% nước iv Bổ sung giống vi khuẩn Acetobacter aceti với tỉ lệ 10% - 30% v Cho phần rượu non bổ sung giống vi khuẩn lọc vào hũ (nhựa thủy tinh) cho phần rượu chiếm 50 – 70% thể tích vật chứa Lưu ý, sau bổ sung giống nồng độ acid dịch lên men phải đạt tối thiểu 0.5% (tính theo acid acetic), chưa đạt phải hiệu chỉnh acid acetic vi Để yên khoảng tháng Hàng ngày mở nắp hũ chứa lần khoảng thời gian – phút Tuyệt đối không lắc hũ chứa làm cho lớp váng mỏng bị vỡ hay chìm xuống vii Kiểm tra độ acid định kỳ hàng tuần Nếu đạt nồng độ acid acetic >4.5% đạt yêu cầu Ta thu giấm non viii ix Lọc kỹ qua lớp gòn thấm nước ly tâm 5000 rpm 15 phút Cho vào chai thủy tinh đóng nắp sau tiến hành trùng 80 – 90oC (đun cách thủy) 15 – 30 phút x Để có loại giấm ngon ta tiếp tục ủ chín giấm non điều kiện 30oC – tháng Sau đó, lọc, đóng chai trùng MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG THÔNG DỤNG - M1 (môi trường giá đậu đường) Cân 100g giá đậu (đã rửa sạch), thêm 1000ml nước Đun sôi 30 phút Lấy phần dịch Thêm nước cho đủ 1000ml bổ sung thêm glucose với hàm lượng 5% (w/v) - M2 (môi trường khoai tây đường cám): 1000ml Khoai tây cắt nhỏ, rửa sạch, cân lấy 300g Thêm 500ml nước, đun sôi 30 phút Lọc lấty nước Cân 100g cám, thêm 500ml nước, đun sôi 30 phút Lọc lấy nước Trộn loại dịch lọc thêm sucrose 5% (w/v) Bổ sung nước cho đủ 1000ml Khoai tây 30% Cám 10% Sucrose 5% Nước đủ 1000ml - M3 (môi trường Sabouraud): 1000ml Pepton 1% Glucose 4% Agar 2% Nước đủ 1000ml pH 5.6 – 6.0 - M4 (môi trường Hansen) Glucose 5% Pepton 1% K2HPO4 0.3% MgSO4.7H2O 0.2% Agar 2% Nước đủ 1000ml - M5 (môi trường Potato Dextrose Agar) Để chuẩn bị chất chiết khoai tây, đun sôi 200g khoai tây xắt lát, không gọt vỏ với 1000ml nước 30 phút Lọc qua vải thưa, giữ lại phần dịch, chất chiết khoai tây Trộn với thành phần khác đun sôi để hoà tan (đối với môi trường Potato dextrose salt: chuẩn bị môi trường M5 thêm: 7.5% NaCl) Chất chiết khoai tây 20% (v/v) Dextrose 2% Agar 2% Nước đủ 1000ml - M6 (môi trường thạch malt) Lấy 250g malt, nghiền nhỏ, hoà vào 1000ml nước cất Dùng đũa thủy tinh khuấy gia nhiệt từ từ, đến 45 – 50oC, giữ nhiệt độ 30 phút Sau nâng nhiệt độ lên 65 – 68oC, có khuấy, trình đường hóa xảy hoàn toàn (không thấy màu xanh xuất thử dịch cháo với dung dịch Lugol) Lọc tách bã qua vải thô (hay gòn thấm nước), đem hấp phần dịch 121oC / 30 phút, lấy để lắng Lọc bỏ kết tủa, pha loãng để đạt – 8o Brix, thêm 2% agar, đun khuấy thạch tan hết Cho môi trường thạch vào dụng cụ chứa, hấp tiệt trùng 121oC / 15 phút - M7 (môi trường BGBL 2% Broth – dạng pha sẵn) Peptic digest of animal tissue 1% Lactose 1% Oxygall 2% Brilliant green 0.0133g/L Dùng 40g hỗn hợp pha sẵn để pha thành 1000ml môi trường - M8 (môi trường Plate Count Agar – ATCC medium 1048): 1000ml Agar 150 g Yeast extract 2.5 g Trypton 5g Glucose 1.0g - M9 (môi trường LST - Lauryl Sufate Broth/Lauryl Trypton Broth): 1000ml Trypton 20 g Lactose 5g NaCl 5g 2.75 g K2HPO4 2.75 g KH2PO4 Sodium lauryl sufate 0.1 g pH 6.8 ± 0.2 Nước Đủ 1000ml - M10 (Môi trường VRBL- Crystal Violet neutral Red Bile Lactose agar): Pepton 7g Neutral Red 0,03g Yeast Extract 3g Crystal Violet 0,002g Lactose 10g Agar 15g NaCl 5g Nước đến 1000 ml Muối mật 1,5g Hòa tan thành phần nước, để yên vài phút, đặt lên bếp đun sôi khuấy đều, để sôi 2-5 phút Làm nguội đến 45oC để sử dụng Chú ý: - Không để sôi lâu - Không tiệt trùng môi trường - Pha chế xong sử dụng vòng TÀI LIỆU THAM KHẢO Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm – Trần Linh Thước – Nhà xuất Giáo dục, 2003 Thực tập Vi sinh vật học thực phẩm – Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Chúc, Lê Văn Việt Mẫn – Đại học Bách Khoa TP.HCM Thí nghiệm Vi sinh vật học thực phẩm – Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương – Nhà xuất Đại học quốc gia TP.HCM, 2006 Handbook of Microbiologycal Media for the Examination of Food – Ronald M Atlat – CRC Press, Taylor &Francis Group, 2006 Laboratory Manual of Food Microbiology for Ethiopian health and Nutrition Research Institute – Dr Ciira Kiiyukia – Unido project, 2003 Food Microbiology Laboratory Manual – Professor Nagendra Shah – School of Molecular Sciences Victoria University, 2004