Kết quả cải tiến phương pháp gây động dục đồng pha và cấy truyền phôi bò sữa cao sản bằng công nghệ Invivo và Invitro Tăng Xuân Lưu, Trịnh Văn Thuận, Trịnh Văn Tuấn, 1 Nguyễn Thị Thoa, 1 Phan Văn Kiểm Trung tâm Nghiên cứu Bũ và Đồng cỏ Ba Vỡ 1 Viện Chăn Nuôi Tóm tắt Tỉ lệ động dục đồng pha đạt 89,58% - 89,65% ở bò lai HF sinh sản và 90,00% - 91,67% trên bò cái tơ. Bò động dục có rụng trứng 72,41% - 72,92% ở bò lai HF sinh sản và 79,17- 80,00% ở bò tơ . Tỉ lệ có chửa phôi invivo đạt 42,5% -42,86% và 36,36% -38,89% do cấy phôi invitro; Tỉ lệ đẻ phôi invi vo 30,0 - 32,14%; phôi invitro 27,87 - 30,33% ; tỉ lệ có chửa phôi dâu invivo đạt 40%, tỷ lệ đẻ 28,33%; Tỷ lệ có chửa do cấy phôi nang invivo đạt 44,44%, tỷ lệ đẻ 36,11%; Tỷ lệ có chửa do cấy phôi dâu invitro 33,33%, tỷ lệ đẻ 26,67% ; Tỷ lệ có chửa do cấy phôi nang invitro 38,89%, tỷ lệ đẻ 30,56%; Khối lượng sơ sinh của bê được sinh ra từ phôi invivo lớn hơn phôi invitro 1. Đặt vấn đề Chăn nuôi bò sữa đang góp phần quan trọng đối với chuyển đổi cơ cấu kinh tế trong nông nghiệp, tăng thu nhập cải thiện đời sống cho nông dân. thực hiện Quyết Định 167 của Thủ tướng chính phủ về một số giải pháp nhằm phát triển chăn nuôi bò sữa Việt Nam, đến nay đã thu được nhiều kết quả và phát triển theo hướng bền vững. Bước đầu đáp ứng được một phần nhu cầu tiêu dùng sữa của xã hội. Tổng đàn bò sữa và sản lượng sữa của cả nước tăng từ 40.000 con và 64.000 tấn năm 2001 lên 120.000 con và 290.000 tấn năm 2010. Chăn nuôi bò sữa thực sự mang lại hiệu quả kinh tế và xã hội cao đối với nông nghiệp của Việt Nam trong thời gian 2001-2010. Để có được số lượng và chất lượng bò sữa HF Việt Nam như hiện nay là kết quả áp dụng khoa học kỹ thuật và công nghệ sinh học trong lại tạo và nhân giống bò sữa của các nhà khoa học trong suốt thời gian hơn 50 năm qua. Trong đó kỹ thuật thụ tinh nhân tạo và công nghệ phôi là một trong những công nghệ sinh học trong sinh sản đóng một vai trò quan trọng trong công tác nhân và cải tiến giống bò sữa Việt Nam. Để lai tạo giống bò sữa Việt Nam, chúng ta phải có đàn cái nền lai Zebu tốt để nhân giống bò lai HF bằng kỹ thuật thụ tinh nhân tạo, tạo con lai F1, F2, F3 và F4 HF có tỷ lệ máu HF 50, 75, 87,5 %. Kỹ thuật TTNT đã khai thác tiềm năng sinh sản của bò đực giống và tạo ra bò sữa HF Việt Nam phù hợp với điều kiện khí hậu nóng ẩm. Ngày nay bằng công nghệ sinh sản từ nhũng bò cái HF có tiềm năng năng xuất cao, cần áp dụng công nghệ phôi để tạo ra bò sữa HF có có chất lượng cao từ những con đực và con cái cao sản. Để nâng cao tỷ lệ có chửa trong công nghệ phôi việc gây động dục đồng pha cho bò nhân phôi là một trong những khâu kỹ thuật quan trọng đã và đang được các nhà nghiên cứu quan tâm. Cùng với kỹ thuật định lượng hormone Progesterone (P4) nhanh trong phòng thí nghiệm đã góp phần xác định sớm kết quả có thai ở bò sau 21 ngày là những chỉ số tin cậy để chẩn đoán sớm có chửa ở bò nhân phôi. Căn cứ vào tình hình thực tế của phát triển nghành chăn nuôi bò sữa trong thời gian qua và nhu cầu về bò giống bò sữa có chất lượng cao của người chăn nuôi, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu cải tiến phương pháp gây động dục đồng pha và cấy truyền phôi bò sữa cao sản bằng công nghệ invivo và invitro”với mục tiêu: nâng cao tỷ lệ động dục đồng pha, tỷ lệ bò có chửa và tỷ lệ bê sinh ra do cấy phôi, góp phần nâng cao hiệu quả trong công nghệ Cấy truyền phôi nhằm nâng cao hiệu quả trong công tác nhân giống 2. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu - Thiết bị đặt âm đạo và Hormone: PRID, CIDR, PGF 2 , Eestradio - Phôi invitro và invivo từ những bò sữa HF cao sản. - Bò cái lai hướng sữa: bò tơ và bò sinh sản khai thác sữa nuôi trong nông hộ được chọn để nhận phôi. 2.2. Nội dung nghiên cứu - Gây động dục đồng pha cho bò nhận phôi bằng thiết bị đặt âm đạo kết hợp với sử dụng hormone hướng sinh sản, đánh giá tỷ lệ động dục đồng pha của bò nhận phôi so với công nghệ trước đây. - Cấy truyền phôi cho bò động dục đồng pha trên cơ sở phôi được tạo ra theo công nghệ invivo và invitro, đánh giá sớm tỷ lệ có chửa của bò nhận phôi sau 21 ngày - Đánh giá được tỷ đẻ, sự sinh trưởng và phát triển của bê sinh ra do cấy truyền phôi invivo và phôi invitro. 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Bộ môn Sinh Sản và tập tính vật nuôi, PTNTĐ Tế bào động vật -Viện Chăn nuôi - Trung tâm Nghiên cứu Bò và Đồng cỏ Ba Vì - Từ tháng 1 năm 2008 đến tháng 8 năm 2010 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Chọn bò cái gây động dục để nhận phôi Bò cái nhận phôi là những bò cái lai HF tơ có khối lượng ≥ 280 kg và bò đã sinh sản theo các chỉ tiêu: - Sinh trưởng phát triển bình thường - Không mắc các bệnh truyền nhiễm và trạng thái sinh lý bình thường 2.4.2. Phương pháp gây động dục đồng pha và cấy truyền phôi - Phương pháp1: Gây động dục cho bò bằng thiết bị đặt âm đạo PRID với thời gian 12 ngày, trước ngày rút thiết bị một ngày thì tiêm 25 mg PGF 2 theo dõi động dục. Sau khi bò động dục 7 ngày khám qua trực tràng để phân loại thể vàng và những bò có thể vàng tốt thì tiến hành cấy phôi - Phương pháp 2: Gây động dục cho bò bằng CIDR với thời gian 12 ngày, trước khi rút thiết bị thì tiêm 25 mg PGF 2 /con và ngay sau khi rút thiết bị thì tiêm 5 mg Estradiol . Sau đó theo dõi động dục và sau 7 ngày khám qua trực tràng để phân loại thể vàng và những bò có thể vàng tốt thì tiến hành cấy phôi Sau 21 ngày cáy phôi tiến hành lấy mẫu máu hoặc sữa và phân tích hàm lượng Progesterone(P4) bằng phương pháp Enzyme Immuno Asay(EIA) trong phòng thí nghiệm, kết hợp với khám lâm sàng qua trực tràng để chẩn đoán có chửa sớm của bò nhận phôi. Sau khi xác định được những bò nhận phôi có chủa, theo dõi khả năng mang thai đến khi bò đẻ, đánh giá tỷ lệ đẻ và khả năng sinh trưởng, phát triển của bê : (khối lượng sơ sinh, 3-6-9-12-18 tháng tuổi bằng cân điện tử kết hợp thước dây . 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 3.1. Gây động dục đồng pha cho bò nhận phôi bằng : PRID + PGF2, CIDR + PGF2 và Eestradiol được thể hiện ở bảng sau Bảng 1. Chỉ số Số con (n) Số con động dục (n) Tỉ lệ % Số bò động dục có rụng trứng (n) Tỉ lệ % PRID + PGF 2 Bò lai HF sinh sản 96 86 89,58 70 72,92 Bò lai HF tơ 24 22 91,67 19 79,17 CIDR + Eestradiol PGF 2 Bò lai HF sinh sản 58 52 89,65 42 72,41 Bò lai HF tơ 20 18 90,00 16 80,00 Qua kết quả chúng tôi nhận thấy: Kết quả gây động dục đồng pha trên bò nhận phôi bằng hai phương pháp đã được cải tiến: tỉ lệ động dục ở bò tơ : từ 90,0 đến 91,67 % ,ở bò lai HF sinh sản: 89,58% đến 89,65% . Tương ứng tỉ lệ bò động dục có rụng trứng (có thể vàng tốt đạt tiêu chuẩn để cấy phôi) là: 79,17% - 80,0 ở bò tơ và 72,41 % - 72,92% ở bò lai HF sinh sản. Tỉ lệ bò động dục và tỉ lệ bò động dục có rụng trứng giữa hai phương pháp này không có sự khác nhau rõ rệt đối với cùng nhóm bò lai ( P >0,05) nhưng giữa hai nhón bò lai thì có sự khác nhau (P<0,05). Từ kết quả trên cho thấy khi gây động dục chủ động trên đàn bò tơ có tỉ lệ động dục cao hơn bò đã sinh sản : theo chúng tôi thì đàn bò sữa lai HF đã sinh sản và đang giai đoạn khai thác sữa nên khả năng thích ứng với hormone kém hơn. Kết quả này cao hơn so với kết quả của một số tác giả đã nghiên cứu trước đây khi sửa dụng thiết bị đặt âm đạo để gây động dục đồng pha như: Nguyễn Văn Lý và cs năm 2003, Hoàng Kim Giao, Lưu Công Khánh năm 2000: cho biết tỷ lệ động dục có rụng trứng ở bò lai HF đạt 64,14%. Nguyễn Thị Ước tỷ lệ động dục và tỷ lệ động dục có rụng trứng ở bò Laisind là 67,36% và 63,68%; Ở bò Holstein đạt 80,82% và 71,23% Kết quả nghiên cứu trên cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Anderson và cs -1982: Tỷ lệ bò động dục và thụ thai được cải tiến đáng kể khi ds]r dụng Progesterone kết hợp với Estradiol – 17 . Sử dụng Synchro-mate-B có thể cho kết quả 88% bò động dục, 70% thụ thai ở bò HF.(Trích Hoàng Kim Giao và cs năm 2000) Theo Macmillan KL and Peterson AJ. (1999): Tỷ lệ động dục ở bò tơ và bò sữaHolstein được cấy Progesteron vào trong âm đạo (CIDR) trong 12 ngày là 99% và 90 % , tỷ lệ bò có động dục cùng ngày là 72% và 70%, và việc bổ xung Estradiol-17 ngày đầu cấy Progesteron đem lại những cải tiến quan trọng : 94% bò trong trường hợp này có biểu hiện động dục đồng pha cùng ngày. 3.2. Kết quả cấy truyền phôi trên bò Trên cơ sở những bò có thể vàng nổi rõ (tốt) và thân sừng tử cung phát triển bình thường thì chúng tôi tiến hành cấy phôi. Kết quả thu được thể hiện như sau: 3.2.1. Kết quả cấy truyền phôi đối với bò gây động dục đồng pha bằng: PRID + PGF2 Bảng 2. Kết quả cấy truyền phôi đối với bò gây động dục đồng pha bằng: PRID + PGF 2 Phương pháp/Chỉ tiêu Loại phôi Số con cấy (n) Số con có chửa sau 21 ngày (n) Tỉ lệ có chửa (%) Số con đẻ (n) Tỉ lệ đẻ (%) PRID + PGF 2 Invivo 56 24 42,86 18 32.14 In vitro 33 12 36,36 10 30.30 CIRD + PGF 2 và Estradiol Invivo 40 17 42,5 12 30,0 In vitro 18 7 38,89 5 27,78 Sau 21 ngày cấy phôi nếu không thấy bò động dục trở lại, chúng tôi tiến hành chẩn đoán bò có chửa bằng phương pháp định lượng hocnone Progesterone (P4) trong mẫu máu hoặc mẫu sữa : những bò có hàm lượng P4 trong máu dao động từ 1,34ng/ml đến 1,68ng/ml là những bò có thể vàng hoạt động tốt và được coi là có chửa (Phan Văn Kiểm, Tăng Xuân Lưu và cs 2003). Kết hợp với chẩn đoán qua trực tràng kết quả cho thấy tỉ lệ có chửa sau 21 ngày: Đối với phương pháp gây động dục đồng pha bằng: PRID + PGF 2 : cấy phôi invivo đạt 42,86 % và cấy phôi invitro đạt 36,36%, tỷ lệ đẻ tương ứng là 32,14%, và 30,30%. Đối với phương pháp gây động dục đồng pha bằng: CIRD + PGF 2 và Estradiol: Cấy phôi invivo đạt 42,50 % và cấy phôi invitro đạt 38,89%, tỷ lệ đẻ tương ứng là 30,30%, và 27,78%. Không có sự khác nhau về tỉ lệ đậu thai và tỉ lệ đẻ giữa hai phương pháp gây động dục đồng pha đối với bò nhận phôi (P ˃0,05), nhưng tỉ lệ đậu thai và tỉ lệ đẻ của hai loại phôi thì có sự khác nhau (P˂0,05) giữa phôi invivo và phôi invitro. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỉ lệ có chửa và tỷ lệ đẻ do cấy phôi invivo cao hơn phôi invitro qua đó cho thấy khả năng sống và thích ứng của phôi invivo cao hơn phôi invitro, Kết quả này cao hơn kết quả nghiên cứu trước đây của Hoàng Kim Giao, Lưu Công Khánh (2003) cấy phôi trên bò sữa tỷ lệ có chửa là 38,0% và 35,32%, tỷ lệ đẻ tương ứng là 27,00%; 16,67%. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Church (1974) tỉ lệ có chửa dao động từ 35-80% tùy thuộc vào sự đồng pha giữa cái cho phôi và cái nhận phôi Nhưng thấp hơn so với kết quả của Lowson và cs (1975); Church và cs(1976), Sreenan và Breehan(1976) các tác giả cho biết nếu bò cái nhận phôi được chọn cẩn thận, thể trạng tốt, chăm sóc nuôi dưỡng chu đáo, trạng thái sinh lý phù hợp với tuổi phôi, tỉ lệ đậu thai đạt 50-60% nếu cấy một phôi và đạt đến 90% nếu cấy hai phôi. (Trích Hoàng Kim Giao 2003) Bùi Xuân Nguyên và cs, (2003) kết luận tỷ lệ có chửa cao nhất nếu cặp cho nhận phôi có độ lệch pha trong phạm vi 6 giờ đến 24 giờ. 3.3. Kết quả cấy phôi theo giai đoạn phát triển của phôi Trong quá trình theo dõi sự phân loại giai đoạn phôi và cấy phôi theo giai đoạn chúng tôi thu được kết quả như sau: Bảng 5. Kết quả cấy phôi theo giai đoạn Phôi theo giai đoạn phát triển Phôi invivo Phôi invitro Số phôi cấy (n) Bò có chửa (n) Tỷ lệ bò có chủa (%) Bê sinh ra (n) Tỷ lệ đẻ (%) Số phôi cấy (n) Bò có chua (n) Tỷ lệ bò có chủa (%) Bê sinh ra (n) Tỷ lệ đẻ (%) Phôi dâu 60 24 40.00 17 28.33 15 5 33.33 4 26.67 Phôi nang 36 16 44.44 13 36.11 36 14 38.89 11 30.56 Giai đoạn phát triển của phôi liên quan chặt chẽ đến sự đồng pha của con nhận và đến kết quả có chửa. Cấy phôi ở giai đọan phôi nang, cả hai loại phôi invivo và phôi invitro đều cho kết quả có chửa và kết quả bê sinh ra cao hơn so với cấy phôi ở giai đoạn phôi dâu : 44,44% so với 40,00% và 30,56% so với 26,67% . Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Inglesias (1971), và Alcales (1986), các tác giả cho rằng sự đồng pha giữa cái cho phôi và cái nhận phôi liên quan chặt chẽ đến tỷ lệ có chửa . Ở ngày 0 đạt 41,30% ; +1 ngày là 45,70% và -1 ngày là 33,33%. Theo Newcomb, 1979, tỷ lệ này là : 0 ngày là 62% ; +1 ngày là 50%; -1 ngày là 38%. 3.4. Khả năng sinh trưởng phát triển của bê sinh ra từ công nghệ phôi Tháng/ Giới n Khối lượng sơ sinh (kg) 3 tháng (kg) 6 tháng (kg) 9 tháng (kg) 12 tháng (kg) Q ua kết quả trên chú ng tôi nhận thấy trọng lượng sơ sinh của bê đực lớn hơn bê cái và bê sinh ra từ phôi invivo lớn hơn bê sinh ra từ phôi invitro. Sự sai khác này có ý nghĩa (với P ˂ 0,05). So với kết quả nghiên cứu trước đây của Trịnh Quang Phong, và Cs năm 2008 : Trọng lượng sơ sinh con đực biến động từ 28,69±0,69 kg – 33,67 ± 0,67 con cái: 25,8 8 ± 0,78 - 28,79 ± 0,84 kg , trọng lượng lúc 6 tháng tuooit tương ứng là: 112,50±5,48- 112,81±8,2 – 106,23 ±4,5- 107,32±6,2 kg. Theo tác giả Tăng Xuân Lưu và Cs năm 2003 khi nghiên cứu trên bê lai HF cho kết quả : con cái trọng lượng sơ sinh: 29,20 ± 0,23 kg, 6 tháng: 117,57 ± 5,38; 12 tháng: 175,78 ± 4,93 (2003). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cao hơn các nghiên cứu trước đây. Điều này cũng hoàn toàn phù hợp vì điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng hiện nay người chăn nuôi đầu tư tốt hơn trước đây, mặt khác trong điều kiện đầu tư cho chăn nuôi bò sữa hiện nay là rất cao trong các nông hộ tư nhân. Trong quá trình theo dõi khả năng sinh trưởng phát triển của những bê này chúng tôi chưa thấy có khiến quyết nào xẩy ra , mọi sinh trưởng phát triển của bê đều bình thường nhu các bê sinh ra từ thụ tinh nhân tạo. 4. Kết luận và đề nghị 4.1. Kết luận Cải tiến phương pháp gây động dục trên bò nhận phôi bằng thiết bị đặc âm đao kết hợp với hormone đạt kết quả cao hơn phương pháp gây động dục đông pha trước đây đối với thiết bị đặt âm đạo Tỉ lệ đậu thai và tỉ lệ đẻ của bò được cây phôi invivo cao hơn phôi invitro Khả năng tăng khối lượng của bê được sinh ra do cấy truyền phôi invivo cao hơn phôi invitro. 4.2. Đề nghị Công nhận kết quả tạo phôi bò cao sản bằng phôi invivo và invitro là tiến bộ kỹ thuật . phôi tính (con) Phôi invivo Đực 14 32,5 ± 0,87 - - - - Cái 8 31,54 ±0,65 83,38 ±0,68 165,39±0,55 206,15±1, 12 241,34 ± 1,54 Phôi invitro Đực 11 29,9 ± 0,79 - - - - Cái 7 29,08 ±0,63 76,71 ±0,63 151,99 ±0,62 193,78 ±1,1 226,68 ±1,18 Tài liệu tham khảo 1. Nguyễn Văn Lý, Nguyễn Thị Thoa ,Lưu Công Khánh , Phan Lê Sơn, Đặng vũ Hoà, Đỗ Kim Tuyên, Hoàng Kim Giao (2003). Nghiên cứu tạo bê bằng phôi thụ tinh ống nghiệm. Hội nghị khoa học công nghệ sinh học toàn quốc 12/2003. Nhà xuất bản khoa học và kỵ thuật , Hà Nội: 598-562 2. Lưu Công Khánh, Hoàng Kim Giao, Nguyễn Văn Lý và Nguyễn Thị Kim Anh (2000). Kết quả gây động dục đồng pha cho bà nhận phôi bằng CIDR. Nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm số 6: 102-104. 3. Lưu Công Khánh, Hoàng Kim Giao, Nguyễn Văn Lý và Nguyễn Thị Kim Anh (2000). Kết quả gây động dục đồng pha cho bà nhận phôi bằng Prostaglandin F2 . Nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm số 9 : 401-402. 4. Lưu Công Khánh, Hoàng Kim Giao, Nguyễn Văn Lý Nguyễn Thanh Dương (1999). Nghiên cứu cấy truyền phôi bò và kết quả triển khai trong sản xuất. Báo cáo khoa học chăn nuôi thú y toàn quốc: 25-29. 5. Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Thị Ước, Lê Văn Ty, Quản Xuân Hữu, Nguyễn Trung Thành, Bùi Linh Chi, Nguyễn Văn Hạnh, Nguyễn Thùy Anh, Nguyễn Việt Linh, Bùi Xuân Nguyên (2003). Kết quả thụ tinh ống nghiệm và cấy phôi ở bò laisind. Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc. NXB khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 699-702. 6. Macmillan KL and Peterson AJ. (1999). A new intravaginal progesterone releasing device for cattle (CIDR) for oestrous synchronisation increasing pregnancy rates and the treatment of post-partum anoestrus. Animal Reproduction Science 33: 12-2 . về bò giống bò sữa có chất lượng cao của người chăn nuôi, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu cải tiến phương pháp gây động dục đồng pha và cấy truyền phôi bò sữa cao sản bằng công nghệ invivo. 3.2.1. Kết quả cấy truyền phôi đối với bò gây động dục đồng pha bằng: PRID + PGF2 Bảng 2. Kết quả cấy truyền phôi đối với bò gây động dục đồng pha bằng: PRID + PGF 2 Phương pháp/ Chỉ. Kết quả cải tiến phương pháp gây động dục đồng pha và cấy truyền phôi bò sữa cao sản bằng công nghệ Invivo và Invitro Tăng Xuân Lưu, Trịnh Văn Thuận,