THỰC HÀNH PHÂN TÍCH HÓA LÝ THỰC PHẦM

BÀI 1: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITRIT, NITRAT TRONG MẪU RAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV VIS BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG FE TRONG SỮA VÀ NƯỚC MẮM BẰNG PHƯƠNG PHÁP UVVIS BÀI 3:XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG Fe VÀ Mn BẰNG PHƯƠNG PHÁP ASS Bài 4: PHƯƠNG PHÁP CHUẨN XÁC ĐỊNH ACID BENZOIC – AICD SORBIC BẰNG KỸ THUẬT HPLC BÀI 5: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFEIN TRONG THỰC PHẨM

BÀI 1: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITRIT, NITRAT TRONG MẪU RAU BẰNG

Quá trình tổng hợp này diễn ra theo 2 bước:

Bước 1: Sự tạo thành muối diazonium từ phản ứng giữa HNO2 và muối của amin thơmbậc nhất

Bước 2: Sự ghép cặp muối của diazonium là tác nhân than điện tử với hợp chất thơm cótính than hạch tương đối cao như các amin,phenol để tạo hợp chất azo có màu

Đầu tiên nitrit phản ứng với axit sunfanilic tạo thành muối điazo:

Sau đó muối này phản ứng với α- naphtylamin tạo thành hợp chất azo có màu hồng

II Thiết bị, dụng cụ, hoá chất:ơ

Cân phân tích có độ chính xác 0,1mg Cốc thuỷ tinh 50ml, 100ml, 200ml

Máy xay hoặc đồng nhất Ống đong 100ml

Bếp điện

Quả bóp cao suBình tia

Phễu thuỷ tinhGiấy lọc

Hoá chất:

 Dung dịch kali ferrocyanua trihydrat 10 % hòa tan 10,6g kali ferrocyanua trihydrat

vào nước,pha loãng tới 100ml với nước (thuốc thử 1)

 Dung dịch kẽm acetat dihydrat 21,9 % : hòa tan 21,9g kẽm acetat dihydrat trong

nước,thêm 2ml acid acetic băng và pha loãng tới 100ml với nước (thuốc thử 2)

 Dung dịch dinatri tetraborat decahydrat 5 % : hòa tan 50 g dinatri tetraborat

decahydrat trong 1000ml nước (thuốc thử 3)

 Dung dịch sulphanilamin 0,2% Cách pha: hoà tan 2g sulphanilamin trong 800ml

nước nóng, lọc, thêm 100ml acid hydrochloric đặc, khuấy kỹ và pha loãng tới

1000ml với nước cất (thuốc thử 4).

 Dung dịch N-1 naphthylethylen diamin dihydrochlorua 0,1% Cách pha: hoà tan

0,25g N-1 naphthylethylen diamin dihydrochlorua trong nước Pha loãng tới

250ml với nước cất Bảo quản trong lọ nâu nút kín và giữ trong tủ lạnh (thuốc thử 5).

 Dung dịch acid HCL 18,9 % Cách pha: pha loãng 445ml acid hydrochloric đặc

tới 1000ml với nước (thuốc thử 6)

 Dung dịch chuẩn gốc natri nitrit nồng độ 1000mg/l Cách pha: hoà tan 1g natri

nitrit trong nước và pha loãng tới 1000ml (thuốc thử 7).

 Dung dịch làm việc natri nitrit nồng độ 50mg/l Cách pha: pha loãng 5ml dung

dịch gốc tới 1000ml với nước (thuốc thử 8).

 Dung dịch dihydrogen dinatri ethylene diamine tetra acetat dihydrat 1% Cách

pha: hoà tan 20ml acid hydrochloric đặc với 500ml nước cất, thêm 10g

dihydrogen dinatri ethylene diamine tetra acetat dihydrat và 55ml dung dịch

aminiac đặc Pha loãng tới 1000ml với nước Chỉnh pH = 9,6 – 9,7 (thuốc thử 9).

 Cadimi kim loại (thuốc thử 10).

III Cách tiến hành:

1 Chuẩn bị mẫu: Chiết nitrit và nitrat từ sản phẩm thịt

Lấy 200g mẫu đại diện của mẫu, đồng nhất mẫu bằng cách dùng dao xắt nhuyễn.Cân chính xác khoảng 9g-10g mẫu đã đồng nhất vài bình tam giác và thấm ướt với 5ml

dung dịch thuốc thử borax (thuốc thử 3)cho vào cốc 200ml, thêm vào 150 ml nước cất

đun nóng (>70oC) Đun trong nồi cách thuỷ sôi khoảng 30 phút để chiết nitrit và nitrattrong mẫu thịt Để nguội, cho vào bình định mức 250ml và thêm tuần tự 2ml thuốc thử 1sau đó 2ml thuốc thử 2 và lắc Định mức tới vạch bằng nước cất Để dung dịch trong 30phút sau đó chắt cẩn thận lớp chất lỏng ở trên, lọc qua giấy lọc (không có nitrit và nitrat),thu lấy dịch lọc trong

2 Xây dựng đường chuẩn:

Hút lần lượt 0; 5; 10; 20 và 25ml dung dịch chuẩn gốc natri nitrit nồng độ 50mg/lcho vào 5 bình định mức 100ml, các dung dịch này có nồng độ tương ứng là 0; 2,5; 5,0;7,5 và 10mg/l natri nitrit, sử dụng dung dich này để xây dựng đường chuẩn như sau:

Hút 10ml mỗi dung dịch chuẩn cho vào các bình định mức 100ml tương ứng,thêmkhoảng 50ml nước cất, 10ml thuốc thử 4 và 6ml thuốc thử 6 vào mỗi bình.để dung dịchnày vào bóng tối trong 5 phút Tiếp thêm 2ml thuốc thử 5 vào và trộn đều hỗn hợp, đểvào chỗ tối 3 phút Pha loãng dung dịch tới vạch mức bằng nước cất nồng độ nitrit củacác dung dịch này sẽ là 0 ;0,25 ;0,5 ;0,75 ;1,0 ml/l trộn đều hỗn hợ và đo độ hấp thu ởbước sóng 538nm

3 Định lượng nitrit:

Hút 10ml dịch lọc từ mẫu thịt cho vào bình định mức 100ml Thêm vào khoảng

50ml nước cất, , 10ml thuốc thử 4 và 6ml thuốc thử 6 vào mỗi bình Để dung dịch này trong chỗ tối 5 phút Tiếp theo thêm 2ml thuốc thử 5 vào và lắc đều hỗn hợp, để vào chỗ

tối 3 phút Sau 3 phút lấy ra và định mức tới vạch bằng nước cất, lắc đều hỗn hợp và đo

độ hấp thu ở bước sóng 538nm Căn cứ vào đường chuẩn dung dịch đo được có nồng độ

Cx (mg/l)

4 Đối với mẫu để định lượng nitrat:

Hút 5ml thuốc thử 9 và khoảng 1g cadimi ướt cho vào bình định mức 100ml, chocadimi vào bình định mức bằng phễu nhỏ và sử dụng một lượng nhỏ nước cất tráng phễu.Thêm 25ml dịch lọc, đậy nút và lắc đều trong 10 phút trên máy lắc Pha loãng tới vạchbằng nước cất, trộn thật kỹ hỗn hợp và để yên khoảng 10 phút cho cadimi lắng Hút 20mlcủa dung dịch này (đã xử lý với cadimi để khử nitrat thành nitrit) cho vào bình định mức100ml và tạo màu như xác định nitrit ở trên

2 Vẽ phương trình hồi qui tuyến tính.

Từ kết quả Abs đã đo được vẽ phương trình hồi qui tuyến tính thể hiện mối tươngquan giữa nồng độ và độ hấp thu

3 Tính kết quả:

Căn cứ vào độ hấp thu của dung dịch mẫu từ đường chuẩn, tính ra nồng độ nitrat

và nitrit trong mẫu Ta có Abs của mẫu 1 là 0.002, mẫu 2 là 0.0007 và phương trình

đường chuẩn có dạng y = 0.2481x - 0.0047 với R2 = 0.9990 từ đó ta có thể tính đượcCx1 ,Cx2 của mẫu bằng cách thế vào phương trình đường chuẩn:

Hàm lượng nitrit trong mẫu = (tổng nitrit sau khi khử nitrat-nitrit trước khi khử nitrat).

=>Hàm lượng nitrit trong mẫu = 1.5825 – 0.3375 = 1.2450 (mg/kg)

Trong đó:

CX1: Nồng độ nitrit trong mẫu tính theo đường chuẩn (mg/l)

CX2: Nồng độ tổng nitrit trong mẫu sau khi khử nitrat tính theo đường chuẩn (mg/l)

m :khối lượng mẫu lấy phân tích

4 Nhận xét:

So với Thông tư 27/2012/BYT thì hàm lượng muối Nitrit và muối Nitrat khôngvượt quá giới hạn quy định của thông tư là 168 mg/kg Hàm lượng nitrit trong mẫu1.2450 (mg/kg) , Vậy hàm lượng nitrit trong mẫu đạt mức cho phép

R2 của đường chuẩn đáng tin cậy (R2 = 0.9990)

Các kết quả có độ tin cậy không cao do quá trình chuẩn bị mẫu và đo độ hấp thu

có sai số

BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG FE TRONG SỮA VÀ NƯỚC MẮM BẰNG PHƯƠNG

PHÁP UV-VIS.

I Nguyên tắc:

Fe(II) trong dung dịch, kết hợp với 1,10-phenaltroline thành một phức chất màucam đỏ bền trong môi trường pH 3-9 Nếu muốn màu này không bị ảnh hưởng của thuốcthử dư và có mặt của các ion khác, phản ứng cần tiến hành ở pH 3,5-4,5

Phức chất này gồm 3 phân tử 1,10-phenaltroline kết hợp với 1 ion Fe(II) Phảnứng đặc hiệu cho Fe(II) nên phải chuyển hết Fe(III) về Fe(II) bằng cách khử vớihydroquinone hay hydroxylamine clohydic

2NH2OH + 4Fe3+ N2O + 4Fe2+ + 4H+ + H2O

II Thiết bị, dụng cụ, hoá chất:

Máy UV-Vis Bình định mức 50ml, 100ml,

250ml, 500ml, 1000ml

Dung dịch hydroxylamine clohydric 1%

Cân phân tích Cốc thuỷ tinh 50ml, 100ml,200ml Dung dịch đệm pH 4,0

Cân kĩ thuật Ống đong 100ml Dung dịch 1,10-phenalthroline 0,1%Bếp điện Chai lọ đựng thuốc thử Dung dịch HCl tinh khiết

Lò nung Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml Dung dịch HCl 20%

2+ chuẩn

Phễu thuỷ tinh

Dung dịch hydroxylamine clohydric 1%

II Cách tiến hành.

1 Chuẩn bị mẫu:

Đồng nhất mẫu và cân chính xác 1g mẫu sữa cần phân tích, sau đó tiến hành vô cơhoá trên bếp điện đến khi than hoá đen, nung thành tro trắng ở nhiệt độ 500oC trongkhoảng 2g giờ Hoà tan tro bằng 5ml HCl tinh khiết , đun cách thuỷ tới khô ở nồi cáchthuỷ sôi Làm lại lần thứ 2 như trên và thứ 3 hòa tan trong 5ml HCl 20%, Lọc trên giấylọc không tro Rửa nhiều lần cặn, giấy lọc, chén nung và phễu bằng nước cất nóng để thuđược hết lượng mẫu Dịch lọc và nước rửa cho tất cả vào bình định mức 100ml, thêmnước cất đến khoảng 80-90ml Điều chỉnh đến pH 3.5 -4.5 bằng CH3COONa 2M rồi vớiCH3COONa 0.2M Sau đó cho them nước cất tới vạch và lắc đều

2 Xây dựng đường chuẩn:

Dung dịch Fe chuẩn có nồng độ 1000ppm nên pha loãng xuống nồng độ 10ppm để

dễ dàng phân tích Hút 1ml dung dịch Fe chuẩn 1000ppm cho vào bình định mức 100ml,định mức tới vạch sau đó lắc đều, ta được dung dịch sắt chuẩn 10ppm để xây dựng đườngchuẩn Hút lần lượt 0; 1; 2; 3 và 4ml dung dịch Fe chuẩn 10ppm vào các bình định mức

đã chuẩn bị sẵn thêm vào mỗi bình 1ml hydroxylamine 10% và lắc đều, tiếp theo thêmvào 5ml đệm pH 5, 1ml 1,10-phenontroline 0.1% vào từng bình, lắc nhẹ và để yên trong

5 phút, sau đó dùng nước cất định mức tới vạch ta được nồng độ tương ứng mỗi bình là0; 0.2; 0.4; 0.6 và 0.8ppm Mang các bình định mức đo độ hấp thu ở λ = 510nm

III KẾT QUẢ

1 Kết quả đo quang:

2 Vẽ phương trình hồi qui tuyến tính:

Từ kết quả Abs đã đo được vẽ phương trình hồi qui tuyến tính thể hiện mối tươngquan giữa nồng độ và độ hấp thu

3 Tính kết quả:

Căn cứ vào độ hấp thu của dung dịch mẫu từ đường chuẩn, tính ra nồng độ Fe(II)

Ta có Abs của mẫu là 0,002 và phương trình đường chuẩn có dạng với R2 = 0.9997 từ đó

ta có thể tính được Cx của mẫu bằng cách thế vào phương trình đường chuẩn:

AOAC Official Method 965.09 Nutrients (Minor) in Fertilizers, Atomic AbsorptionSpectrophotometric Method.

AOAC Official Method 929.02 Preparation of Fertilizers Test Sample

Dung dịch chuẩn:

a.Dung dịch chuẩn gốc 1000 ± 2mg/l, Merck

b Dung dịch chuẩn thứ cấp

b.1.1 Dung dịch chuẩn Cu,Fe 100mg/l

Hút 10ml dung dịch chuẩn gốc 1000mg/l vào bình mức 100ml Định mức đến vạch bằngacid nitric 0.1N

Hút 10ml dung dịch chuẩn gốc 1000 μmg/l vào bình mức 100ml Định mức đến vạch

Vẽ phương trình hồi qui tuyến tính:

Từ kết quả Abs đã đo được vẽ phương trình hồi qui tuyến tính thể hiện mối tươngquan giữa nồng độ và độ hấp thu

2 Bảo quản

a Tất cả các dung dịch chuẩn phải được bảo quản trong ống thủy tinh có nắp đậy kín

và đặt nơi thoáng mát,khô ráo,không có ánh sáng chiếu trực tiếp vào, nhiệt độ không quá

300C

b Thời gian sử dụng của dung dịch chuẩn gốc tùy thuộc vào nhà sản xuất

c Dãu chuẩn làm việc pha và sử dụng trong ngày

d Chuẩn thứ cấp chỉ pha lại khi xây dựng đường chuẩn mới

3 Điều kiện phân tích

Theo thông số của máy

F TÍNH KẾT QUẢ

Ta có phương trình y = 0,0805x + 0,0118 → x=( 0,3976 -0,0118)/0,0805 = 4,79 mg/lVậy nồng độ kim lại Fe tính từ đường chuẩn bằng 4,79 mg/l

Hàm lượng kim loại Fe trong mẫu

C ( mg/kg ) = ( 4,79∗50 1 ∗ 50 ) =

Trong đó:

- C: Nồng độ kim loại Fe trong mẫu, tính theo mg/kg

- Cd/c: nồng độ kim lại M tính từ đường chuẩn mg/l

- m: khối lượng mẫu (g)

Hàm lượng Fe trong sữa bột là 239,5 mg/kg

Bài 4: PHƯƠNG PHÁP CHUẨN XÁC ĐỊNH ACID BENZOIC – AICD SORBIC

BẰNG KỸ THUẬT HPLC

I Nguyên lý

Aicd sorbic, acid benzoic được tách chiết ra khỏi thực phẩm bằng phương phápthủy phân với NaOH trước và sau đó tách chiết methanol Hàm lượng acid sorbic, acidbenzoic được xác định bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao cấp (HPLC) Giới hạn phát hiện củaphương pháp với benzoic acid là 2mg/kg (2ppm) và acid sorbic là 6mg/kg (6ppm) ở bướcsóng λ = 230nm.

II Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị

 Acid benzoic tinh khiết 99% trở lên

 Acid sorbic tinh khiết 99% trở lên

Pha dung dịch chuẩn ban đầu

Chuẩn bị dung dịch ban đầu 1mg/ml: Cân chính xác 0,1g của mỗi loại chuẩn trêncho vào cốc có mỏ 50ml, hóa tan trong 2 – 3ml methanol cho đến khi tan hoàn toàn.Chuyển vào bình định mức 100ml, tráng rửa cốc và thêm nước cất đến vạch định mức(chỉ pha khi dùng)

Dung dịch chuẩn trong ngày

Cho lần lượt vào 5 bình định mức 100ml dung dịch chuẩn ban đầu như sau:

 Methanol dùng cho sắc ký lỏng (độ tinh khiết >99%)

 Acid phosphoric: có chứa hàm lượng H3PO4 98%

 Natri hydroxyd (NaOH): dùng loại tinh khiết phân tích có chứa hàm lượng kiềmtoàn phần không nhỏ hơn 97% tính theo NaOH và không được có quá 2% Na2CO3

 Dung dịch NaOH 1N

Hòa tan 45g NaOH trong 100ml nước lắc cho tan hoàn toàn Đậy kín bình chứabằng nút cao su, để yên 1 ngày rồi gạn lấy dung dịch trong ở phía trên và pha loãng vớinước cất mới đun sôi để nguội đến vừa đủ 1 lít

 Dung dịch NaOH 0,1N

Hòa tan 4,5g NaOH trong 100ml nước lắc cho tan hoàn toàn Đậy kín bình chứabằng nút cao su, để yên 1 ngày rồi gạn lấy dung dịch trong ở phía trên và pha loãng vớinước cất mới đun sôi để nguội đến vừa đủ 1 lít

 Acid sunfuric (H2SO4): tinh khiết phân tích có chứa hàm lượng H2SO4 khoảng96%

 Dung dịch H2SO4 10%:

Cho từ từ, cẩn thận và khuấy nhẹ 6ml acid sunfuric vào 50ml nước Làm nguội định mứcnước vừa đủ 100ml

 Kali fericyanid K3Fe(CN)6

Sử dụng loại tinh khiết phân tích có chứa hàm lượng K3Fe(CN)6 từ 98% trở lên

 Pha dung dịch K3Fe(CN)6

Hòa tan 10,6g K3Fe(CN)6 trong 50ml nước lắc cho tan hoàn toàn, định mức nướcvừa đủ 100ml

 Pha dung dịch kẽm acetat (CH3COO)2Zn 1M

Hòa tan 21,9g (CH3COO)2Zn trong 50ml nước và 3,2ml acid acetic lắc cho tanhoàn toàn Định mức vừa đủ 100ml

 Dikali hydrophosphat K2HPO4: tinh khiết phân tích có chứa hàm lượng K2HPO4 từ98% trở lên

 Dung dịch Carreez I 10 -15%: cân 15g K4(Fe(CN)6).3H2O, hòa tan bằng nước cất

và định mức 100ml

 Dung dịch Carreez II 30%: Cân 30g kẽm sunphat (ZnSO4.7H2O), hòa tan bằngnước cất và định mức 100ml

 Pha dung dịch K2HPO4 dùng làm pha động:

Hòa tan 2,5g K2HPO4 trong 500ml nước cất mới đun sôi để nguội đến khi hóa tanhoàn toàn, thêm nước cất đến khoảng 980ml, điều chỉnh pH = 6,7 bằng H3PO4 , vừa đủbằng 1 lít nước cất, lọc qua giấy lọc 0,45µl

1 Chuẩn bị mẫu

 Đối với mẫu là thực phẩm dạng lỏng:

Hút chính xác 20-50 ml mẫu cho vào cốc có mỏ 250ml, thêm 2,5ml NaOH 1N thủyphân cách thủy trong nước ở 700C trong 30 phút, làm nguội về nhiệt độ phòng và chuyểnvào bình định mức 100ml, trung hòa mẫu bằng H2SO4 10% với chỉ thị phenolphthaleinđến khi mẫu mất màu hoàn toàn (pH của mẫu lúc này khoảng 8) Thêm 2 ml dung dịchkali fericyanid, lắc, thêm 2ml dung dịch kẽm acetat để loại tạp Dùng methanol tráng rửacốc cho vào bình định mức, lắc kỹ và làm vừa đủ 100ml bằng methanol Lọc mẫu quagiấy lọc thường, sau đó lọc qua giấy lọc 0,45µm để loại tạp trước khi bơm vào máy

 Đối với mẫu là thực phẩm dạng rắn:

Cân chính xác 5-10g mẫu đã được đồng nhất và xay nhỏ cho vào cốc có mỏ 250ml,thêm 25ml NaOH 0,1N, thủy phân cách thủy trong nước ở 700C trong vòng 30 phút, làmnguội về nhiệt độ phòng và chuyển vào bình định mức 100ml, trung hòa mẫu bằng H2SO410% với chỉ thị phenolphthalein đến khi mẫu mất màu hoàn toàn (pH của mẫu lúc nàykhoảng 8) Thêm 2 ml dung dịch kali fericyanid, lắc, thêm 2ml dung dịch kẽm acetat đểloại tạp Dùng methanol tráng rửa cốc cho vào bình định mức, lắc kỹ và làm vừa đủ100ml bằng methanol Lọc mẫu qua giấy lọc thường, sau đó lọc qua giấy lọc 0,45µm đểloại tạp trước khi bơm vào máy

Xử lí mẫu kham khảo

- Với mẫu dạng lỏng: hút chính xác 5-20 ml mẫu vào ống li tâm 50ml Thêm 2mldung dịch Carreez I, 2ml đung dịch Carreez II và 2ml dung dịch (CH3COO)2Zn1M

- Sau đó tất cả đem lắc Vortex và định mức thành 50ml tiếp tục lắc Vortex, lọc mẫuqua giấy lọc thường và lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi bơm vào HPLC

2 Điều kiện máy

Mẫu sau khi qua màng lọc 0.45

và dãy chuẩn

Bơm 20 vào máy sắc kí (HPLC)Detecter UV (λ = 230nm)

Ghi độ hấp thụ

- Pha động: dung dịch dikali hydrophosphat: methanol (90:10)

- Thời gian chạy: 10 phút

3 Tiến hành đo mẫu

Chú ý Nếu mẫu phân tích cho chiều cao pic ở thời gian lưu khoảng 4 phút quá thấp nên

phân tích lại và đo ở λ = 193nm để xác định riêng acid benzoic

Nếu mẫu phân tích cho chiều cao pic ở thời gian lưu khoảng 5 phút quá thấp nên phântích lại và đo ở λ = 254nm để xác định riêng acid benzoic

Trong trường hợp này giới hạn xác định có thể tăng đến 10 lần

Sơ đồ tóm tắt quy trình xét nghiệm