Phân lập và nuôi cấy Bacillus subtilis sản xuất protease

Việc bổ sung chế phẩm enzyme vào khẩu phần ăn sẽ giúp cho gia cầm hấp thu tốt các thành phần dinh dưỡng, gia tăng lợi nhuận cho người chăn nuôi. Trong một nghiên cứu nhằm tạo ra một chế phẩm protease có thể hoạt động tốt trong diều gia cầm và giữ được hoạt tính với nhiệt độ cao trong quá trình ép viên, chúng tôi nhận thấy chủng Ba15 có hoạt tính protease cao nhất và bền nhiệt trong số 15 chủng Bacillus subtilis nghiên cứu. Chủng Ba15 sinh tổng hợp protease tốt nhất khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn có thành phần 2 bã đậu nành: 8 bột bắp; pH dịch khoáng 6,8 và thời gian nuôi cấy là 72 giờ. Chế phẩm thu được trên qui mô sản xuất nhỏ có hoạt tính protease 14,16 UIg. Enzyme protease của chế phẩm hoạt động được trong khoảng pH 5,8 – 8,0, phù hợp với điều kiện pH của diều gia cầm. Khi xử lí chế phẩm ở nhiệt độ 150oC trong thời gian 1 phút, hoạt tính protease giữ được 94,3%. Bổ sung chế phẩm vào thức ăn dạng viên với tỉ lệ từ 0,1 – 0,5 %, sau 7 tuần nuôi, trọng lượng gà ri tăng trung bình từ 25 – 30% so với lô đối chứng. Kết quả nghiên cứu này cho thấy có thể sử dụng chế phẩm vào việc sản xuất thức ăn viên cho gia cầm.

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CNSH & MT - - 1959 BÁO CÁO TH CÔNG NGHỆ VI SINH VẬT Đề tài : PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY BACILLUS SUBTILIS SẢN XUẤT PROTEASE GVHD : Th.S NGUYỄN THỊ KIM CÚC SVTH : Nhóm Lớp Nguyễn Thị Thanh Tuyền Huỳnh Thị Hậu Nguyễn Mạnh Tƣờng Đặng Thị Kim Hƣờng : 54CNSH Nha Trang, tháng 05 năm 2015 GVHD Th.S NGUYỄN THỊ KIM CÚC MỤC LỤC DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ LỜI NÓI ĐẦU Dụng cụ, hóa chất, môi trường tổng hợp phân lập 1.1 Thiết bị dụng cụ .5 1.2 Hóa chất .5 1.3 Môi trường Nguồn phân lập Quy trình phân lập .6 3.1 Cách lấy mẫu 3.2 Phân lập .6 3.2.1 3.3 Giữ giống 10 3.3.1 Nhuộm Gram Kiểm tra đặc điểm sinh hóa 11 Quy trình sản xuất protease 14 4.1 Lên men 14 4.2 Thu enzyme protease 14 4.3 Tinh enzyme 14 4.4 Thử hoạt tính protease với casein 15 Thảo luận 16 TÀI LIỆU THAM KHẢO 17 Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page of 17 GVHD Th.S NGUYỄN THỊ KIM CÚC DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ Sơ đồ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất Hình Phân lập vi khuẩn Bacilluss subtilis Hình Khuẩn lạc B subtilis cấy trang Hình Cấy tia khuẩn lạc B subtilis Hình ết nhuộm Gram 10 Hình Ống giống 10 Hình ết test catalase 11 Hình ết test Casein 12 Hình ết test Simmons Citrate (-) 13 Hình ết test MR – VP Kết (+) 14 Hình 10 ết kiểm tra hoạt tính enzyme 16 Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page of 17 GVHD Th.S NGUYỄN THỊ KIM CÚC LỜI NÓI ĐẦU Với mục tiêu tạo 100 ml protease Hiểu rõ quy trình sản xuất protease từ Bacillus subtilis Với kỹ thuật với điều kiện sở vật chất phòng thí nghiệm trường Đại Học Nha Trang, nhóm phân lập nuôi cấy thành công chủng Bacillus subtilis phục vụ sản xuất protease - Protease nhóm enzym sử dụng nhiều lĩnh vực như: nông nghiệp, công nghiệp, thực phẩm - Nghiên cứu protease lĩnh vực mẻ có nhiều triển vọng nước ta - Có thể thu nhận protease từ nhiều nguồn khác từ thực vật, từ nội tạng động vật, từ vi sinh vật Trong protease từ vi sinh vật từ Bacillus subtilis có nhiều triển vọng Bacillus subtilis có khả sản xuất protease có hoạt tính cao có nhiều ưu hẳn - Sơ lược Bacillus subtilis Giới : Bacteria, Nghành: Firmicutes, Lớp: Bacilli, Bộ: Bacillales, Họ: Bacillaceae, Chi: Bacillus Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page of 17 GVHD Th.S NGUYỄN THỊ KIM CÚC ẢN XUẤT PROTEASE TỪ BACILLUS SUBTILIS PHÂN LẬP TỪ NGUỒN ĐẤT VEN BIỂN ỨNG DỤNG PHÂN GIẢI PROTEIN VỎ TÔM TRONG SẢN XUẤT CHITIN – CHITOSAN S Dụng cụ, hóa chất, môi trƣờng tổng hợp phân lập 1.1 Thiết bị dụng cụ  Thiết bị Tủ sấy, máy hấp tiệt trùng (autoclave), tủ lạnh, cân điện tử, máy lắc (vortex), lò vi sóng, kính hiển vi, đèn cực tím, …  Dụng cụ Đĩa petri, ống nghiệm, giá để ống nghiệm, que cấy, đèn cồn, giấy đo pH, bình tam giác, bacher, micropipette, đũa khuấy thủy tinh, ống đong, que trang,… Tất dụng cụ thủy tinh dùng để nuôi cấy vi sinh vật đƣợc xử lý sạch, bao gói hấp tiệt trùng 1210C/15ph 1.2 Hóa chất  Hóa chất bản: cồn, NaOH 1N, HCl 1%, NaCl, acid acetic,…  Hóa chất dùng khảo sát đặc điểm sinh hóa: NaOH 40%, α naphtol 10%, acid sulfanilic,…  Thuốc thử owac’s, Methyl-Red,…  Thuốc dùng cho phương pháp nhuộm Gram 1.3 Môi trƣờng Sử dụng môi trường nuôi cấy tổng hợp sau:  Môi trường giữ giống đếm số lượng tế bào: TSA (Trypticase Soya Agar) gồm 3g TSB, 100 ml nước cất, 1,5 g agar Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page of 17 GVHD Th.S NGUYỄN THỊ KIM CÚC  Môi trường khảo sát đặc điểm sinh hóa: TSB (Trypticase Soya Broth), Clark Clubs, Simon Citrate agar, môi trường lòng đỏ trứng, môi trường Nitrate, môi trường lên men đường Maltose,…  Môi trường tăng sinh Nutrien Broth Thành phần: Cao thịt 3g, Pepton 5g Nacl 5g, Agar 18g, 1000 ml nước cất 2x  Môi trường tăng sinh Nutrien Agar Thành phần: Trypton 10g, NaCl 5g, Meat extract 5g, nước cất 2x Nguồn phân lập Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc, chúng phân bố hầu hết tự nhiên Phần lớn chúng cư trú đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g Đất nghèo dinh dưỡng vùng sa mạc, vùng đất hoang vi khuẩn Bacillus subtilis Nước bùn cửa sông nước biển có mặt bào tử tế bào Bacillus subtilis (Vũ Thị Thứ, 1996) Quy trình phân lập 3.1 Cách lấy mẫu Gạt bỏ lớp đất mặt khoảng - 3cm, lấy lớp đất mặt Cân 1g mẫu đất cho vào bình tam giác có chứa ml nước muối sinh lý vô trùng lắc đều, nồng độ pha loãng 10-1 Đem gia nhiệt nhiệt độ 650C 15 phút để loại bớt vi khuẩn không sinh bào tử Lấy mẫu đất mẫu 1g đất cho vào ống nghiệm, có mẫu đất vườn (DV1, DV2) ba mẫu đất biển (DB1, DB2, DB3) 3.2 Phân lập Chuẩn bị ống nghiệm chứa ml nước muối sinh lí vô trùng, đánh số thứ tự từ đến cho mẫu đất Dùng micropipete hút ml từ bình tam giác chứa mẫu đất phân lập có nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm lắc máy vortex, nồng độ pha loãng 10-2, tiếp tục làm ống nghiệm cuối Tiếp theo chọn ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10-3 ,10-4, 10-5 dùng micropipete hút 0,1 ml từ nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA (mỗi Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page of 17 GVHD Th.S NGUYỄN THỊ KIM CÚC nồng độ lặp lại lần) trang que trang vô trùng, sau cho đĩa TSA vào tủ ấm ủ 370C/24h Sau quan sát khuẩn lạc hình thành đĩa, chọn khuẩn lạc nghi ngờ vi khuẩn Bacillus subtilis khuẩn lạc nhăn,có vòng suốt xung quanh, tâm có màu nâu đen để lâu màu nâu đen rõ, dùng que cấy vòng cấy ria phân lập môi trường TSA sau bắt cấy giữ giống lại môi trường TSA nghiêng Sơ đồ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page of 17 GVHD Th.S NGUYỄN THỊ KIM CÚC Hình Phân lập vi khuẩn Bacilluss subtilis Kết quả: mẫu DV1, DB1 có khuẩn lạc B.subtilis mọc Hình Khuẩn lạc B subtilis cấy trang Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page of 17 GVHD Th.S NGUYỄN THỊ KIM CÚC Hình Cấy ria khuẩn lạc B subtilis 3.2.1 Nhuộm Gram Lấy sinh khối vi khuẩn từ ống TSA làm tiêu nhuộm Gram để quan sát kính hiển vi, độ phóng đại 1000 lần Các tiêu quan sát: Sự bắt màu, hình dạng, cách xếp tế bào vi khuẩn, có hay bào tử Sau quan sát kính hiển vi thấy tiêu vi khuẩn phù hợp với đặc điểm sau vi khuẩn Bacillus subtilis (như : Là trực khuẩn, hai đầu tròn, G+, bắt màu tím, đứng đơn lẻ thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả di động, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ tế bào vi khuẩn nằm tế bào) tiếp tục thử phản ứng sinh hóa để khẳng định Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page of 17 GVHD Th.S NGUYỄN THỊ KIM CÚC Hình Kết nhuộm Gram 3.3 Giữ giống Chuẩn bị môi trường TSA nghiêng ống nghiệm, cấy giữ giống nuôi 37 C 24h đem bảo quản lạnh nhiệt độ 40C Hình Ống giống Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 10 of 17 GVHD Th.S NGUYỄN THỊ KIM CÚC 3.3.1 Kiểm tra đặc điểm sinh hóa  Test catalase Nhỏ vài giọt H2O2 vào sinh khối vi khuẩn phân lập đĩa peptri thấy xuất sủi bọt Hình Kết test catalase  Test Casein Cách tiến hành:  Chuẩn bị môi trường: Cân 5g Casein, 1,5g agar, 100ml nước cất  Hấp môi trường đổ thạch vào đĩa petri, để môi trường đông lại  Dùng tăm lấy vi khuẩn từ mẫu DV1, DB1đã phân lập trước cấy vào đĩa petri  Ủ 370C vòng ngày  Quan sát thấy có vòng suốt xung quanh đường cấy kết dương tính Kết quả: Cả hai mẫu DB1 DV1 vi khuẩn có khả phân giải casein hình thành vòng phân giải nhiên hoạt tính chủng DV1 mạnh so với chủng DB1 nên sử dụng DV1 để sản xuất protease Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 11 of 17 GVHD Th.S NGUYỄN THỊ KIM CÚC Hình Kết test Casein  Test simmons citrate  Chuẩn bị môi trường: Cân 4,5g Simmons Citrate Agar (SCA) 200ml nước cất vào bình tam giác, hấp khử trùng  Môi trường SCA thị bromothynol blue, pH < màu vàng, pH trung tính màu xanh lục, pH > 7.6 màu xanh dương  Cấy ria vi khuẩn lên môi trường SCA  Ủ 35oC 24 – 48 h  Kết quả: o ( - ): hông có khuẩn lạc môi trường xanh lục o (+): Có khuẩn lạc mọc môi trường màu xanh dương Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 12 of 17 GVHD Th.S NGUYỄN THỊ KIM CÚC Hình Kết test Simmons Citrate (-)  Test MR – VP  Chuẩn bị môi trường: cân 1,7g MR –VP 100ml nước cất trộn cho vào ống nghiệm hấp khử trùng  Cấy vào ống chủng vi khuẩn DV1, ủ 37oC vòng 24h  Kiểm tra thuốc thử: o Test MR: Cho đến giọt methyl đỏ vào ống nghiệm thấy có xuất màu đỏ dương tính o Test VP: Sử dụng Napton OH 40% cho vào ống nghiệm nuôi cấy thấy có xuất màu đỏ thẫm dương tính Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 13 of 17 GVHD Th.S NGUYỄN THỊ KIM CÚC Hình Kết test MR – VP Kết (+)  Qua kết test khẳng định chủng vi khuẩn B subtilis Quy trình sản xuất protease 4.1 Lên men Cho vào bình tam giác bình 1,5g TSB, 0,25g casein 50 ml nước cất, đem hấp khủ trùng Cấy chủng vi khuẩn thu từ DV1 vào hai bình tam giác trên, nuôi lắc nhiệt độ phòng 24h 4.2 Thu enzyme protease Sau 24h nuôi cấy, thu dịch chứa enzyme cách ly tâm với tốc độ 3500 rpm 45 phút Thu dịch bỏ cặn ý thao tác nhẹ nhàng tránh xáo trộn cặn làm sinh khối bị lẫn vào enzyme 4.3 Tinh enzyme Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 14 of 17 GVHD Th.S NGUYỄN THỊ KIM CÚC Sử dụng aceton để kết tủa với tỷ lệ : Trong 10ml dịch enzyme cho vào 40ml aceton vòng 60 phút điều kiện lạnh 40C Sau đem ly tâm 3500 rpm vòng 15 phút thu cặn loại bỏ dịch Hòa cặn tỷ lệ : với đệm phosphat (pH = 7): 19,5ml NaH2PO4 0,2M 30,5ml Na2HPO4 0,2M 4.4 Thử hoạt tính protease với casein  Chuẩn bị môi trường test: Cân 0,14g casein vào 1,5g agar 50ml nước cất, hấp khử trùng môi trường, đổ lên đĩa petri, để nguội  Dùng đầu tuýp micropipet 1000µl tạo giếng tròn đĩa thạch  Cho 10µl enzyme vào giếng  Ủ 370C 24h  Quan sát thấy có vòng phân giải xung quanh giếng, vòng phân giải lớn hoạt tính protease mạnh Kết quả: có hình thành vòng phân giải hoạt tình không mạnh Nguyên nhân: lượng enzyme thu thấp thời gian kết tủa ngắn, enzyme chưa tủa hoàn toàn, đem môi trường enzyme hoạt tính Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 15 of 17 GVHD Th.S NGUYỄN THỊ KIM CÚC Hình 10 Kết kiểm tra hoạt tính enzyme Thảo luận  hó khăn:  Trong trình kết tủa thu enzyme thời gian kết tủa ngắn, hiệu kết tủa không cao hi ly tâm không thu cặn dịch chiết chứa protease chưa kết tủa  Tiến hành thử hoạt tính dịch enzyme kết tủa  Đề xuất  Cần ý thao tác vô trùng cẩn thận, box cấy Trước sử dụng phải bật đèn UV để khử trùng  Tất mẫu không bỏ chưa chắn kết  Dụng cụ, môi trường cần phải hấp khử trùng trước sử dụng  Thời gian kết tủa phải đủ 60 phút tốc độ ly tâm cao để thu tủa protease Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 16 of 17 GVHD Th.S NGUYỄN THỊ KIM CÚC TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Hữu Phước (1996), Công nghệ vi sinh vật Tập 2: Vi sinh vật công nghiệp, TP Hồ Chí Minh, trường Đại Học Bách hoa Trần Linh Thước (2002), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm, NXB giáo dục, Hà Nội TS Phạm Quang Chinh, PGS.TS Biền Văn Minh, Cách xác đinh hoạt độ protease, http://csdlkhoahoc.hueuni.edu.vn/data/baibao/14_cachxacdinhhoatdoprotease.pdf [17/04/2015] Bùi Thị Phi (2007), hóa luận tốt nghiệp, Luanvan.co, http://luanvan.co/luan-van/phan-lap-khao-sat-dac-diem-cua-vi-khuan-bacillussubtilis-va-tim-hieu-kha-nang-sinh-enzyme-protease-amylase-cua-vi-khuan-2428/ [16/04/2015] Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 17 of 17 [...]...  Qua kết quả của các test khẳng định đó là chủng vi khuẩn B subtilis 4 Quy trình sản xuất protease 4.1 Lên men Cho vào 2 bình tam giác mỗi bình 1,5g TSB, 0,25g casein và 50 ml nước cất, đem đi hấp khủ trùng Cấy chủng vi khuẩn thu từ DV1 vào hai bình tam giác trên, nuôi lắc ở nhiệt độ phòng trong 24h 4.2 Thu enzyme protease Sau 24h nuôi cấy, thu dịch chứa enzyme bằng cách ly tâm với tốc độ 3500 rpm... hóa  Test catalase Nhỏ vài giọt H2O2 vào sinh khối vi khuẩn đã phân lập trên đĩa peptri thấy xuất hiện sủi bọt Hình 6 Kết quả test catalase  Test Casein Cách tiến hành:  Chuẩn bị môi trường: Cân 5g Casein, 1,5g agar, trong 100ml nước cất  Hấp môi trường và đổ thạch vào đĩa petri, để môi trường đông lại  Dùng tăm bông lấy vi khuẩn từ mẫu DV1, DB1đã phân lập trước đó cấy vào đĩa petri  Ủ ở 370C... trường: cân 1,7g MR –VP trong 100ml nước cất trộn đều cho vào ống nghiệm hấp khử trùng  Cấy vào mỗi ống các chủng vi khuẩn DV1, ủ ở 37oC trong vòng 24h  Kiểm tra bằng thuốc thử: o Test MR: Cho 2 đến 3 giọt methyl đỏ vào ống nghiệm thấy có xuất hiện màu đỏ là dương tính o Test VP: Sử dụng Napton và OH 40% cho vào ống nghiệm nuôi cấy thấy có xuất hiện màu đỏ thẫm ở trên là dương tính Báo cáo thực hành... vào đĩa petri  Ủ ở 370C trong vòng 3 ngày  Quan sát thấy có vòng trong suốt xung quanh đường cấy là kết quả dương tính Kết quả: Cả hai mẫu DB1 và DV1 vi khuẩn đều có khả năng phân giải casein hình thành vòng phân giải tuy nhiên hoạt tính của chủng DV1 mạnh hơn so với chủng DB1 nên sử dụng DV1 để sản xuất protease Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 11 of 17 GVHD Th.S NGUYỄN THỊ KIM CÚC Hình... 4.4 Thử hoạt tính protease với casein  Chuẩn bị môi trường test: Cân 0,14g casein vào 1,5g agar trong 50ml nước cất, hấp khử trùng môi trường, đổ lên đĩa petri, để nguội  Dùng đầu tuýp micropipet 1000µl tạo các giếng tròn trên đĩa thạch  Cho 10µl enzyme vào trong mỗi giếng  Ủ ở 370C trong 24h  Quan sát thấy có vòng phân giải xung quanh giếng, nếu vòng phân giải càng lớn hoạt tính protease càng mạnh... CÚC Hình 7 Kết quả test Casein  Test simmons citrate  Chuẩn bị môi trường: Cân 4,5g Simmons Citrate Agar (SCA) và 200ml nước cất vào trong bình tam giác, hấp khử trùng  Môi trường SCA và chỉ thị bromothynol blue, pH < 6 màu vàng, pH trung tính màu xanh lục, pH > 7.6 màu xanh dương  Cấy ria vi khuẩn lên môi trường SCA  Ủ 35oC trong 24 – 48 h  Kết quả: o ( - ): hông có khuẩn lạc môi trường xanh... Trong quá trình kết tủa thu enzyme do thời gian kết tủa quá ngắn, hiệu quả kết tủa không cao hi ly tâm không thu được cặn và dịch chiết vẫn còn chứa protease chưa kết tủa  Tiến hành thử hoạt tính của cả dịch và enzyme kết tủa  Đề xuất  Cần chú ý thao tác vô trùng cẩn thận, trong box cấy Trước khi sử dụng phải bật đèn UV để khử trùng  Tất cả các mẫu không được bỏ đi khi chưa chắc chắn kết quả  Dụng... TS Phạm Quang Chinh, PGS.TS Biền Văn Minh, Cách xác đinh hoạt độ protease, http://csdlkhoahoc.hueuni.edu.vn/data/baibao/14_cachxacdinhhoatdoprotease.pdf [17/04/2015] Bùi Thị Phi (2007), hóa luận tốt nghiệp, Luanvan.co, http://luanvan.co/luan-van/phan-lap-khao-sat-dac-diem-cua-vi-khuan-bacillussubtilis-va-tim-hieu-kha-nang-sinh-enzyme -protease- amylase-cua-vi-khuan-2428/ [16/04/2015] Báo cáo thực hành... phút tốc độ ly tâm cao để thu được tủa protease Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 16 of 17 GVHD Th.S NGUYỄN THỊ KIM CÚC TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Hữu Phước (1996), Công nghệ vi sinh vật Tập 2: Vi sinh vật công nghiệp, TP Hồ Chí Minh, trường Đại Học Bách hoa Trần Linh Thước (2002), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm, NXB giáo dục, Hà Nội TS Phạm... khối bị lẫn vào enzyme 4.3 Tinh sạch enzyme Báo cáo thực hành Công nghệ vi sinh - Page 14 of 17 GVHD Th.S NGUYỄN THỊ KIM CÚC Sử dụng aceton để kết tủa với tỷ lệ 1 : 4 Trong 10ml dịch enzyme cho vào 40ml aceton trong vòng 60 phút trong điều kiện lạnh 40C Sau đó đem đi ly tâm 3500 rpm trong vòng 15 phút thu cặn loại bỏ dịch Hòa cặn tỷ lệ 2 : 3 với đệm phosphat (pH = 7): 19,5ml NaH2PO4 0,2M và 30,5ml Na2HPO4 ... http://luanvan.co/luan-van /phan- lap- khao-sat-dac-diem-cua -vi- khuan-bacillussubtilis -va- tim-hieu-kha-nang -sinh- enzyme -protease- amylase-cua -vi- khuan-2428/ [ 16/ 04/2015] Báo cáo th c hành Công nghệ vi sinh - Page 17 of 17... nghiêng Sơ đồ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất Báo cáo th c hành Công nghệ vi sinh - Page of 17 GVHD Th. S NGUYỄN TH KIM CÚC Hình Phân lập vi khuẩn Bacilluss subtilis Kết quả: mẫu DV1,... đủ 60 phút tốc độ ly tâm cao để thu tủa protease Báo cáo th c hành Công nghệ vi sinh - Page 16 of 17 GVHD Th. S NGUYỄN TH KIM CÚC TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Hữu Phước (19 96) ,