I Đặt vấn đề II Giới thiệu về tế bào gốc Khái niệm Phân loại 3. Vai trò III Cấu trúc da và nguyên bào sợi Cấu trúc da Nguyên bào sợi IV Cơ chế biệt hóa tế bào gốc thành biểu bì da V Ứng dụng của tế bào gốc trung mô dây rốn trong ghép da 1. Thu nhận máu cuống rốn 2. Giai đoạn nuôi cấy sơ cấp tế bào của máu cuống rốn 3. Giai đoạn nuôi cấy thứ cấp 4. Biệt hoá MSC thành tế bào dạng nguyên bào sợi 5. Giai đoạn nuôi cấy nguyên sợi bào 6. Ghép nguyên sợi bào và kiểm tra thải loại VI Kết luận
Chủ đề 8: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC TRONG GHÉP DA GVHD : Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Vũ Tú Anh Nguyễn Đăng Tình Phạm Thị Ngọc Anh Trần Thị Ngọc Kiều Trần Thị Thúy Nga NỘI DUNG I/ Đặt vấn đề II/ Giới thiệu tế bào gốc Khái niệm Phân loại Vai trò III/ Cấu trúc da nguyên bào sợi Cấu trúc da Nguyên bào sợi IV Cơ chế biệt hóa tế bào gốc thành biểu bì da V/ Ứng dụng tế bào gốc trung mô dây rốn ghép da Thu nhận máu cuống rốn Giai đoạn nuôi cấy sơ cấp tế bào máu cuống rốn Giai đoạn nuôi cấy thứ cấp Biệt hoá MSC thành tế bào dạng nguyên bào sợi Giai đoạn nuôi cấy nguyên sợi bào Ghép nguyên sợi bào kiểm tra thải loại VI/ Kết luận I Đặt vấn đề: Cháu bé cấy nguyên bào sợi bị bỏng nước sôi (Ảnh: VTV) II Giới thiệu khái niệm Tế bào gốc tế bào có khả biệt hóa trình phát triển để trở thành loại tế bào trung ương phần thiếu thể II Giới thiệu Phân loại tế bào gốc VAI TRÒ Tế bào gốc tế bào có khả biệt hóa trình phát triển để trở thành loại tế bào trung ương Về mặt lý thuyết, tế bào gốc từ phôi giữ khả phân chia tái phân chia suốt đời Nguyên bào sợi tế bào đa năng, ứng dụng trong sản xuất vật liệu cấy ghép Sử dụng để nghiên cứu di truyền, y học, … III Nguyên bào sợi cấu trúc da Nguyên bào sợi: Nguyên bào sợi tế bào quan trọng giai đoạn liền vết thương Được nuôi cấy nhằm mục đích thu nhận chủ động nguồn tế bào, ứng dụng trị bỏng Cấu trúc da: lớp - Lớp biểu bì - Lớp trung bì - Lớp hạ bì Nuôi cấy thứ cấp: cấy chuyền tăng sinh MSC Cấy chuyền: - Loại bỏ môi trường cũ, rửa tế bào với 4-5 ml PBS có bổ sung Gentamycin( 10mg/ml) - Loại bỏ dịch rửa bổ sung 4-5 ml trypsin/EDTA 0,05% - Sau 15s, đổ bỏ dung dịch Enzyme - Giữ lại 1ml, tiếp tục ủ tủ ấm 370C, từ 2-3 phút - Trung hòa trypsin thừa 10ml IMDM 10% FBS, li tâm - Huyền phù tế bào chia cho bình nuôi - Cấy chuyền 5-7 lần kiểm tra độ tinh - Xác định mật độ tế bào/ml buồng đếm Neubauer Biệt hóa tế bào: Môi trường cảm ứng biệt hóa Môi trường bản: DMEM bổ sung 5% FBS 1% kháng sinh Các bước biệt hóa Cấy tế bào đĩa nuôi mật độ 5000tb/cm2 Duy trì tế bào gốc trung mô môi trường nuôi cấy tế bào gốc Thay môi trường sau môi 2-3 ngày Khi tế bào bám ổn định vào bề mặt đĩa nhựa nuôi cấy hút bỏ môi trường tăng trưởng Tráng rửa tế bào đĩa nuôi PBS Duy trì tế bào đĩa nuôi môi trường nuôi cấy cảm ứng nguyên bào sợi Hàng ngày thay ½ môi trường đĩa môi trường Theo dõi phát triển biến đổi hình thái tế bào kính hiển vi Kiểm tra biểu số gen đặc trưng cho tế bào biểu mô RT-PCR : Thu nhận RNA tổng số tế bào biệt hóa Trizol Phản ứng RT-PCR thực kít AccessQuickTM RTPCR ( Promega , Hoa Kỳ ) Phản ứng phiên mã ngược : 45 phút 45oC, kết thúc 95 OC phút Chu trình nhiệt PCR ( 35 chu kì ): 35X 94 0C 45 giây 55-60 OC 45 giây 72 0C phút Ủ 10 phút 72 OC Sản phẩm PCR điện di gel Agarose 2% quan sát hệ thống chup gel tự động GelDoc It ( UVP, Hoa Kỳ) Hình : Kết phân tích RT_PCR biểu gen CK18 (149bp), β1-integrin (640bp) , CK19 (460bp) p63 (611bp) 1: Tế bào đối chứng ; 2: tế bào biệt hóa sau tuần ; 3: tế bào biệt hóa sau tuần Trình Tự primer : CK18(149bp) F :TGGTACTCTCCTCAATCTGCTG R: CTCTGGATTGACTGTGGAAGT CK19(460bp) F:AGGTGGATTCCGCTCCGGGC R: ATCTTCCTGTCCCTCGAGCA P63 (611bp) F:CAGACTCAATTTAGTGAG R: AGCTCATGGTTGGGGCAC β1-Integrin (640bp) F: AATGTTTCAGTGCAGAGCC R: TTGGGATGATGTCGGGA Nuôi cấy nguyên bào sợi Chuẩn bị giá đỡ tế bào Cấy tế bào lên giá đỡ Theo dõi đánh giá tế bào nuôi cấy NUÔI CẤY THƯỜNG DIẾN RA TRONG VÒNG 14 NGÀY Hình ảnh nguyên bào sợi hình thành Ghép nguyên sợi bào kiểm tra thải loại KIỂM TRA THẢI LOẠI Kết phân tích western blot phát có mặt kháng nguyên HLA-G HLA-E dịch nghiền tế bào gốc trung mô màng dây rốn cho thấy tất mẫu tế bào biểu lộ kháng nguyên HLA-G Click to edit Master text styles Second level Third level Fourth level Fifth level Mức độ biểu HLADR chiếm 1,9 ± 1,53% Mức độ biểu dấu ấn CD90 đặc thù tế bào gốc trung mô đạt tới 92,65 ± 6,3% Như vậy, tế bào gốc trung mô dây rốn có biểu cao dấu ấn CD90 đặc thù kháng nguyên hòa hợp tổ chức HLA -DR, HLA-E, Tế bào gốc trung mô dây rốn có tính sinh miễn dịch thấp Trên 98% số tế bào thuộc quần thể TBGTM màng dây rốn nằm vùng M1 Trong đó, 92% số tế bào nằm vùng M2 phân tích với kháng thể kháng CD90 Điều tái khẳng định tế bào phân tích TBGTM Kết phân tích 15 mẫu TBGTM màng dây rốn cho mức độ biểu VI Kết luận Thu nhận nuôi cấy thành công tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người Tế bào gốc trung mô dây rốn có đặc tính sinh miễn dịch thấp Tế bào gốc trung mô dây rốn cảm ứng để biệt hóa thành nguyên bào sợi môi trường định hướng in vitro Ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn mô hình vết thương bỏng an toàn có tác dụng tích cực điều trị vết thương KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu việc đáp ứng miễn dịch người để nhanh chóng ứng dụng lâm sàng TÀI LIỆU THAM KHẢO Công nghệ sinh học người động vật – Phan Kim Ngọc Công nghệ tế bào gốc – Phan Kim Ngọc Đề tài “Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người để điều trị vết thương bỏng nhiệt thực nghiệm” (Bác sĩ Phan Minh Hoàng – Học viện Quân Y Hà Nội) Tạp chí sinh học 2014, 36(1) – Biệt hóa tế bào gốc trung mô dây rốn thành tế bào giống tế bào biểu mô da Cảm ơn cô bạn ý lắng nghe theo dõi thuyết trình nhóm !!! [...]... chứa ba loại tế bào chính: • Tế bào gốc tạo máu (Hemapoietic Stem Cell_HSC) • Tế bào máu trưởng thành • Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem 2 Nuôi cấy sơ cấp tế bào của máu cuống rốn: Chọn lọc MSC - Ly tâm trên gradient nồng độ Ficoll-paque (Sigma) ở tốc độ 2.500 vòng/phút, trong 5 phút - Thu nhận phân đoạn chứa các tế bào đơn nhân nằm giữa lớp Ficoll-paque và lớp huyết tương bên trên - Tế bào đơn nhân... hóa tế bào: Môi trường cảm ứng biệt hóa Môi trường cơ bản: DMEM được bổ sung 5% FBS và 1% kháng sinh Các bước biệt hóa Cấy tế bào trong đĩa nuôi ở mật độ 5000tb/cm2 Duy trì tế bào gốc trung mô trong môi trường nuôi cấy tế bào gốc Thay môi trường sau môi 2-3 ngày Khi tế bào bám ổn định vào bề mặt đĩa nhựa nuôi cấy thì hút bỏ môi trường tăng trưởng Tráng rửa tế bào trong đĩa nuôi bằng PBS Duy trì tế bào. .. tái khẳng định tế bào được phân tích là TBGTM Kết quả phân tích 15 mẫu TBGTM màng dây rốn cho mức độ biểu hiện của VI Kết luận Thu nhận và nuôi cấy thành công tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người Tế bào gốc trung mô dây rốn có đặc tính sinh miễn dịch thấp Tế bào gốc trung mô dây rốn có thể cảm ứng để biệt hóa thành nguyên bào sợi trong môi trường định hướng in vitro Ghép tế bào gốc trung mô màng... Phan Kim Ngọc Công nghệ tế bào gốc – Phan Kim Ngọc Đề tài “Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người để điều trị vết thương bỏng nhiệt thực nghiệm” (Bác sĩ Phan Minh Hoàng – Học viện Quân Y Hà Nội) Tạp chí sinh học 2014, 36(1) – Biệt hóa tế bào gốc trung mô dây rốn thành tế bào giống tế bào biểu mô da Cảm ơn cô và các bạn đã chú ý lắng nghe và theo dõi bài thuyết trình của nhóm !!! ...IV Cơ chế biệt hóa tế bào gốc thành biểu bì da V ỨNG DỤNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÁU CUỐNG RỐN Quy trình 1.Thu nhận máu cuống rốn 2.Giai đoạn nuôi cấy sơ cấp 3.Giai đoạn nuôi cấy thứ cấp 4 Biệt hoá MSC 5 Giai đoạn nuôi cấy nguyên sợi bào 6 Ghép nguyên sợi bào và kiểm tra và thải loại IV ỨNG DỤNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÁU CUỐNG RỐN 1 Thu nhận máu cuốn rốn - Máu... độ biểu hiện dấu ấn CD90 đặc thù của tế bào gốc trung mô đạt tới 92,65 ± 6,3% Như vậy, tế bào gốc trung mô dây rốn có biểu hiện cao về dấu ấn CD90 đặc thù và các kháng nguyên hòa hợp tổ chức HLA -DR, HLA-E, Tế bào gốc trung mô dây rốn có tính sinh miễn dịch thấp Trên 98% số tế bào thuộc quần thể TBGTM màng dây rốn nằm trong vùng M1 Trong khi đó, trên 92% số tế bào này nằm trong vùng M2 khi phân tích... tuần ; 3: tế bào biệt hóa sau 3 tuần Trình Tự primer : CK18(149bp) F :TGGTACTCTCCTCAATCTGCTG R: CTCTGGATTGACTGTGGAAGT CK19(460bp) F:AGGTGGATTCCGCTCCGGGC R: ATCTTCCTGTCCCTCGAGCA P63 (611bp) F:CAGACTCAATTTAGTGAG R: AGCTCATGGTTGGGGCAC β1-Integrin (640bp) F: AATGTTTCAGTGCAGAGCC R: TTGGGATGATGTCGGGA 5 Nuôi cấy nguyên bào sợi Chuẩn bị giá đỡ tế bào Cấy tế bào lên giá đỡ Theo dõi và đánh giá tế bào nuôi cấy... bào nuôi cấy NUÔI CẤY THƯỜNG DIẾN RA TRONG VÒNG 14 NGÀY Hình ảnh nguyên bào sợi được hình thành 6 Ghép nguyên sợi bào và kiểm tra thải loại KIỂM TRA THẢI LOẠI Kết quả phân tích bằng western blot phát hiện sự có mặt của các kháng nguyên HLA-G và HLA-E trong dịch nghiền tế bào gốc trung mô màng dây rốn cho thấy tất cả các mẫu tế bào đều biểu lộ cả kháng nguyên HLA-G và Click to edit Master text styles... bằng PBS Duy trì tế bào trong đĩa nuôi bằng môi trường nuôi cấy cảm ứng nguyên bào sợi Hàng ngày thay thế ½ môi trường trong đĩa bằng môi trường mới Theo dõi sự phát triển cũng như biến đổi hình thái tế bào trên kính hiển vi Kiểm tra biểu hiện 1 số gen đặc trưng cho tế bào biểu mô bằng RT-PCR : Thu nhận RNA tổng số của tế bào biệt hóa bằng Trizol Phản ứng RT-PCR thực hiện bằng bộ kít AccessQuickTM RTPCR... Chu trình nhiệt PCR ( 35 chu kì ): 35X 94 0C trong 45 giây 55-60 OC trong 45 giây 72 0C trong 1 phút Ủ 10 phút ở 72 OC Sản phẩm PCR được điện di trên gel Agarose 2% và quan sát bằng hệ thống chup gel tự động GelDoc It ( UVP, Hoa Kỳ) Hình : Kết quả phân tích RT_PCR biểu hiện gen CK18 (149bp), β1-integrin (640bp) , CK19 (460bp) và p63 (611bp) 1: Tế bào đối chứng ; 2: tế bào biệt hóa sau 1 tuần ; 3: tế ... tế bào gốc Khái niệm Phân loại Vai trò III/ Cấu trúc da nguyên bào sợi Cấu trúc da Nguyên bào sợi IV Cơ chế biệt hóa tế bào gốc thành biểu bì da V/ Ứng dụng tế bào gốc trung mô dây rốn ghép da. .. II Giới thiệu Phân loại tế bào gốc 3 VAI TRÒ Tế bào gốc tế bào có khả biệt hóa trình phát triển để trở thành loại tế bào trung ương Về mặt lý thuyết, tế bào gốc từ phôi giữ khả phân chia... cuống rốn chứa ba loại tế bào chính: • Tế bào gốc tạo máu (Hemapoietic Stem Cell_HSC) • Tế bào máu trưởng thành • Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem Nuôi cấy sơ cấp tế bào máu cuống rốn: Chọn