Quy trình cấy truyền phôi bò

Nội dung 1. Lịch sử nghiên cứu 1.1 Trên thế giới Năm 1890, thí nghiệm đầu tiên về cấy truyền phôi thành công trên thỏ bởi Walter Heap. Ông là người sáng lập ra công nghệ cấy truyền phôi. 1932, cấy truyền phôi thành công trên dê bởi Warwick và Berry. 1933, cấy truyền phôi thành công trên chuột cống bởi Nicholas. 1934, cấy truyền phôi thành công trên cừu bởi Warwick và Berry. 1951, bê đầu tiên trên thế giới ra đời bằng cấy truyền phôi bởi Willet và cộng sự. 1970, thành công trong công việc bảo quản phôi đông lạnh. 1972, cấy truyền phôi trên bò bởi Willmut và Rowson. 1982, vi phẫu thuật thành công trong phòng thí nghiệm (theo Vlahov, 1987). 1992, bằng kĩ thuật cloning từ một phôi bò đã cho ra 5 phôi (Viện INRA Pháp, 1992). ............

Nội dung

1. Lịch sử nghiên cứu

1.1 Trên thế giới

Năm 1890, thí nghiệm đầu tiên về cấy truyền phôi thành công trên thỏ bởi Walter Heap Ông là người sáng lập ra công nghệ cấy truyền phôi

- 1932, cấy truyền phôi thành công trên dê bởi Warwick và Berry

- 1933, cấy truyền phôi thành công trên chuột cống bởi Nicholas

- 1934, cấy truyền phôi thành công trên cừu bởi Warwick và Berry

- 1951, bê đầu tiên trên thế giới ra đời bằng cấy truyền phôi bởi Willet và cộng sự

- 1970, thành công trong công việc bảo quản phôi đông lạnh

- 1972, cấy truyền phôi trên bò bởi Willmut và Rowson

- 1982, vi phẫu thuật thành công trong phòng thí nghiệm (theo Vlahov, 1987)

- 1992, bằng kĩ thuật cloning từ một phôi bò đã cho ra 5 phôi (Viện INRA Pháp, 1992)

1.2 Ở Việt Nam

- Năm 1978, trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia đã có một bộ phận bắt đầu nghiên cứu cấy truyền phôi thỏ

- Năm 1980, nghiên cứu cấy truyền phôi bò Tháng 9-1989, Viện chăn nuôi bộ môn cấy truyền phôi được thành lập

- Năm 1986, Con bê đầu tiên ở nước ta ra đời từ cấy truyền phôi

- Năm 1989, Cấy truyền 50 phôi đông lạnh với sự giúp đỡ của 2 chuyên gia Cuba

- Năm 1996, 150 phôi đông lạnh cấy trên bò miền Nam và Hà Nội, những bê sinh ra sinh trưởng, phát triển, sinh sản bình thường, cho sữa vượt toàn đàn 20-30%

Hình 2: Bò được chuyển phôi ở Việt Nam

2. Cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn

2.1 Cơ sở khoa học

- Phôi có thể coi là 1 cơ thể độc lập ở giai đoạn đầu của quá trình phát triển

- Nếu chuyển phôi vào cơ thể khác có trạng thái sinh lí sinh dục phù hợp với trạng thái của cá thể cho phôi thì nó vẫn sống và phát triển bình thường ( sự phù hợp đó gọi là sự đồng pha)

- Sử dụng các chế phẩm sinh học chứa hoocmon có thể điều khiển sinh sản của vật nuôi theo ý muốn

2.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Tăng số đời con của những bò cái có tiềm năng di truyền vượt trội, phổ biến và nhân nhanh các giống tốt, quí, hiếm ra thực tế sản xuất trên cơ sỏ khai thác triệt

để tiềm năng di truyền của những cá thể cái cao sản cho trứng và cá thể đực cho tinh trùng, tận dụng tốt đặc tính của cả con cho và nhận phôi

- Nâng cao khả năng sinh sản, các sản phẩm thịt, sữa trong chăn nuôi bò

- Tăng tốc độ kiểm tra đời sau, nâng cao cường độ chọn lọc, đẩy mạnh công tác giống trên cơ sở tăng nhanh tiến độ di truyền hằng năm

- Giảm khoảng cách thế hệ

- Giúp con người dễ dàng, thuận lợi trong việc xuất nhập, vận chuyển phôi từ khu vực này sang khu vực khác, tránh lây lan bệnh tật, tiết kiệm chi phí kiểm dịch, hạn chế stress và chi phí vận chuyển gia súc sống

- Tạo bê sinh đôi thúc đẩy nhanh sự phát triển của các ngành khoa học khác như: sinh lý, di truyền học

- Có thể tạo phôi từ những con bò cái có tiềm năng di truyền cao nhưng không có khả năng duy trì quá trình mang thai bình thường Bảo tồn con giống dưới dạng trứng, phôi, tinh trùng nhằm giữ vật liệu di truyền

- Hạn chế một số dịch bệnh và nâng cao khả năng chống chịu bệnh, khả năng thích nghi cho con vật ở môi trường mới (không lây truyền bệnh, tăng sức đề kháng

động dục

3.1) Chọn bò cho trứng và gây động dục

- Bò khỏe mạnh, không có bệnh tật về đường sinh sản, có năng suất cao 7000kg sữa/ 1 chu kỳ

5000 Bò cái năng suất cao về một hoặc một vài tính trạng mong muốn và các tính trạng đó phải được di truyền cho thế hệ sau Ưu tiên những tính trạng có hệ số di truyền cao và giá trị thương phẩm lớn

- Không mắc khuyết tật hoặc bệnh di truyền nào

- Không quá già

- Chu kì động dục bình thường, biểu hiện chu kì rõ ràng Buồng trứng hoạt động tốt Chọn bò sau khi sinh con từ 2 tháng đến 5 tháng

3.2) Gây rụng trứng nhiều ở bò cho trứng

- Đưa hoocmon PMSG vào bò bằng dụng cụ chuyên dụng (Kill made) Mục đích: đưa một lượng hoocmon PMSG cao vào trong máu của bò nhằm ức chế toàn bộ quá trình phát triển nang trứng của bò

- Sau 5 ngày, tiếp tục tiêm hoocmon estradiol, lượng tiêm 0,5ml liều là 1mg tiêm vào bắp sau mông bò

- Ngày 10 và 13 rút kill made và tiêm FSH để thúc đẩy quá trình tạo nang trứng phát triển đồng loạt sau một thời gian bị ức chế và rụng một lượng lớn trứng.( tính từ ngày đưa kill made vào đường sinh dục bò)

Hình 3: Kill made và đưa hoocmon vào bò

3.3 Thụ tinh

3.3.1 Thu trứng

Hút trứng với sự trợ giúp của máy siêu li tâm dùng trong kĩ thuật hỗ trợ sinh sản ở người Phương pháp OPU đòi hỏi phải có các thiết bị và dụng cụ chuyên dụng như máy siêu âm, đầu dò, kim chọc hút cũng như tay nghề cao của người thao tác Hệ kim hút có nối dây để thu trứng từ nang vào tube đựng bên ngoài Bộ đầu dò siêu âm và dây chuyền tín hiệu Phần nhựa cố định đầu dò Ống kim loại bao ngoài toàn bộ hệ thống kim, dây hút, đầu dò, dây truyền tín hiệu Phương pháp này cho phép hút các trứng trong nang trứng của buồng trứng từ con vật đang sống Con vật đưa vào khai thác trứng được giữ đứng yên trong giá cố định

và người thao tác một tay đưa vào trực tràng kiểm soát buồng trứng, áp buồng trứng vào đầu dò, tay kia điều khiển kim hút

- Cách tiến hành: Cho bò vào giá cố định, lấy hết phân ra, rửa sạch, sát khuẩn âm

hộ và khu vực xung quanh

- Chuẩn bị hệ thống máy siêu âm, nối đầu dò âm đạo vào máy siêu âm Nối kim hút tế bào trứng (kim 16G dài 55 cm), đặt máy tạo áp suất ở 120 mmHg, tương đương tốc độ dòng chảy 25 ml/phút Chuẩn bị môi trường hút tế bào trứng

(mDPBS của Sigma) có bổ sung 50 iu/ml heparin và 5% huyết thanh bê và kháng sinh (100.000 UI penicilin/ml + 100mg streptomycin/ml) duy trì ở nhiệt độ 37oC bằng máy ổn nhiệt.

- Nhẹ nhàng cho đầu dò siêu âm có gắn hệ thống dẫn kim vào âm đạo, cho tay qua trực tràng xác định vị trí của buồng trứng, vị trí các nang trứng rồi đưa buồng trứng về phía đầu quét của đầu dò, quan sát các nang trứng trên màn hình máy siêu âm, đếm số nang trứng có mặt trên buồng trứng Trước khi hút dịch nang trứng, hút một ít môi trường hút trứng để làm trơn hệ thống kim và ống dẫn Sau khi chọc hút 2 - 4 nang trứng, rút kim ra, hút dung dịch thu tế bào trứng để tế bào trứng chảy vào ống falcon, tiến hành hút lặp lại đến khi không còn nhìn thấy nang trứng nào trên buồng trứng thì chuyển qua buồng trứng đối diện Dịch hút được thu vào ống ly tâm 50ml và duy trì ở nhiệt độ 370C bằng máy ổn nhiệt

- Sau khi hút xong một buồng trứng, đưa ngay về phòng thí nghiệm, lọc bằng cốc lọc Emcon có đường kính lỗ lọc 20µm, 10ml dung dịch còn lại được chuyển vào đĩa petri vô trùng có đường kính 90mm để soi tìm tế bào trứng dưới kính hiển vi soi nổi Tế bào trứng thu được được đánh giá

- Phân loại và chọn lọc tế bào trứng

+ Loại A: tế bào trứng hoàn hảo, trứng có trên 4 lớp tế bào cumulus chắc, dày bao quanh vòng trong suốt tròn rõ, liên kết chặt với nhau, chất nguyên sinh đồng đều.+ Loại B: tế bào trứng với ít hơn 4 lớp tế bào cumulus, không liên kết chặt chẽ, có một vài nơi bị mất các tế bào này, nguyên sinh chất đồng đều nhưng màu hơi tối.+ Loại C: không có lớp tế bào cumulus bao quanh tế bào trứng mà chỉ có các sợi huyết (fibrin), nguyên sinh chất không đồng đều

Thông thường chỉ dùng trứng loại A và B để nuôi tới chín sau đó thụ tinh thành hợp tử để phát triển thành phôi

- Nuôi chín tế bào trứng

Các trứng khai thác từ buồng trứng đều ở trạng thái chưa thành thục, để có thể được thụ tinh , trứng cần có khả năng phát triển và đạt đến trạng thái thành thục

Sự phát triển của trứng như vậy có kèm theo những biến đổi về mặt hình thái, sinh lý và sinh hóa liên quan đến nhân trứng, nguyên sinh chất và màng trứng.Chọn những trứng có chất lượng tốt đưa vào nuôi cấy trong môi trường TCM-199 5% CS (20 tế bào trứng trong 100 ml môi trường) với sự có mặt của những tế bào granulose (ở nồng độ 1-5 triệu tế bào/ml) Nhiệt độ tử nuôi được đặt ở 38,5oC, đồng thời nồng độ sục khí CO2 được điều chỉnh ở mức 5%

Môi trường nuôi được bổ sung bằng huyết thanh bò đang động dục (giàu LH, FSH, Estradiol) hoặc bằng huyết thanh bào thai (giàu yếu tố IGF-1) và song song cũng bổ sung thêm Estradiol- 17β (nồng độ cao có ảnh hưởng âm tính tới sự hình thành thoi vô sắc cũng như sự xuất hiện thể cực đầu tiên) Tuy nhiên, để hoàn thiện quá trình thành thục trong ống nghiệm, vẫn cần bổ sung thêm LH, FSH vào môi trường nuôi trứng

3.3.2) Hoạt hóa tinh trùng

* Thu tinh trùng: tinh trùng được thu từ bò đực giống với những đặc điểm như sức khỏe tốt, có những tính trạng tốt như mong muốn, không mắc bệnh di truyền,

Thu tinh trùng bằng phương pháp nhảy giả: Tinh trùng được thu trực tiếp bằng cách cho bò đực nhảy vào giá nhảy giả làm bằng hình nộm bò cái có gắn âm đạo giả Bò đực sau khi được dắt đến giá nhảy nhờ phản xạ có điều kiện bò đực nhảy giả và xuất tinh vào âm đạo giả, thu nhận tinh trùng từ âm đạo giả, giữ trong môi trường INRA sau đó đem đi bảo quản lạnh trong nitơ lỏng -1960c

* Tinh trùng được hoạt hoá theo phương pháp 90% percoll:

- Ly tâm lần 1: lấy 3 ml môi trường 90% percoll cho vào ống ly tâm, giải đông

1-2 cọng rạ tinh đông lạnh trong nước ấm 37°C, cho tinh trùng vào ống ly tâm đã có môi trường 90% percoll, ly tâm với tốc độ 2100v/phút trong 10 phút

- Ly tâm lần 2: Lấy phần tinh trùng lắng phía dưới, cho tiếp 6ml môi trường rửa tinh trùng (BO+ Hypotaurine+ Heparin), ly tâm lần 2 (1800v/phút, trong 5 phút)

- Pha loãng đến nồng độ là 6,25x106 tinh trùng/ml

3.3.3) Thụ tinh

- Tế bào trứng sau khi nuôi 20 giờ lấy ra khỏi tủ nuôi cấy, rửa 3-4 lần trong môi trường rửa (BO + BSA) Sau đó để tiến hành thụ tinh, chuyển 20 TB trứng đã rửa vào 100μl môi trường BO có mật độ tinh trùng 6,25x106 tinh trùng / ml trong đĩa petri có phủ dầu khoáng vô trùng, cho vào tủ nuôi cấy 5% CO2 , nhiệt độ 38,5ºC, độ ẩm 98%, quá trình thụ tinh được tiến hành trong khoảng thời gian 5-6 giờ

- Thu trứng đã thụ tinh từ các giọt chứa tinh trùng (giọt môi trường thụ tinh)

- Rửa trứng đã thụ tinh 3 lần trong môi trường nuôi trứng chín (TCM-199) đã chuẩn bị sẵn

- Đặt đĩa đã có trứng thụ tinh vào tủ ấm có nhiệt độ 380C với 5% C02 trong 48h

Hình 7: Trứng đã thụ tinh

3.3.4) Nuôi phôi

- Chuẩn bị hai đĩa rửa, mỗi đĩa 2,5ml môi trường CR1aa 5% CS, phủ 2 ml dầu khoáng vi lượng Một đĩa nuôi phôi: lấy 4 giọt mỗi giọt 100 ml CR1aa 5% CS cho vào đĩa petri, phủ 4,5 ml dầu khoáng vi lượng Cho cả 3 đĩa trên vào tủ ấm

CO2 khoảng 2 giờ trước khi chuyển phôi vào nuôi Trứng sau khi thụ tinh, được chuyển vào đĩa rửa, rửa ở mỗi đĩa 3 lần, sau đó chuyển vào giọt môi trường nuôi phôi, cho vào tủ nuôi cấy CO2 nuôi tiếp và theo dõi sự phát triển của phôi Sự phân chia của hợp tử được đánh giá dựa vào sự phân chia tế bào 48 giờ sau thụ tinh Sự phát triển của phôi được đánh giá bằng kính hiển vi soi nổi ở ngày thứ 5,

6, 7 sau khi nuôi cấy trong ống nghiệm dựa vào số phôi phát triển đến giai đoạn phôi dâu, phôi nang Ngày 0-2: phôi phát triển 1 tế bào, ngày 1-3: phôi 2 tế bào, ngày 2-3: phôi 4 tế bào, ngày 3-5: phôi 8 tế bào, ngày 5-6: phôi dâu, ngày 6-7: phôi dâu chặt, ngày 6-8: phôi nang sớm, ngày 8-9: phôi nang trương nở hoặc đang thoát màng, ngày 9-11: phôi nang thoát màng

3.4) Thu phôi, chọn lọc phôi

- Sau khi thụ tinh, loại bỏ trứng không thụ tinh Trứng không thụ tinh màng noãn hoàn hiện rõ nét, nhân có cấu trúc đồng nhất không có sự phân chia

- Trứng thụ tinh: có sự phân chia tế bào và tương ứng với các giai đoạn phát triển của phôi

- Phôi kém chất lượng là những phôi chậm phát triển, phôi thoái hóa

- Phôi có chất lượng tốt là phôi dâu, phôi nang có hình dáng và kích thước phù hợp với độ tuổi, màu sắc của tế bào đặc trưng.

3.5) Chọn bò nhận phôi và gây động dục đồng pha bò nhận phôi

- Bò khỏe mạnh, không có bệnh tật về đường sinh sản, sinh sản tốt tạo tỷ lệ đậu phôi cao khi đưa phôi vào cơ thể, không cần năng suất cao

- Bò cái nhận phôi không đóng góp về kiểu di truyền của con nhưng có tác động đến kiểu hình của con non trong thời gian mang thai và nuôi con

- Sự đồng pha: trạng thái sinh lý sinh dục của bò nhận phôi phù hợp với trạng thái sinh lý sinh dục của bò cho phôi hoặc phù hợp với tuổi phôi

- Gây động dục đồng pha là quá trình kích thích cho cái nhận phôi động dục đúng vào thời điểm động dục của cái cho phôi

3.6) Cấy truyền phôi (ET- embryo transfer)

- Là quá trình đưa phôi được tạo ra từ cá thể bò mẹ cho phôi vào cá thể bò mẹ khác (Bò nhận phôi) Phôi vẫn sống và phát triển bình thường trên cơ sở trạng thái sinh lí sinh dục của bò cho phôi phù hợp với bò nhận phôi hoặc phù hợp với tuổi phôi, sự phù hợp này gọi là đồng pha

- Dùng phương pháp cấy truyền phôi bằng cọng rạ để cấy truyền phôi vào bò nhận

3.7) Kiểm tra, chăm sóc bò mang thai

a Chăm sóc bò mang thai

Thức ăn chủ yếu là cỏ xanh, phụ phế phẩm trồng trọt và công nghiệp như rơm, vỏ thân cây bắp, đọt mía, thân các loại cây họ đậu, cám, rỉ mật …

Bò cái chửa cần được ăn uống đầy đủ, mỗi ngày 30-35 kg cỏ tươi, 2 kg rơm ủ, 1 kg thức ăn tinh (ngô, cám,…), 25- 30 gram muối, 30-40 gram bột xương Không bắt bò làm những việc nặng như: cày bừa, kéo xe,… Tránh xua đuổi mạnh đối với bò đang có chửa tháng thứ 3, tháng thứ 7, thứ 8 và thứ 9

b Đỡ đẻ cho bò

Thời gian mang thai trung bình của bò là 280-285 ngày

- Triệu chứng bò sắp đẻ: Bò có hiện tượng sụt mông, bầu vú căng, đầu vú chĩa về hai bên, niêm dịch treo lòng thòng ở mép âm môn, đau bụng, đứng lên nằm xuống, chân cào đất, đái nhiều lần, khi bắt đầu đẻ bọc ối thò ra ngoài trước

- Đỡ đẻ cho bò: Trong trường hợp bò đẻ bình thường (thai thuận) không cần can thiệp hoặc chỉ cần hỗ trợ cho bò cái bằng cách dùng tay kéo nhẹ thai ra Cắt dây rốn dài khoảng 10-12 cm (không cần buộc dây rốn), sát trùng bằng cồn Iốt 5% Lau rớt, rãi trong mũi, mồm bê, để bò mẹ tự liếm con Vệ sinh phần thân sau và bầu vú bò mẹ, cho bò mẹ uống nước thêm ít muối, cám và nước ấm Trường hợp đẻ khó phải gọi cán bộ thú y can thiệp kịp thời

c Chăm sóc, nuôi dưỡng bò đẻ và bê con

* Đối với bò mẹ

- 15- 20 ngày đầu sau khi đẻ cho bò mẹ ăn cháo (1,0- 1,5 kg thức ăn tinh/con/ngày) và 25-30 gr muối ăn, 30-40 gr bột xương, có đủ cỏ non xanh ăn tại chuồng

- Những ngày sau, trong suốt thời gian nuôi con, một ngày cho bò mẹ ăn

30 kg cỏ tươi, 2-3 kg rơm ủ, 1-2 kg cám hoặc thức ăn hỗn hợp để bò mẹ phục hồi sức khoẻ, nhanh động dục lại để phối giống

* Đối với bê

- Từ khi sinh ra đến 30 ngày tuổi bê được nuôi ở nhà, cạnh bò mẹ Luôn giữ ấm cho bê, tránh gió lùa, chỗ bê nằm khô, sạch.

- Trên 1 tháng tuổi, chăn thả theo bò mẹ ở bãi gần chuồng, tập cho bê ăn thức ăn tinh

- Từ 3-6 tháng tuổi: cho 5-10 kg cỏ tươi và 0,2 kg thức ăn tinh hỗn hợp Tập cho bê ăn cỏ khô Nên cai sữa bê vào khoảng 6 tháng tuổi

- Từ 6-24 tháng tuổi, chăn thả là chính, mỗi ngày cho ăn thêm 10-20 kg cỏ tươi, ngọn mía, cây ngô non Mùa thiếu cỏ có thể cho ăn thêm 2-4 kg cỏ khô một ngày

3.8) Đàn bê năng suất cao được sinh ra

Hình 8: Bò cấy truyền phôi sinh trưởng và phát triển tốt.

Danh mục thành phần các loại môi trường

1. Môi trường nuôi thành thục trứng: TCM- 199

Nuôi thành thục trứng (trong 100ml M199) Nuôi hợp tử (trong 100ml mSOF)

Yếu tố sinh trưởng biểu bì (EGF)

2. BSA: là abumin huyết thanh bò albumin là protein phổ biến nhất trong hệ tuần hoàn và chiếm 80% áp suất keo của máu Người ta chứng minh rằng albumin huyết thanh chịu trách nhiệm chính cho việc duy trì pH máu Albumin động vật

có vú được gan tổng hợp ban đầu ở dạng preproabumin Sau khi loại bỏ chuỗi peptide tín hiệu thành proalbumin và tiếp tục loại bỏ 6 proalbumin còn lại để trở thành albumin

Albumin được cấu tạo bởi lượng thấp tryptophan, methionine; lượng lớn cytine

và những amino acid tích điện, aspartic, glutamic acid, lysine, arginine Glucine

và isoleucine trong BSA thấp hơn so với protein bình thường

3. BSA phản ứng với các protein như lysozyme và clupeine nhờ vào liên kết chéo giữa BSA và lysozyme tại bề mặt phân cách BSA tiến tới điểm đẳng điện khi lực đẩy tĩnh điện ở mức tối thiểu Khi nó tương tác với lysozyme, sự giãn nở và ổn định lớn nhất ở pH 8 và 9 cải thiện việc tạo bọt và ổn định pH, chất vận chuyển những acid béo không no trong huyết thanh Nó cũng thực hiện các chức năng khác như cô lập các gốc oxygen tự do và bất hoạt các độc tố như bilirubin

BSA làm tăng amino acid được bổ sung, cung cấp những phân tử không phải amino acid được kết hợp kích thích sự phất triển, cung cấp những chất bắt giữ

4. Dung dịch đệm Dulbecco - PBS*