phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ lớp whartsons jelly dây rốn người

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN THỊ DUNG Tên đề tài: “PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TỪ LỚP WHARTSON'S JELLY DÂY RỐN NGƢỜI” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa Khóa học : Chính quy : Công nghệ sinh học : CNSH - CNTP : 2011-2015 Thái Nguyên, năm 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN THỊ DUNG Tên đề tài: “PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TỪ LỚP WHARTSON'S JELLY DÂY RỐN NGƢỜI” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2011-2015 Giản viên hƣớng dẫn : Th.S Vi Đại Lâm Khoa CNSH - CNTP - Đại học Nông Lâm TS Nguyễn Văn Hạnh Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm khoa học Thái Nguyên, năm 2015 i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập, nghiên cứu thực khóa luận, nhận giúp đỡ đóng góp ý kiến quý báu thầy cô giáo bạn Trước hết, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS NGUYỄN VĂN HẠNH nguyên Phó Trưởng phòng - Phòng Công nghệ Phôi – Viện CNSH Người định hướng nghiên cứu, tạo điều kiện, bảo, giúp đỡ suốt trình làm khóa luận Ngoài xin gửi lời cảm ơn, biết ơn sâu sắc tới Ths Vi Đại Lâm – Khoa Công nghệ sinh học – Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Thầy ủng hộ, giúp đỡ tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm làm việc cho trình thực nghiên cứu Tôi xin cảm ơn qúy thầy cô Hội đồng giám khảo, thầy cô nghiệm thu để em tiến hành thực khóa luận này! Tôi gửi lời cảm ơn đến Ths Lê Bắc Việt, cử nhân Nguyễn Thanh Ngà người anh, người chị sở thực tập ân cần bảo ban động viên lúc khó khăn nghiên cứu Tôi ghi nhớ trân trọng Sinh viên Trần Thị Dung ii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Dữ liệu biểu thị bề mặt MSCs 13 Bảng 3.1 Thành phần môi trường nuôi cấy cho 1000ml môi trường 23 Bảng 3.2 Trình tự mồi chạy RT - PCR 29 Bảng 3.3 Thành phần cho phản ứng RT - PCR 30 Bảng 3.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT - PCR 30 Bảng 4.1 Kết tách RNA 35 Bảng 4.2 Kết biểu marker thị 37 iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Khả tự đổi MSCs Hình 2.2 Tiềm biệt hóa MSCs Hình 2.3 Những giải thích cho tính mềm dẻo tế bào gốc Hình 2.4 Cấu tạo dây rốn 11 Hình 3.1 Mẫu dây rốn trước xử lý 22 Hình 3.2 Phân lập mảnh mô dây rốn đĩa nuôi 22 Hình 3.3 Mảnh mô để khô đĩa nuôi giếng 24 Hình 3.4 Xử lý MSCs enzyme, tế bào bong nhiều, tách khỏi mặt đĩa 25 Hình 4.1 Tế bào bắt đầu mọc từ rìa mảnh mô 32 Hình 4.2 Tế bào 80% dạng hợp lưu 34 Hình 4.3 Tế bào cấy chuyển 35 Hình 4.4 Kết điện di với marker thị 36 Hình 4.5 Tế bào giải đông 38 iv DANH MỤC VIẾT TẮT CD Cluster of differentiation (Cụm biệt hóa) CHT Enzyme collagenase / hyaluronidase/trypsin CT Collagenase/ trypsin DMEM/F12 Môi trường Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium/ Ham 12 DNA A xít Deoxyribonucleic dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate EDTA A xít Ethylene diamine tetra acetic EGF Epidermal growth factor (Yếu tố tăng trưởng lớp biểu bì) FBS Fetal bovine serum (Huyết bào thai bò) FGF Fibroblast growth factor (Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi) HLA Human leukocyte antigen (Kháng nguyên bạch cầu người) HNF4α Hepatocyte nuclear factor (Yếu tố nhân tế bào gan) hWJSCs Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Stem Cells (Tế bào gốc từ lớp WJ dây rốn người) ITS Insulin – transferin - selenium MSC Mesenchymal stem cell (Tế bào gốc trung mô) PBS Phosphate buffer saline (Dung dịch đệm phosphate) RNA Ribonucleic Acid RT – PCR Reverse transcription Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi tổng hợp phiên mã ngược hay PCR phiên mã ngược) Trp tripsin / EDTA WJ Wharton’s jelly (Thạch Wharton’s) TBG Tế bào gốc v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC VIẾT TẮT iv MỤC LỤC v PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu đề tài 1.2.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học 2.1.1 Tế bào gốc 2.1.2 Tế bào gốc trung mô 2.1.3 Tế bào gốc trung mô dây rốn 10 2.2 Nghiên cứu nước nước 19 2.2.1 Trong nước 19 2.2.2 Nước 20 PHẦN ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 21 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 21 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành 21 vi 3.3 Nội dung nghiên cứu 21 3.4 Phương pháp nghiên cứu 21 3.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 21 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Phân lập nuôi cấy tế bào 32 4.2 Kĩ thuật cấy chuyển 34 4.3 Kết tách RNA 35 4.4 Biểu marker MSCs tế bào nuôi cấy 35 4.5 Phương pháp lạnh đông 37 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 5.1 Kết luận 39 5.2 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 I, Tài liệu tiếng việt 41 II, Tài liệu tiếng anh 42 III, Tài liệu internet 43 PHỤ LỤC A, Nguyên vật liệu, vật tư, trang thiết bị A.1 Dụng cụ vật tư tiêu hao A.2 Thiết bị nghiên cứu A.3 Hóa chất PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Khoa học phát số loài vật thằn lằn, biển tái tạo phận thể chúng Con người có chung đặc điểm Mặc dù thể tái tạo phận thể tế bào máu, tế bào da thường xuyên tái sinh nhờ tế bào “toàn năng”, lần phát trình tiến hành thí nghiệm với tủy xương vào năm 1950 dẫn đến phát tồn tế bào gốc thể (TS Phạm Mạnh Hùng, 2008) [7] Nguồn tế bào gốc sử dụng cho nghiên cứu thu nhận từ nhiều nguồn khác tế bào gốc lấy từ phôi, dịch ối Tuy nhiên, nguồn tế bào cho có liên quan đến việc phá hủy phôi, tổn hại thai nhi, can thiệp thô bạo làm ảnh hưởng bất lợi cho thai nhi, phần lớn giáo hội công giáo trị gia phản đối gay gắt cho vấn đề xâm phạm đến đạo đức, niềm tin tôn giáo Tế bào gốc thu nhận từ mô người trưởng thành tủy xương, máu ngoại vi, nang lông…Tuy nhiên vấn đề gặp phải khó khăn kỹ thuật (Logeart-Avramoglou D cs, 2005) [18], hạn chế số lượng, tế bào thu ít, ảnh hưởng đến sức khỏe, già khó biệt hóa (Bobis S cs, 2006) [14], có nguy tiềm nhiễm virus trình phân lập MSCs từ tủy xương (Romanov Y A cs, 2003) [23] Hiện nay, nhà khoa học cố gắng tìm kiếm nguồn tế bào gốc để phục vụ cho nhu cầu nghiên cứu thực tiễn Những báo cáo gần rằng, nguồn rác thải y tế, dây rốn trẻ sơ sinh có chứa tế bào gốc có khả biệt hóa cao, gọi tế bào gốc trung mô Đây cho phát quan trọng thu thập tế bào gốc mà không gây tổn thương tới thể người nên bị cản trở vấn đề luật pháp đạo đức nghiên cứu Tế bào gốc dây rốn tế bào gốc nhũ nhi, trẻ nên khả phân chia tốt số lượng tế bào thu trực tiếp sau tăng sinh in vitro lớn Nó có đặc điểm giống tế bào gốc trưởng thành (có tiềm biệt hóa đa năng) (Trương Định cs, 2009) [4] Các nghiên cứu công bố trước cho biết, thu tế bào gốc máu tế bào gốc trung mô (MSCs) từ nguồn khác dây rốn máu dây rốn, lớp Wharton’s jelly (WJ lớp mô đệm dây rốn), màng lót lớp nội mô tĩnh mạch dây rốn (Nguyễn Hồng Trường, 2011) [11] Trong số đó, phân lập MSCs từ lớp Wharton’s jelly dây rốn hướng nghiên cứu rộng rãi MSCs từ lớp Wharton’s jelly đánh giá cao tiềm ứng dụng, tiến hành nghiên cứu đề tài “Phân lập nuôi cấy tế bào gốc từ lớp Whartson's jelly dây rốn ngƣời” để hoàn thiện quy trình phân lập tìm thị bề mặt có vai trò việc nhận biết MSCs từ lớp Wharton’s jelly dây rốn, chủ động nguồn tế bào gốc trung mô phục vụ cho nghiên cứu sau 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu đề tài - Phân lập tế bào gốc trung mô từ lớp Whatson's jelly dây rốn người - Nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ lớp Whatson's jelly dây rốn người - Tạo ngân hàng tế bào gốc dây rốn phục vụ mục đích nghiên cứu tương lai 1.2.2 Yêu cầu đề tài - Phân lập thành công tế bào gốc trung mô từ lớp Whatson's jelly dây rốn người 31 Hoàn thành Giữ sản phẩm  720 C 10 phút30 giây 150 C Chạy điện di kiểm tra kết RT – PCR Gel chạy điện di: Agarose 1.5% trộn dung dịch gồm μl mẫu μl loading dye 6x, mix đều, cho dung dịch vào giếng gel Điện di 30 phút với cường độ dòng điện 250mA hiệu điện 100V  Nhuộm mẫu: Sau điện di, gel lấy từ buồng điện di ngâm vào dung dịch ethidium bromide khoảng 15 – 20 phút  Quan sát kết điện di tia UV nhờ vào máy chụp ảnh DNA 32 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Dây rốn vận chuyển từ bệnh viện đưa vào phòng thí nghiệm nuôi cấy để phân lập tế bào, dây rốn rửa bên nước muối sinh lý 2–3 lần, sau rửa với PBS Sau loại bỏ mạch máu rửa tế bào máu mức tốt có thể, mảnh mô cắt nuôi cấy đĩa nuôi có chứa môi trường DMEM/F12, bổ sung 10% FBS 4.1 Phân lập nuôi cấy tế bào Các mảnh mô cuống rốn sau thu nhận nuôi môi trường DMEM/F12 để thu tế bào đơn Sau ngày phân lập nuôi cấy, mẫu phân lập enzyme quan sát thấy tế bào đơn mọc từ rìa mảnh mô (Hình 4.1A) Sau ngày nuôi cấy, mẫu phân lập phương pháp học thay môi trường lần đầu tiên, sau môi trường thay ngày/1 lần Đến ngày nuôi cấy thứ 22, quan sát thấy tế bào bắt đầu mọc từ rìa mảnh mô (Hình 4.1B) Hình 4.1: Tế bào mọc từ rìa mảnh mô đĩa nuôi cấy cuống rốn A (Bên trái): Mảnh mô sử lý phương pháp enzyme B (Bên phải): Mảnh mô sử lý phương pháp học 33 Quan sát kính hiển vi soi ngược thấy số lượng tế bào tế bào mọc từ rìa mảnh mô, hình thái ban đầu tế bào có dạng nguyên bào sợi, đan xen tế bào dạng tròn nhỏ, chúng không bám xuống bề mặt nuôi mà lơ lửng dạng huyền phù Sau 21 ngày nuôi cấy, tế bào có tiềm sinh sản lớn, tăng sinh nhanh tạo thành mảng song song với lớp cuộn xoắn gối lên Quần thể tế bào lúc chưa có độ đồng cao Có thể thấy bề mặt nuôi tế bào dạng nguyên bào sợi chiếm ưu có tế bào ngắn dạng tròn, nhỏ Đó tế bào phân chia từ tế bào ban đầu, chúng chưa bám xuống đĩa nuôi Phương pháp sử lý mảnh mô enzyme cho thấy thời gian thu nhận tế bào đơn ngắn so với phương pháp nuôi cấy mảnh mô Điều giải thích lớp mô liên kết mảnh mô cuống rốn bị enzyme phân cắt, giúp tế bào quan tâm dễ dàng tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng bên ngoài, đồng thời không gian cho trình phân bào mở rộng Khi tế bào đạt đến độ bao phủ bề mặt nuôi cấy 80% dạng nguyên bào sợi, theo dòng định (hợp lưu) (hình 4.3), tiến hành cấy chuyển 34 Hình 4.2: Tế bào 80% dạng hợp lƣu (Độ phóng đại x 10) Tế bào phát triển thành mảng song song, cuộn xoắn gối lên Mũi tên trắng: Các tế bào hình thoi giống nguyên bào sợi; Mũi tên xanh:Các tế bào ngắn dạng tròn, nhỏ 4.2 Kĩ thuật cấy chuyển Tiến hành cấy chuyển cách sử dụng trypsin/EDTA để thu lấy tế bào (tế bào có dạng tròn nhỏ bong khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy), cấy chuyển sang đĩa nuôi cấy khác có đường kính 35mm Sau cấy chuyển, Hình thái tế bào trì dạng nguyên bào sợi, mật độ tế bào đồng bề mặt đĩa nuôi cấy (Hình 4.3A) Các tế bào tách khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy sau sử lý enzyme khoảng phút Bất hoạt enzyme môi trường DMEM/F12 chứa huyết bào thai bò (FBS) Chuyển tế bào sang đĩa nuôi cấy Sau ngày cấy chuyền, quan sát thấy tế bào tăng sinh mạnh đĩa nuôi Hình thái tế bào trì dạng thon dài trước cấy truyền, mật độ tế bào 35 tiếp tục tăng cao (Hình 4.3B) Khi tế bào đạt 80% hợp lưu, tiến hành cấy truyền lần Hình 4.3: Tế bào sau cấy chuyển A (Bên trái): Tế bào sau cấy chuyển B (Bên phải): Tế bào cấy chuyển sau ngày nuôi cấy 4.3 Kết tách RNA Mẫu RNA sau tách chiết đo OD để xác định nồng độ độ tinh để sử dụng cho phân tích  Kết đo OD mẫu RNA tách chiết trình bày Bảng 4.1: Bảng 4.1: Kết tách RNA Lần tách Số lượng tế bào A260/A280 OD 5x106 1.949 ng/μl 0.229 5x106 1,978 ng/μl 0.232 5x106 1,995 ng/μl 0.235 Từ kết ta thấy, giá trị OD RNA cao 1,8 ≤ A260/A280 ≤ chứng tỏ RNA có độ cần thiết cho nghiên cứu phân tích 36 Như vậy, đánh giá quy trình tách chiết RNA sử dụng kít RNeasy® Mini Kit cho kết tốt 4.4 Biểu marker MSCs tế bào nuôi cấy Mẫu RNA sau xác định nồng độ độ tinh cần thiết sử dụng để chạy RT – PCR với mồi đặc hiệu, giá trị Tm mồi xấp xỉ nên thực lần chạy RT - PCR Phản ứng phiên mã ngược khuếch đại thực phản ứng với hỗn hợp enzyme chuẩn bị theo kít QIAGEN® OneStep RT – PCR Kit Sản phẩm RT – PCR kiểm tra, đánh giá điện di gel agarose 1.5%  Kết chạy điện di: Hình 4.4: Kết điện di với marker thị 37 Kết chạy điện di với marker thị trình bày qua bảng sau: Bảng 4.2: Kết biểu marker thị Tên marker Kích thước (bp) Biểu AFP 216 _ HNF4α 350 _ GATA4 290 + CD34 367 + Oct – 297 + CD86 290 + CD90 265 + HNF3β 230 + Eras 315 + TAT 800 + CD105 179 + CD73 308 + Từ hình 4.4 bảng 4.2 cho thấy, marker đặc trưng cho MSCs là: CD90, CD73, CD86, CD105 biểu Ngoài marker bổ sung khác biểu hiện, marker tế bào gốc phôi (Embryonic stem cells) như: Oct – 1, Eras Các yếu tố phiên mã tham gia vào trình phát triển quan có nguồn gốc từ nội bì hay trung bì như: GATA4, HNF3β biểu Hơn nữa, có diện phân tử CD86 protein thể tế bào trình diện kháng nguyên, cung cấp tín hiệu costimulatory (đồng kích thích) cần thiết cho việc kích hoạt tế bào T hệ thống miễn dịch thể Kết hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu marker MSCs khẳng định Trong nghiên cứu này, thử nghiệm marker tế bào gan đối chứng âm cho phản ứng RT - PCR, marker AFP 38 HNF4α Do chưa biệt hóa thành tế bào gan nên kết mong đợi, AFP HNF4α không biểu Đã phân lập nuôi cấy thành công tế bào gốc trung mô từ lớp WJ từ dây rốn người 4.5 Phương pháp lạnh đông Sử dụng hỗn hợp môi trường nuôi cấy chất bảo quản DMSO 10% thu nhận tế bào sau cấy chuyển Bảo quản ống lạnh đông 2ml nitơ lỏng (-1960C) Sau khoảng thời gian 10-20 ngày bỏ mẫu giải đông kiểm tra kết Ở môi trường nuôi cấy DMEM/F12 có bổ sung 10% FBS tiềm tăng sinh tế bào cao so với môi trường không bổ sung FBS, FBS có chứa nhiều yếu tố kích thích tăng trưởng tế bào (các chất dinh dưỡng, yếu tố tăng trưởng), nhiên huyết động vật nguồn gốc kháng nguyên gây nguy lây truyền virus động vật (ví dụ: Các prion) sử dụng MSCs lâm sàng, protein peptide kết hợp với MSCs sau gây phản ứng miễn dịch Do đề xuất giải pháp môi trường huyết quan tâm nuôi cấy tế bào động vật Hình 4.5: Tế bào giải đông A (Bên trái): Tế bào bắt đầu giải đông B (Bên phải): Tế bào giải đông sau ngày nuôi cấy 39 Tế bào quan sát thấy sau giải đông đạt mật độ khoảng 80% độ che phủ bề mặt đĩa nuôi cấy Tế bào dạng nguyên bào sợi, xếp sát tạo thành dòng chảy định (80% dạng hợp lưu) Sau nuôi cấy đến ngày thứ Bỏ mẫu quan sát kính hiển vi Các tế bào tiếp tục tăng sinh phát triển mạnh, xuất tế bào bị nhiễm hay tế bào chết chứng tỏ phương pháp lạnh đông thành công 40 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu thu được, kết luận sau:  Phân lập nuôi cấy thành công tế bào gốc trung mô từ lớp Wharton’s jelly dây rốn trẻ sơ sinh  Quần thể MSCs thu có hình thái tương đối đồng sau 2–3 tuần nuôi cấy chọn lọc, dương tính với marker tế bào gốc trung mô CD90, CD105 CD73 âm tính với marker tế bào biệt hóa dòng gan  Hoàn thiện quy trình bảo quản tế bào ni tơ lỏng -1960C đảm bảo trì đặc tính MSCs thời gian dài 5.2 Kiến nghị Từ kết thu được, đưa kiến nghị sau:  Tiếp tục theo dõi trì dòng tế bào gốc trung mô phân lập qua lần cấy chuyển  Thử nghiệm biệt hóa MSCs thành tế bào chuyên hóa để chứng minh tính đa tiềm chúng  Thử nghiệm chuyển gene trị liệu số bệnh vào MSCs tiến hành cấy ghép mô hình động vật 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO I, Tài liệu tiếng việt 1.Trần Văn Bé CS(2010), “Nghiên cứu máu dây rốn bệnh viện Truyền máu Huyết học Tp.HCM”, Kỷ yếu hội thảo nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc y học, tr.9-15 Nguyễn Tấn Bỉnh (2002), Bước đầu nghiên cứu phương pháp ghép tự thân TBGMNV không giữ đông lạnh để điều trị bệnh máu ác tính, Luận án Tiến sĩ Y học, ĐHYD TP.HCM Đỗ Đức Định , tạp chí nghiên cứu châu phi & trung đông số 11 (15) tháng 11/2006 Trương Định cs Phạm Văn Phúc, Phan Kim Ngọc(2009), Công nghệ Tế bào gốc, NXB Giáo dục Việt Nam Nguyễn Thị Thu Hà (2004) Tế bào gốc ứng dụng y sinh học TCNCYDH phụ 32 (6): 13-26 Nguyễn Văn Hạnh, Vi Đại Lâm, Nguyễn Thanh Ngà(2015), “Nghiên cứu tác động DMSO biệt hóa tạo tế bào giống tế bào gan từ gốc cuống rốn”, Tạp chí sinh học 2015,37(lse): 190-195 Phạm Mạnh Hùng, Lê Văn Đông(2005), Tế bào gốc trạng nghiên cứu, ứng dụng tế bào gốc Việt Nam, Bộ Giáo dục Đào tạo Trường Đại học Duy Tân Phan Kim Ngọc(2009), công nghệ tế bào gốc, NXB Giáo Dục Phạm Văn Phúc, Phan Kim Ngọc(2006), Công nghệ sinh học người động vật, NXB Giáo dục, pp367-391 10 Phạm Thúy Trinh, Trương Định, Trương Thị Thu Huyền, Phạm Văn Phúc, Đỗ Minh Trung, Lê Văn Đông(2010), “Nghiên cứu phân lập tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn trẻ sơ sinh”, Tạp trí Thông tin Y dược, trang 1–6 11 Nguyễn Hồng Trường (2010), “Đánh giá quần thể tế bào gốc trung mô phân lập từ lớp lót tĩnh mạch dây rốn trẻ sơ sinh nuôi cấy in vitro” ĐH Khoa học Tự nhiên Hà nội, trang – 16 12 Mai Mạnh Tuấn, Chu Quốc Trường, Trần Thanh Loan, Bùi Thị Nga, Nguyễn Thông, Phan Toàn Thắng(2007), “Kết bước đầu sử dụng tế bào gốc trung mô dây rốn điều trị vết thương”, TC Nghiên cứu y dược học cổ truyền Việt Nam, Trang 27–33 42 II, Tài liệu tiếng anh 13 Barry F.P and Murphy J.M.(2004), “Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization”, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 36 (4), pp 568–584 14 Bobis S., Jarocha D., and Majka M(2006), “Mesenchymal stem cells: characteristics and clinical applications.” Folia Histochem Cytobio, 44 (4), pp 215–230 15 Bongso A., Fong C Y(2012), “The Therapeutic Potential, Challenges and Future Clinical Directions of Stem Cells from the WJ of the Human Umbilical Cord”, Stem Cell Rev and Re, 9, pp 226–240 16 Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, Deans R, Keating A, Prockop Dj, Horwitz E(2006), “Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells”, The International Society for Cellular Therapy position statement, Cytotherapy 8(4):315-7 17 Jinlian Hua, Pubin Qiu, Haijing Zhu, Hui Cao, Fang Wang Wei Li(2011), “Multipotent mesenchymal stem cells (MSCs) from human umbilical cord: Potential differentiation of germ cells ”, African Journal of Biochemistry Research, 5(4), 113-123 18 Logeart-Avramoglou D.; Anagnostou F.; Bizios R.; Petite H(2005) “Engineering bone: challenges and obstacles”, J Cell Mol Med 9, 72– 84 19 Monnipha Sila-ASNA, V Nardone, R Zonefrati, C Mavilia, C Romagnoli, S Ciuffi, S Fabbri, G Palmini, G Galli, A Tanini, and M L Brandi (2007), “Osteoblast Differentiation and Bone Formation Gene Expression in Strontium-inducing Bone Marrow Mesenchymal”, Stem Cell, Kobe Journal of Medical Sciences, 53(1), pp 25-35 20 Parvin Salehinejad & Noorjahan Banu Alitheen &Abdul Manaf Ali & Abdul Rahman Omar &Maryam Mohit & Ehsan Janzamin &Fazel Sahraneshin Samani & Zahra Torshizi &Seyed Noureddin Nematollahi-Mahani (2012), “Comparison of different methods for the isolation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord Wharton’s jelly”, In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal, 48, pp 75-83 43 21 Payushina O., Domaratskaya E., and Starostin V.(2006), “Mesenchymal stem cells: Sources, phenotype, and differentiation potential”, Biology Bulletin, 33(1), pp 2–18–18 22 Qian Qian, Hui Qian, Xu Zhang, Wei Zhu, Yongmin Yan, Shengqin Ye, Xiujuan Peng , Wei Li, Zhe Xu, Lingyun Sun, Wenrong Xu(2012), “Azacytidine Induces Cardiac Differentiation of Human Umbilical Cord-Derived”, Mesenchymal Stem Cells by Activating Extracellular Regulated Kinase Stem Cells Dev, 21(1): 67–75 23 Romanov Y A.; Svintsitskaya V A.; Smirnov V N(2003) “Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells: candidate MSC-like cells from umbilical cord”, Stem Cells 21, 105– 110 24 Toai T., Thao H., cs(2009), “In vitro culture and differentiation of osteoblasts from human umbilical cord blood”, Cell and Tissue Banking, 11 (3), pp 269–280–280 25 William Tse, Mary J Laughlin(2005), “Umbilical cord blood transplantation: A new alternative option”, Hematology 377-383 26 Ying N Z., C L Puv and W Xing(2009), “Differentiation of mesenchymal stromal cells derived from umbilical cord WJ into hepatocyte-like cells”, Cytotherapy, 11(5), pp 548–558 III, Tài liệu internet 27 http://khoahoc.tv/khampha/sinh-vat-hoc/20361_tim-hieu-ve-te-b-o-gocphan-1.aspx 28 http://www.anninhthudo.vn/xa-hoi/ngan-hang-mau-cuong-ron-cong-dongy-nghia-nhan-van-to-lon/595191.antd 29 http://t5g.org.vn/Default.aspx?u=dt&id=6970 30 http://www.kilobooks.com/phan-lap-te-bao-goc-trung-mo-tu-day-ron-treso-sinh-343010 31 http://chiasetailieu.vn/threads/nghien-cuu-xay-dung-ngan-hang-te-baogoc-day-ron-khu-vuc-mien-nam-va-ung-dung-dieu-tri-benh-onguoi.29664/ 32 http://123doc.org/document/1141139-tieu-luan-cac-ky-thuat-pcr-va-ungdung-doc.htm 33 http://www.baomoi.com/Thai-phu-luu-y-Te-bao-goc-tu-day-ron-la-gia-trinhat/82/11092699.epi 44 PHỤ LỤC A, Nguyên vật liệu, vật tƣ, trang thiết bị A.1 Dụng cụ vật tư tiêu hao Các dụng cụ vật tư cần thiết sử dụng để thực thí nghiệm đề tài liệt kê sau đây: - Ống Falcon 15ml, 50ml - Đầu côn xanh,đầu côn vàng, pipet loại 1000μl, 200μl, 100μl, 10μl - Bộ đồ mổ gồm: dao, kéo nhỏ, kéo vừa, panh, kim tròn, kim mũi mác - Đĩa nuôi cấy tế bào giếng - Đĩa petri nhựa kích thước: 100x25, 90x15, 60x15, 50x9; đĩa petri thủy tinh - Xilanh loại 50ml, đầu lọc - Chai thủy tinh - Cốc đong 50ml, 250ml A.2 Thiết bị nghiên cứu Các thiết bị nghiên cứu cần thiết sử dụng đề tài gồm: Bảng Các thiết bị nghiên cứu đƣợc sử dụng đề tài Tên thiết bị Hãng sản xuất Nƣớc sản xuất Kính hiển vi soi ngược Nikon Nhật Buồng cấy vô trùng Bassaire Anh Tủ lạnh Sanyo Nhật Máy ly tâm Sigma Mỹ Tủ sấy Binder Đức Tủ ấm CO2 Sanyo Nhật Máy RT – PCR Eppendorf CHLB Đức Máy chụp gel Biorad USA Và số thiết bị khác Bộ nguồn buồng điện di, Máy vortex, Máy ảnh, 45 A.3 Hóa chất Các hóa chất nuôi cấy xử lý nêu chi tiết bảng Bảng Các hóa chất sử dụng đề tài Hãng sản xuất Nước sản xuất Gibco Mỹ Gibco Mỹ Sigma Mỹ Gibco Mỹ L-glutamin Gibco Mỹ RT-PCR kit Qiagen Mỹ Tên hóa chất Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) Fetal Bovine Serum(FBS) Trypsin Phosphate buffer saline (PBS)