Phân lập và nuôi cấy Bacillus subtilis sản xuất protease

Việc bổ sung chế phẩm enzyme vào khẩu phần ăn sẽ giúp cho gia cầm hấp thu tốt các thành phần dinh dưỡng, gia tăng lợi nhuận cho người chăn nuôi. Trong một nghiên cứu nhằm tạo ra một chế phẩm protease có thể hoạt động tốt trong diều gia cầm và giữ được hoạt tính với nhiệt độ cao trong quá trình ép viên, chúng tôi nhận thấy chủng Ba15 có hoạt tính protease cao nhất và bền nhiệt trong số 15 chủng Bacillus subtilis nghiên cứu. Chủng Ba15 sinh tổng hợp protease tốt nhất khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn có thành phần 2 bã đậu nành: 8 bột bắp; pH dịch khoáng 6,8 và thời gian nuôi cấy là 72 giờ. Chế phẩm thu được trên qui mô sản xuất nhỏ có hoạt tính protease 14,16 UIg. Enzyme protease của chế phẩm hoạt động được trong khoảng pH 5,8 – 8,0, phù hợp với điều kiện pH của diều gia cầm. Khi xử lí chế phẩm ở nhiệt độ 150oC trong thời gian 1 phút, hoạt tính protease giữ được 94,3%. Bổ sung chế phẩm vào thức ăn dạng viên với tỉ lệ từ 0,1 – 0,5 %, sau 7 tuần nuôi, trọng lượng gà ri tăng trung bình từ 25 – 30% so với lô đối chứng. Kết quả nghiên cứu này cho thấy có thể sử dụng chế phẩm vào việc sản xuất thức ăn viên cho gia cầm.

Trang 1

VIỆN CNSH & MT - -

BÁO CÁO TH CÔNG NGHỆ VI SINH VẬT

Đề tài : PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY BACILLUS

SUBTILIS SẢN XUẤT PROTEASE

GVHD : Th.S NGUYỄN THỊ KIM CÚC SVTH : Nhóm 6

1 Nguyễn Thị Thanh Tuyền

2 Huỳnh Thị Hậu

3 Nguyễn Mạnh Tường

4 Đặng Thị Kim Hường Lớp : 54CNSH

Nha Trang, tháng 05 năm 2015

Trang 2

Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 2 of 17

MỤC LỤC

DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ 3

LỜI NÓI ĐẦU 4

1 Dụng cụ, hóa chất, môi trường tổng hợp phân lập 5

1.1 Thiết bị và dụng cụ 5

1.2 Hóa chất 5

1.3 Môi trường 5

2 Nguồn phân lập 6

3 Quy trình phân lập 6

3.1 Cách lấy mẫu 6

3.2 Phân lập 6

3.2.1 Nhuộm Gram 9

3.3 Giữ giống 10

3.3.1 Kiểm tra đặc điểm sinh hóa 11

4 Quy trình sản xuất protease 14

4.1 Lên men 14

4.2 Thu enzyme protease 14

4.3 Tinh sạch enzyme 14

4.4 Thử hoạt tính protease với casein 15

5 Thảo luận 16

TÀI LIỆU THAM KHẢO 17

Trang 3

DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ

Sơ đồ 1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất .7

Hình 1 Phân lập vi khuẩn Bacilluss subtilis .8

Hình 2 Khuẩn lạc B subtilis cấy trang .8

Hình 3 Cấy tia khuẩn lạc B subtilis .9

Hình 4 ết quả nhuộm Gram 10

Hình 5 Ống giống 10

Hình 6 ết quả test catalase 11

Hình 7 ết quả test Casein 12

Hình 8 ết quả test Simmons Citrate (-) 13

Hình 9 ết quả test MR – VP Kết quả (+) 14

Hình 10 ết quả kiểm tra hoạt tính enzyme 16

Trang 4

LỜI NÓI ĐẦU

Với mục tiêu tạo ra 100 ml protease Hiểu rõ hơn quy trình sản xuất

protease từ Bacillus subtilis Với các kỹ thuật cơ bản cùng với điều kiện cơ sở vật

chất phòng thí nghiệm trường Đại Học Nha Trang, nhóm đã phân lập và nuôi cấy

thành công chủng Bacillus subtilis phục vụ sản xuất protease

- Protease là nhóm enzym được sử dụng nhiều trong các lĩnh vực như: nông nghiệp, công nghiệp, thực phẩm

- Nghiên cứu về protease vẫn còn là một lĩnh vực mới mẻ nhưng có rất nhiều triển vọng ở nước ta

- Có thể thu nhận protease từ nhiều nguồn khác nhau như từ thực vật, từ nội tạng động vật, từ vi sinh vật Trong đó protease từ vi sinh vật nhất là từ

Bacillus subtilis có nhiều triển vọng vì Bacillus subtilis có khả năng sản xuất

protease có hoạt tính cao và có nhiều ưu thế hơn hẳn

- Sơ lược về Bacillus subtilis Giới : Bacteria, Nghành: Firmicutes, Lớp:

Bacilli, Bộ: Bacillales, Họ: Bacillaceae, Chi: Bacillus

Trang 5

ẢN XUẤT PROTEASE TỪ BACILLUS SUBTILIS PHÂN

LẬP TỪ NGUỒN ĐẤT VEN BIỂN ỨNG DỤNG PHÂN GIẢI PROTEIN VỎ TÔM TRONG SẢN XUẤT CHITIN – CHITOSAN

1 Dụng cụ, hóa chất, môi trường tổng hợp phân lập

1.1 Thiết bị và dụng cụ

 Thiết bị

Tủ sấy, máy hấp tiệt trùng (autoclave), tủ lạnh, cân điện tử, máy lắc

(vortex), lò vi sóng, kính hiển vi, đèn cực tím, …

 Dụng cụ

Đĩa petri, ống nghiệm, giá để ống nghiệm, que cấy, đèn cồn, giấy đo pH, bình tam giác, bacher, micropipette, đũa khuấy thủy tinh, ống đong, que trang,…

Tất cả các dụng cụ thủy tinh dùng để nuôi cấy vi sinh vật đều được xử lý sạch, bao gói và hấp tiệt trùng ở 1210C/15ph

1.2 Hóa chất

 Hóa chất cơ bản: cồn, NaOH 1N, HCl 1%, NaCl, acid acetic,…

 Hóa chất dùng trong khảo sát các đặc điểm sinh hóa: NaOH 40%, α -naphtol 10%, acid sulfanilic,…

 Thuốc thử owac’s, Methyl-Red,…

 Thuốc dùng cho phương pháp nhuộm Gram

1.3 Môi trường

Sử dụng các môi trường nuôi cấy tổng hợp sau:

 Môi trường giữ giống và đếm số lượng tế bào: TSA (Trypticase Soya Agar) gồm 3g TSB, 100 ml nước cất, 1,5 g agar

S

Trang 6

 Môi trường khảo sát các đặc điểm sinh hóa: TSB (Trypticase Soya Broth), Clark Clubs, Simon Citrate agar, môi trường lòng đỏ trứng, môi trường Nitrate, môi trường lên men đường Maltose,…

 Môi trường tăng sinh Nutrien Broth

Thành phần: Cao thịt 3g, Pepton 5g Nacl 5g, Agar 18g, 1000 ml nước cất 2x

 Môi trường tăng sinh Nutrien Agar

Thành phần: Trypton 10g, NaCl 5g, Meat extract 5g, nước cất 2x

2 Nguồn phân lập

Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc, chúng được phân bố hầu hết trong tự nhiên Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis (Vũ Thị Thứ, 1996)

3 Quy trình phân lập

3.1 Cách lấy mẫu

Gạt bỏ lớp đất mặt khoảng 2 - 3cm, lấy lớp đất mặt ở dưới Cân 1g mẫu đất cho vào bình tam giác có chứa 9 ml nước muối sinh lý vô trùng và lắc đều, được nồng độ pha loãng 10-1

Đem đi gia nhiệt ở nhiệt độ 650C trong 15 phút để loại bớt vi khuẩn không sinh bào tử

Lấy 5 mẫu đất mỗi mẫu 1g đất cho vào 5 ống nghiệm, trong đó có 2 mẫu đất vườn (DV1, DV2) và ba mẫu đất biển (DB1, DB2, DB3)

3.2 Phân lập

Chuẩn bị 4 ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lí vô trùng, đánh số thứ

tự từ 1 đến 4 cho mỗi mẫu đất

Dùng micropipete hút 1 ml từ bình tam giác chứa mẫu đất phân lập có nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm 1 và lắc đều bằng máy vortex, được nồng độ pha loãng 10-2, tiếp tục làm cho đến ống nghiệm cuối cùng

Tiếp theo chọn các ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10-3 ,10-4, 10-5 dùng micropipete hút 0,1 ml từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA (mỗi

Trang 7

nồng độ lặp lại 2 lần) và trang đều bằng que trang vô trùng, sau đó cho những đĩa TSA này vào tủ ấm ủ ở 370

C/24h

Sau đó quan sát khuẩn lạc hình thành trên đĩa, chọn những khuẩn lạc nghi

ngờ là của vi khuẩn Bacillus subtilis khuẩn lạc nhăn,có vòng trong suốt xung

quanh, tâm có màu nâu đen càng để lâu màu nâu đen càng rõ, dùng que cấy vòng cấy ria phân lập trên môi trường TSA sau đó bắt và cấy giữ giống lại trên môi

trường TSA nghiêng

Sơ đồ 1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất

Trang 8

Hình 1 Phân lập vi khuẩn Bacilluss subtilis

Kết quả: mẫu DV1, DB1 có khuẩn lạc của B.subtilis mọc

Hình 2 Khuẩn lạc B subtilis cấy trang

Trang 9

Hình 3 Cấy ria khuẩn lạc B subtilis

3.2.1 Nhuộm Gram

Lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống TSA làm tiêu bản nhuộm Gram để quan sát dưới kính hiển vi, độ phóng đại 1000 lần

Các chỉ tiêu quan sát: Sự bắt màu, hình dạng, cách sắp xếp của tế bào vi khuẩn, có hay không có bào tử

Sau khi quan sát dưới kính hiển vi nếu thấy tiêu bản vi khuẩn nào phù

hợp với những đặc điểm sau của vi khuẩn Bacillus subtilis (như : Là trực khuẩn,

hai đầu tròn, G+, bắt màu tím, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào) thì tiếp tục thử phản ứng sinh hóa để khẳng định

Trang 10

Hình 4 Kết quả nhuộm Gram

3.3 Giữ giống

Chuẩn bị môi trường TSA nghiêng trong các ống nghiệm, cấy giữ giống nuôi ở 370

C trong 24h và đem đi bảo quản lạnh ở nhiệt độ 40

C

Hình 5 Ống giống

Trang 11

3.3.1 Kiểm tra đặc điểm sinh hóa

 Test catalase

Nhỏ vài giọt H2O2 vào sinh khối vi khuẩn đã phân lập trên đĩa peptri thấy xuất hiện sủi bọt

Hình 6 Kết quả test catalase

 Test Casein

Cách tiến hành:

 Chuẩn bị môi trường: Cân 5g Casein, 1,5g agar, trong 100ml nước cất

 Hấp môi trường và đổ thạch vào đĩa petri, để môi trường đông lại

 Dùng tăm bông lấy vi khuẩn từ mẫu DV1, DB1đã phân lập trước đó cấy vào đĩa petri

 Ủ ở 370C trong vòng 3 ngày

 Quan sát thấy có vòng trong suốt xung quanh đường cấy là kết quả dương tính

Kết quả: Cả hai mẫu DB1 và DV1 vi khuẩn đều có khả năng phân giải casein hình thành vòng phân giải tuy nhiên hoạt tính của chủng DV1 mạnh hơn so với chủng DB1 nên sử dụng DV1 để sản xuất protease

Trang 12

Hình 7 Kết quả test Casein

 Test simmons citrate

 Chuẩn bị môi trường: Cân 4,5g Simmons Citrate Agar (SCA) và 200ml nước cất vào trong bình tam giác, hấp khử trùng

 Môi trường SCA và chỉ thị bromothynol blue, pH < 6 màu vàng, pH trung tính màu xanh lục, pH > 7.6 màu xanh dương

 Cấy ria vi khuẩn lên môi trường SCA

C trong 24 – 48 h

 Kết quả:

o ( - ): hông có khuẩn lạc môi trường xanh lục

o (+): Có khuẩn lạc mọc môi trường màu xanh dương

Trang 13

Hình 8 Kết quả test Simmons Citrate (-)

 Test MR – VP

 Chuẩn bị môi trường: cân 1,7g MR –VP trong 100ml nước cất trộn

đều cho vào ống nghiệm hấp khử trùng

 Cấy vào mỗi ống các chủng vi khuẩn DV1, ủ ở 37oC trong vòng

24h

 Kiểm tra bằng thuốc thử:

o Test MR: Cho 2 đến 3 giọt methyl đỏ vào ống nghiệm thấy có xuất

hiện màu đỏ là dương tính

o Test VP: Sử dụng Napton và OH 40% cho vào ống nghiệm nuôi

cấy thấy có xuất hiện màu đỏ thẫm ở trên là dương tính

Trang 14

Hình 9 Kết quả test MR – VP Kết quả (+)

 Qua kết quả của các test khẳng định đó là chủng vi khuẩn B

subtilis

4 Quy trình sản xuất protease

4.1 Lên men

Cho vào 2 bình tam giác mỗi bình 1,5g TSB, 0,25g casein và 50 ml nước cất, đem đi hấp khủ trùng

Cấy chủng vi khuẩn thu từ DV1 vào hai bình tam giác trên, nuôi lắc ở nhiệt độ phòng trong 24h

4.2 Thu enzyme protease

Sau 24h nuôi cấy, thu dịch chứa enzyme bằng cách ly tâm với tốc độ

3500 rpm trong 45 phút

Thu dịch bỏ cặn chú ý thao tác nhẹ nhàng tránh xáo trộn cặn làm sinh khối bị lẫn vào enzyme

4.3 Tinh sạch enzyme

Trang 15

Sử dụng aceton để kết tủa với tỷ lệ 1 : 4 Trong 10ml dịch enzyme cho vào 40ml aceton trong vòng 60 phút trong điều kiện lạnh 40C

Sau đó đem đi ly tâm 3500 rpm trong vòng 15 phút thu cặn loại bỏ dịch Hòa cặn tỷ lệ 2 : 3 với đệm phosphat (pH = 7): 19,5ml NaH2PO4 0,2M

và 30,5ml Na2HPO4 0,2M

4.4 Thử hoạt tính protease với casein

 Chuẩn bị môi trường test: Cân 0,14g casein vào 1,5g agar trong 50ml nước cất, hấp khử trùng môi trường, đổ lên đĩa petri, để nguội

 Dùng đầu tuýp micropipet 1000µl tạo các giếng tròn trên đĩa thạch

 Cho 10µl enzyme vào trong mỗi giếng

 Ủ ở 370

C trong 24h

 Quan sát thấy có vòng phân giải xung quanh giếng, nếu vòng phân giải càng lớn hoạt tính protease càng mạnh

Kết quả: có hình thành vòng phân giải nhưng hoạt tình không mạnh Nguyên nhân: có thể do lượng enzyme thu được quá thấp vì thời gian kết tủa ngắn, enzyme chưa tủa hoàn toàn, đem ra môi trường enzyme mất hoạt tính

Trang 16

Hình 10 Kết quả kiểm tra hoạt tính enzyme

5 Thảo luận

 hó khăn:

 Trong quá trình kết tủa thu enzyme do thời gian kết tủa quá ngắn, hiệu quả kết tủa không cao hi ly tâm không thu được cặn và dịch chiết vẫn còn chứa protease chưa kết tủa

 Tiến hành thử hoạt tính của cả dịch và enzyme kết tủa

 Đề xuất

 Cần chú ý thao tác vô trùng cẩn thận, trong box cấy Trước khi sử dụng phải bật đèn UV để khử trùng

 Tất cả các mẫu không được bỏ đi khi chưa chắc chắn kết quả

 Dụng cụ, môi trường cần phải hấp khử trùng trước khi sử dụng

 Thời gian kết tủa phải đủ 60 phút tốc độ ly tâm cao để thu được tủa protease

Trang 17

TÀI LIỆU THAM KHẢO

- Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Hữu Phước (1996), Công nghệ vi sinh vật Tập 2: Vi sinh vật công nghiệp, TP Hồ Chí Minh, trường Đại Học Bách hoa

- Trần Linh Thước (2002), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm, NXB giáo dục, Hà Nội

- TS Phạm Quang Chinh, PGS.TS Biền Văn Minh, Cách xác đinh hoạt độ protease,

http://csdlkhoahoc.hueuni.edu.vn/data/baibao/14_cachxacdinhhoatdoprotease.pdf

[17/04/2015]

- Bùi Thị Phi (2007), hóa luận tốt nghiệp, Luanvan.co,

http://luanvan.co/luan-van/phan-lap-khao-sat-dac-diem-cua-vi-khuan-bacillus-subtilis-va-tim-hieu-kha-nang-sinh-enzyme-protease-amylase-cua-vi-khuan-2428/

[16/04/2015]

Định dạng
Số trang	17
Dung lượng	0,99 MB