Bài viết Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc tủy răng chuột trình bày thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào gốc tủy răng chuột được tiến hành trên 15 mẫu tủy răng chuột nhắt trắng Mus musculus var. albino 2 - 3 tuần tuổi. Răng cửa hàm dưới chuột được xử lý bằng dung dịch Peniciline 400UI/ml, Streptomycine 400µg/ml trong 20 phút,... Mời các bạn cùng tham khảo.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Summary PURIFICATION OF RECOMBINANT CELL PERMEABLE PROTEINS AND THE POSSIBILITY FOR PROTEIN THERAPY Inactivated proteins caused many human diseases Protein therapy is one of the therapies for many diseases related to a defected protein or inhibitor of a biological process to stop the growth of the tumor Here, we present the results of improved recombinant cell-penetrating peptides (rCPPs) These rCPPs can serve as new tools for delivering protein in biology and medicine applications We cloned the CPP in-frame with green fluorescent protein (rCPP - GFP) We were able to express and purify full-length rCPP - GFP fusion proteins The results showed that, each purified r.protein was tested in Hela and Jurkat cell lines for their transduction efficiency and translocation The purified rCPPs - GFP fusion proteins have biological activity as good as HIV virus derived TAT - EGFP peptides The expressed rCPPs-EGFPs were able to translocate across both the cytoplasm and nucleus, thus, these intracellular regulatory proteins can be used as protein transporters for therapeutic purposes Key words: CPP, protein recombination, TAT, therapeutic protein PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG CHUỘT Hồng Đạo Bảo Trâm1, Tơ Minh Qn2, Đồn Ngun Vũ2, Nguyễn Thị Ngọc Mỹ2, Lê Thị Ngọc Hương2, Lưu Phương Nam3, Phan Kim Ngọc2 Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Trường đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Thử nghiệm phân lập ni cấy tế bào gốc tủy chuột tiến hành 15 mẫu tủy chuột nhắt trắng Mus musculus var albino - tuần tuổi Răng cửa hàm chuột xử lý dung dịch Peniciline 400UI/ml, Streptomycine 400µg/ml 20 phút Mảnh mơ tủy ni cấy sơ cấp đĩa 35mm môi trường DMEM/F12, bổ sung FBS 10%, Peniciline 100UI/ml, Streptomycine 100µg/ml, điều kiện 37oC, CO2 5% Sau tuần, tế bào hợp dòng, cấy chuyền sang Flask 25cm2 tiếp tục q trình ni cấy thứ cấp hệ thứ tư (P4) Sự biểu marker bề mặt tế bào đánh giá phương pháp Flow Cytometry Kết cho thấy tế bào tủy chuột P4 có biểu marker tế bào gốc trung mô CD73, CD90, CD105 không biểu marker tế bào máu CD19, CD34, CD45 Các tế bào có thời gian nhân đơi 45 đỉnh đường cong tăng trưởng đạt vào ngày thứ Tế bào gốc tủy chuột nuôi cấy thành công phương pháp nuôi cấy mảnh mô tủy chuột Từ khóa: tế bào gốc tủy răng, phân lập tế bào, nuôi cấy tế bào I ĐẶT VẤN ĐỀ Tủy mô liên kết chứa tế bào, mạch máu thần kinh, có chức trì TCNCYH 82 (2) - 2013 sống Tương tự tủy xương, tủy chứa tế bào gốc trung mơ Ngồi ra, tủy chứa tiền nguyên bào ngà 13 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC tế bào tạo máu Có thể nói tế bào tủy nguồn nguyên liệu quý nghiên cứu lĩnh vực tái tạo mô nha chu [1] Các mơ hình nghiên cứu in vitro mơ hình nghiên cứu động vật giai đoạn thử nghiệm quan trọng để chuẩn bị cho nghiên cứu ứng dụng người Nhiều tác giả giới sử dụng chuột thử nghiệm tế bào gốc tiềm biệt hóa tạo mơ tế bào Các dòng tế bào tủy chuột biểu phân tử bề mặt tế bào tương tự tế bào gốc tủy người, phương tiện quý báu để xác định kiểu hình dạng tế bào tiền thân khác nhau, dựa mức độ biểu quần thể khác phân tử bề mặt tế bào, từ đánh giá tiềm sửa chữa tủy tổn thương mô vùng sọ mặt [2] Nghiên cứu Balic cộng thực năm 2010, đánh giá điều kiện in vitro đặc tính tế bào tiền thân tủy cửa chuột Kết nghiên cứu cho thấy tủy cửa hàm chưa mọc mọc chuột chứa quần thể giàu tế bào tiền thân tế bào gốc, tương tự cối chưa mọc chuột; trình liên tục tạo nguyên bào ngà ngà mặt mặt cửa thực quần thể tế bào tiền thân từ tế bào gốc trung mô đa có tủy [3, 4] Trong đó, quần thể tế bào tủy cối mọc chuột chứa số lượng nhỏ tế bào đa Địa liên hệ: Hoàng Đạo Bảo Trâm, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh - 217 Hồng Bàng, Quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh Email: hoangdaobaotram@gmail.com Ngày nhận: 14/3/2013 Ngày chấp thuận: 26/4/2013 14 [4] Trong thử nghiệm in vitro khác, Shahrul cộng tiến hành phân lập tế bào gốc tủy chuột Các tế bào có tốc độ tăng sinh cao có khả biệt hóa thành tế bào tạo sụn [5] Nằm chuỗi nghiên cứu thử nghiệm in vitro tế bào gốc tủy phối hợp thực Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh Nghiên cứu tiến hành nhằm mục tiêu: phân lập nuôi cấy tế bào gốc tủy chuột II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Phân lập nuôi cấy tế bào tủy chuột Tủy thu nhận từ hàm chuột nhắt trắng Mus musculus var albino, tuần tuổi, cân nặng 20 - 25g Răng hàm chuột xử lý bề mặt dung dịch Peniciline 400UI/ml Streptomycine 400µg/ ml 20 phút Mảnh mơ tủy thu nhận nuôi cấy sơ cấp môi trường DMEM/F12 (Sigma) bổ sung huyết bào thai bò (FBS) 10% (Sigma), Peniciline 100UI/ml (Sigma), Streptomycine 100µg/ml (Sigma) điều kiện 37oC, 5% CO2 Ở thời điểm hợp dòng, tế bào cấy chuyền sang chai ni cấy Flask 25cm2 dung dịch Trypsin/EDTA 0,25%: 0,02% (Sigma) Q trình ni cấy thứ cấp tiếp tục thực môi trường DMEM/F12 bổ sung FBS 10%, Peniciline 100UI/ml, Streptomycine 100µg/ml điều kiện 37oC, CO2 5% Xác định tính gốc tế bào tủy chuột Tế bào tủy chuột kiểm tra biểu marker bề mặt CD73, CD90, TCNCYH 82 (2) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC CD105 CD19, CD34, CD45 phương pháp Flow Cytometry Phương pháp sử dụng loại kháng thể gắn hạt phát huỳnh quang có khả nhận diện đặc hiệu số marker bề mặt tế bào Nếu tế bào biểu marker cần quan tâm, tế bào kháng thể đặc hiệu liên kết với marker tạo thành phức hợp tế bào - kháng thể Phức hợp nhận diện máy FACS thông qua hạt phát huỳnh quang kháng thể Nếu không biểu hiện, phức hợp tế bào - kháng thể khơng hình thành, khơng thể nhận diện máy FACS Xây dựng đường cong tăng trưởng tế bào Đường cong tăng trưởng tế bào xây dựng cách xác định số lượng tế bào sống phát triển từ quần thể tế bào ban đầu qua mốc thời gian Tế bào nuôi cấy vào 33 giếng đĩa 96 giếng với mật độ 103 a c tế bào/giếng Mỗi ngày thực đếm số lượng tế bào sống giếng phương pháp nhuộm Trypan Blue, thí nghiệm tiến hành liên tục 11 ngày III KẾT QUẢ Kết phân lập ni cấy tế bào tủy chuột Q trình nuôi cấy tế bào quan sát hàng ngày qua kính hiển vi quang học đảo ngược Sau ngày, quan sát tượng tế bào bám trải xung quanh mảnh mô Lúc này, tế bào có nhiều hình dạng khác dạng hình thoi, dạng kéo dài, dạng hình sao, dạng giống tế bào nội mơ Ngồi ra, tế bào hồng cầu từ mạch máu tủy xuất xung quanh mảnh mơ Tuy nhiên, hồng cầu khơng có khả bám vào bề mặt đĩa nuôi cấy bị loại dần sau số lần thay môi trường b d Hình Hình ảnh qua hiển vi quang học đảo ngược, tế bào tủy chuột nuôi cấy sơ cấp a: Ngày 1: Mảnh mô tủy răng; b: Ngày 7: Tế bào bám trải từ rìa mảnh mơ; c: Ngày 14: Tế bào bao quanh hồn tồn mảnh mơ; d: Ngày 21: Tế bào hợp dòng TCNCYH 82 (2) - 2013 15 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Trong ngày nuôi cấy tiếp theo, tế bào biểu hình thái đặc trưng tế bào trung mơ: tế bào trải dài, nhân lớn hình oval trở nên chiếm ưu Đến ngày thứ 14, hầu hết tế bào có hình thái đồng nhất, rải rác vài tế bào có dạng hình dạng kéo dài Các tế bào bắt đầu hợp dòng vào khoảng ngày thứ 19 - 20, mật độ tế bào chiếm 80 - 90% diện tích bề mặt nuôi cấy Sau tuần, tế bào hợp dòng, trải thành lớp đơn phủ kín bề mặt đĩa ni (hình 1) Q trình ni cấy sơ cấp kết thúc vào thời điểm tuần, tế bào tủy cấy sang chai a nuôi cấy nhằm tăng diện tích cho tế bào bám dính tăng sinh Trong giai đoạn nuôi cấy sơ cấp, tế bào trải qua giai đoạn có hình thái kích thước đa dạng Ở hệ tế bào tiếp theo, tế bào có hình dạng đồng nhất, tế bào dạng hình thoi chiếm ưu thế, hình dạng đặc trưng tế bào trung mơ (hình 2) Đối với tế bào ni cấy thứ cấp, P1, P2, P3, P4, thời gian hợp dòng tế bào vào khoảng - ngày Như vậy, tốc độ tăng sinh tế bào nuôi cấy thứ cấp cao so với tế bào ni cấy sơ cấp b Hình Hình ảnh qua hiển vi quang học đảo ngược tế bào tủy chuột P4 hợp dòng (a: x 40); b: x 100) Kết xác định tính gốc tế bào tủy chuột Tế bào tủy chuột hệ thứ tư (P4) xác định tính gốc phương pháp Flow Cytometry Kết cho thấy tỷ lệ tế bào tủy chuột P4 dương tính với marker CD73 (99,75%), CD90 (91,92%,), CD105 (99,4%) âm tính với marker CD19 (1,53%), CD34 (0,86%), CD45 (0,47%) (hình 3) Kết xây dựng đường cong tăng trưởng tế bào Sự tăng sinh tế bào đánh giá phương pháp nhuộm Trypan Blue Biểu đồ mô tả số lượng tế bào sống đánh giá ngày q trình ni cấy Sau ngày 16 thứ nhất, tế bào có biểu giảm số lượng Các tế bào tăng sinh mạnh từ ngày đến ngày có xu hướng ngừng hoạt động tăng sinh Từ ngày thứ 7, số lượng tế bào giảm dần Thời gian nhân đôi tế bào 45 Kết thí nghiệm cho thấy tế bào thu nhận ni cấy có dạng hình thoi, dài 80 - 100 µm, rộng 15 - 20 µm Tế bào có biểu marker dương tính tế bào trung mô CD73, CD90, CD105 không biểu marker âm tính với tế bào trung mơ CD19, CD34, CD45 Dựa tiêu chuẩn Hiệp hội quốc tế tế bào gốc [6], tế bào phân lập nuôi cấy từ mảnh mô tủy chuột thử nghiệm xác định tế bào gốc trung mô TCNCYH 82 (2) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình Kết đánh giá marker bề mặt tế bào tủy chuột Đường cong tăng trưởng Biểu đồ Đường cong tăng trưởng tế bào tủy chuột hệ thứ tư IV BÀN LUẬN Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells - MSC) tế bào có khả tự phân chia biệt hóa thành nhiều dòng tế bào có nguồn gốc trung mơ tế bào tạo sụn, xương, mỡ, mô liên kết đệm Do đó, MSC xem nguồn tế bào gốc nhiều triển vọng cho phương pháp điều trị liệu pháp tế bào MSC đặc trưng TCNCYH 82 (2) - 2013 marker in vitro STRO-1, CD146, CD73, CD90, CD105 CD44, 14 STRO-1 protein màng dùng để xác định tế bào gốc trung mô tủy xương MSC thu từ nhiều nguồn tủy xương, máu cuống rốn, mô mỡ, MSC từ nguồn tế bào tự thân thu nhận dễ dàng, gây xâm lấn có tiềm biệt hóa thành loại tế bào 17 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Kết thu nhận từ thí nghiệm cho thấy tế bào nuôi cấy từ mảnh mô tủy chuột có hình dạng kích thước Lời cảm ơn Đề tài thực nguồn kinh phí tương tự tế bào gốc trung mô khác trung Chương trình Khoa học Cơng nghệ mơ tủy xương chuột, trung mô tủy người trọng điểm cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng Kết phù hợp với nghiên cứu dụng phát triển công nghệ tiên tiến phục vụ Tadashige Nozaki cộng [7], Shiro Fuji- bảo vệ chăm sóc sức khỏe cộng đồng”, Mã wara cộng [8], Balic cộng [3, 4] số KC.10/11-15, Bộ Khoa học Công nghệ Hiện nay, phương pháp nhằm phục hồi tủy tái tạo mạch máu khối máu đông, sử dụng tế bào gốc, ghép tủy, ghép khung nâng đỡ, phân phối tế bào, liệu pháp gen lĩnh vực quan tâm nghiên cứu Một số cơng trình giới Việt Nam tiến hành nghiên cứu phân lập nuôi tế bào gốc tủy tạo khung nâng đỡ công nghệ tạo mô răng, hướng đến ứng dụng sinh học lâm sàng [9, 10, 11, 12] Đề tài đóng góp lĩnh vực nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc tủy TÀI LIỆU THAM KHẢO Hoàng Đạo Bảo Trâm, Tạ Thành Văn (2012) Tế bào gốc trung mô tiềm tái tạo mơ Tạp chí nghiên cứu Y học 1, 153 - Lacerda-Pinheiro S, Dimitrova-Nakov S., Harichane Y et al (2012) Concomitant multipotent and unipotent dental pulp progenitors and their respective contribution to mineralized tissue formation European Cells Materials 23, 371 - 386 Kết nghiên cứu cho thấy khả phân Balic A., Mina M et al (2010) Characterization of progenitor cells in pulp of murine lập nuôi cấy thành công tế bào từ mô tủy incisors J Dent Res 89(11), 1287 - 1292 chuột Các tế bào biểu trì đặc tính gốc q trình ni cấy in vitro Những kết ban đầu tiền đề cho hướng nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc chuyên ngành Răng Hàm Mặt Việt Nam V KẾT LUẬN Thử nghiệm phân lập nuôi cấy tế bào gốc tủy chuột tiến hành 15 mẫu tủy chuột nhắt trắng Mus musculus var albino 2-3 tuần tuổi Tế bào gốc tủy chuột phân lập nuôi cấy thành công phương pháp nuôi cấy mảnh mô môi trường DMEM/F12, bổ sung FBS 10%, Peniciline 100UI/ml, Streptomycine 100µg/ml, điều kiện 37oC, CO2 5% 18 Balic A Aguila H.L., Caimano M.J et al (2010) Characterization of stem and progenitor cells in the dental pulp of erupted and unerupted murine molars University of Connecticut Health Center Research Bone 46 (6), 1639 - 1651 Zainal Ariffin S.H., Kermani S., Megat Abdul Wahab R et al (2012) In Vitro Chondrogenesis Transformation Study of Mouse Dental Pulp Stem Cells The Scientific World Journal 2012, - Domicini M., Le Blanc K., Mueller I et al (2006) Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells The International Society for Cellular Therapy position statement Cytotherapy 8(4), 315 - 317 TCNCYH 82 (2) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Tadashige Nozaki., Takeyasu M., Hirao A et al (2005) Differentiation of Rat Dental Pulp-derived Cells into an Osteoblastic Lineage Oral Science International 2(2), 118 - 125 Fujiwara S., Kumabe S., Iwai Y et al (2006) Isolated Rat Dental Pulp Cell Culture and Transplantation with an Alginate Scaffold Okajimas Folia Anat Jpn 83(1), 15 - 24 Đoàn Nguyên Vũ, Phạm Trần Hương Trinh, Nguyễn Thị Nhật Uyên et al (2011) Nuôi cấy tế bào gốc từ tủy người Tạp chí cơng nghệ sinh học 9(3), 297 - 301 10 Gronthos S., Mankani M., Brahim J et al (2000) Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo Proc Natl Acad Sci USA 97(25), 13625 - 30 11 Huang GT., , Sonoyama W., Chen J et al (2006) In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods ang culturing enviroment, Cell and Tissue Research 324(2), 225 - 236 12 Trần Lê Bảo Hà, Đoàn Nguyên Vũ, Tô Minh Quân et al (2011) Study on culture of human dental pulp stem cells to apply in tissue engineering Journal of Biomimetics Biomaterials & Tissue Engineering 11, 13 - 20 Summary ISOLATION AND CULTURE DENTAL PULP STEM CELLS OF MICE INCISORS The goal of this study is to isolate and culture dental pulp stem cells (DPSCs) from mouse mandibular incisors Mandibular incisors from - weeks old mice were collected and sterilized in a solution of 400 IU/ml Penicilline and 400 IU Streptomycin for 20 minutes Dental pulp fragments were isolated and incubated in 35mm-dish containing DMEM/F12, supplemented with 10% FBS, 100UI/ml Peniciline, 100µg/ml Streptomycine, at 37oC and 5% CO2 After weeks, confluent cells were stripped and transferred to 25 cm2 tissue culture flask and maintained up to passage (P4) At P4, DPSCs were identified using immunofluorescent flow cytometry method Dental pulp culture cells at passage expressed high levels of mesenchymal stem cell markers such as CD73, CD90, CD105, and a low level of endothelial hematopoietic cells such as CD19, CD34, and CD45 We also found that DPSCs reach a maximal proliferation levels at day 7, and have a cell population doubling time of 45 hours Conclusion: We have successfully isolated, cultured and characterized dental pulp stem cells in mice using a simple tissue cell culture method Key words: dental pulp stem cells (DPSCs), cell isolation, cell culture TCNCYH 82 (2) - 2013 19 ... Nghiên cứu tiến hành nhằm mục tiêu: phân lập nuôi cấy tế bào gốc tủy chuột II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Phân lập nuôi cấy tế bào tủy chuột Tủy thu nhận từ hàm chuột nhắt trắng Mus musculus var albino,... chuột thử nghiệm tế bào gốc tiềm biệt hóa tạo mơ tế bào Các dòng tế bào tủy chuột biểu phân tử bề mặt tế bào tương tự tế bào gốc tủy người, phương tiện quý báu để xác định kiểu hình dạng tế bào. .. marker âm tính với tế bào trung mô CD19, CD34, CD45 Dựa tiêu chuẩn Hiệp hội quốc tế tế bào gốc [6], tế bào phân lập nuôi cấy từ mảnh mô tủy chuột thử nghiệm xác định tế bào gốc trung mô TCNCYH