Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ lớp Whartsons jelly dây rốn người. (Khóa luận tốt nghiệp)Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ lớp Whartsons jelly dây rốn người. (Khóa luận tốt nghiệp)Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ lớp Whartsons jelly dây rốn người. (Khóa luận tốt nghiệp)Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ lớp Whartsons jelly dây rốn người. (Khóa luận tốt nghiệp)Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ lớp Whartsons jelly dây rốn người. (Khóa luận tốt nghiệp)Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ lớp Whartsons jelly dây rốn người. (Khóa luận tốt nghiệp)Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ lớp Whartsons jelly dây rốn người. (Khóa luận tốt nghiệp)Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ lớp Whartsons jelly dây rốn người. (Khóa luận tốt nghiệp)Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ lớp Whartsons jelly dây rốn người. (Khóa luận tốt nghiệp)Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ lớp Whartsons jelly dây rốn người. (Khóa luận tốt nghiệp)
I H C THÁI NGUYÊN I H C NÔNG LÂM TR N TH DUNG tài: PHÂN L P VÀ NUÔI C Y T BÀO G C T WHARTSON'S JELLY DÂY R KHÓA LU N T T NGHI L P I IH C H o : Chính quy Chuyên ngành : Công ngh sinh h c Khoa : CNSH - CNTP Khóa h c : 2011-2015 I H C THÁI NGUYÊN I H C NÔNG LÂM TR N TH DUNG tài: PHÂN L P VÀ NUÔI C Y T BÀO G C T WHARTSON'S JELLY DÂY R KHÓA LU N T T NGHI L P I IH C H o : Chính quy Chun ngành : Cơng ngh sinh h c Khoa : CNSH - CNTP Khóa h c : 2011-2015 Gi ng d n: i Lâm Khoa CNSH - CNTP - i h c Nông Lâm TS Nguy nh Vi n Công ngh sinh h c - Vi n Hàn lâm khoa h c Thái Nguyên, i L IC Trong su t trình h c t p, nghiên c u th c hi n khóa lu n, nh cs n h t s c quý báu c a th y cô giáo b n c h t, xin g i l i c H NH nguyên chân thành n TS NGUY ng phòng - Phòng Cơng ngh Phơi ng nghiên c u, t Vi n CNSH u ki n, ch b tơi su t q trình làm khóa lu n Ngồi tơi xin g i l i c Khoa Công ngh sinh h c h t sâu s c t i i h c Nông Lâm Thái Nguyên Th ng d n, truy i Lâm ng t ki n th nghi m làm vi c cho trình th c hi n nghiên c u Tôi xin c nghi m t nh ng giám kh o, th em có th ti n hành th c hi n khóa lu n này! Tơi g i l i c nh qúy th y cô H n Ths Lê B c Vi t, c nhân Nguy n Thanh Ngà i ch t th c t p nb ng viên u Tôi s ghi nh trân tr ng Sinh viên ii DANH M C B NG s 13 3.1 23 ng 3.2 - PCR 29 - PCR 30 - PCR 30 .35 ng 4.2 37 iii DANH M C HÌNH Hình 2.1 s Hình 2.2 s Hình 2.3 Hình 2.4 dây .11 Hình .22 Hình 3.2 22 Hình 3.3 24 Hình 3.4 25 Hình 4.1 .32 Hình 4.2 34 Hình 4.3 .35 Hình 4.4 36 Hình 4.5 38 iv DANH M C VI T T T CD Cluster of differentiation (C m bi t hóa) CHT Enzyme collagenase / hyaluronidase/trypsin CT Collagenase/ trypsin DMEM/F12 ng / Ham 12 DNA A xít Deoxyribonucleic dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate EDTA A xít Ethylene diamine tetra acetic EGF Epidermal growth factor (Y u t FBS Fetal bovine serum (Huy t bào thai bò) FGF Fibroblast growth factor (Y u t HLA ng l p bi u bì) ng nguyên bào s i) Human leukocyte antigen (Kháng nguyên b ch c u i) Hepatocyte nuclear factor (Y u t nhân t bào gan) hWJSCs Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Stem Cells (T bào g c t l p WJ dây r i) ITS Insulin transferin - selenium MSC Mesenchymal stem cell (T bào g c trung mô) PBS Phosphate buffer saline (Dung d ch RNA Ribonucleic Acid RT PCR Reverse transcription Polymerase chain reaction (Ph n ng chu i t ng h Trp TBG c) tripsin / EDTA WJ (Th T bào g c m phosphate) ) v M CL C L IC DANH M C B NG iii DANH M C HÌNH iii DANH M C VI T T T iv M C L C v U PH N M tv 1.2 M c tiêu yêu c u c tài 1.2.1 M c tiêu c tài 1.2.2 Yêu c u c tài tài cc tài c ti n c tài PH N T NG QUAN TÀI LI U khoa h c 2.1.1 T bào g c 2.1.2 T bào g c trung mô 2.1.3 T bào g c trung mô 2.2 Nghiên c dây r n 10 c 19 2.2.1 c 19 2.2.2 c 20 PH N NG, N NGHIÊN C U 21 ng ph m vi nghiên c u 21 3.1.1 ng nghiên c u 21 3.1.2 Ph m vi nghiên c u 21 m th i gian ti n hành 21 vi 3.3 N i dung nghiên c u 21 u 21 3.4.1 trí thí nghi m 21 PH N K T QU VÀ TH O LU N 32 4.1 Phân l p nuôi c y t bào 32 4.2 t c y chuy n 34 4.3 K t qu tách RNA 35 4.4 Bi u hi n marker c a MSCs 4.5 t bào nuôi c y 35 37 PH N K T LU N VÀ KI N NGH 39 5.1 K t lu n 39 5.2 Ki n ngh 39 TÀI LI U THAM KH O 40 I, Tài li u ti ng vi t 41 II, Tài li u ti ng anh 42 III, Tài li u internet 43 PH L C A, Nguyên v t li u, v A.1 D ng c v A.2 Thi t b nghiên c u A.3 Hóa ch t tb PH N M 1.1 U tv Khoa h n r ng m t s loài v n l n, bi n có th tái t o b ph chung nh m M b ph không th tái t o c m t bào máu, t bào da v c tái sinh m i nh nh ng t c phát hi n q trình ti n hành thí nghi m v i t n phát hi n v s t n t i c a t bào g c (TS Ph m M nh Hùng, 2008) [7] Ngu n t bào g c s d ng cho nghiên c ngu c thu nh n t nhi u t bào g c l y t phôi, d ch i Tuy nhiên, nh ng ngu n t bào n vi c phá h y phôi, t n h i thai nhi, can thi p thô b o làm cơng giáo tr ph ng b t l i cho thai nhi, ph n l n giáo h i ph i gay g t cho r xâm c thu nh n t mô ng thành c, ni m tin tôn giáo T bào g y Tuy nhiên v g p ph i khó v k thu t (Logeart-Avramoglou D cs, 2005) [18], h n ch v s ng, t bào c r t ít, có th n s c kh e, già khó bi t hóa (Bobis S cs, 2006) [14], có a nhi m virus q trình phân l p c a MSCs t t Hi n nay, nhà khoa h g cm (Romanov Y A cs, 2003) [23] g ng tìm ki m nh ng ngu n t bào ph c v cho nhu c u nghiên c u th c ti n Nh ng báo cáo g n r ng, ngu n rác th i y t , dây r n c a tr t bào g c có kh t hóa cao, g i t bào g c trung mô có ch a c cho m t phát hi n quan tr ng có th thu th p t bào g c mà không gây b t k t i nên b c n tr b i v n v lu c nghiên c u T bào g c dây r n t bào g c t tr nên kh t s ng t c in vitro r t l n Nó có nh tr c ti p ho t bào g c m gi ng ng thành (có ti )( nh cs, 2009) [4] Các nghiên c t, có th c t bào g c máu t bào g c trung mô (MSCs) t ngu n khác dây r dây r n, m c a dây r n), màng lót l p n ch dây r n (Nguy n H [11] Trong s p MSCs t l m i nh ng, 2011) dây r c nghiên c u r ng rãi MSCs t l p t cao v ti d ng, v y ti n hành nghiên c bào g c t l p Whartson's jelly dây r tài ng p ni c y t hồn thi n quy trình phân l p tìm ch th b m t có vai trò vi c nh n bi t MSCs t l p dây r n, ch ng ngu n t bào g c trung mô ph c v cho nghiên c u sau 1.2 M c tiêu yêu c u c 1.2.1 M c tiêu c tài tài - Phân l p t bào g c trung mô t l p Whatson's jelly dây r n i - Nuôi c y t bào g c trung mô t l p Whatson's jelly dây r n ng i - T o ngân hàng t bào g c dây r n ph c v m 1.2.2 Yêu c u c u tài - Phân l p thành công t bào g c trung mô t l p Whatson's jelly dây r n i Hoàn thành Gi s n ph m 720 C 10 phút30 giây 150 C PCR Gel ch n di: Agarose 1.5% tr n dung d ch g u, cho dung d ch vào gi 30 phút v n 250mA hi Nhu m m n di n th 100V c l y t bu n di ngâm vào dung d ch ethidium bromide kho ng 15 20 phút Quan sát k t qu i tia UV nh vào máy ch p nh DNA Dây r n v n chuy n t b nh vi nuôi c m phân l p t bào, dây r lý l c r a bên b c mu i sinh c r a v i PBS Sau lo i b m ch máu r a s ch t bào máu m c t t nh t có th , m có ch c c t ni c y ng DMEM/F12, b sung 10% FBS 4.1 P Các m nh mô cu ng r n sau thu nh thu t ng Sau ngày phân l p nuôi c y, m u phân l p b ng enzyme quan sát th y t c t rìa m nh mơ (Hình 4.1A) Sau ngày nuôi c y, m u phân l p b ng l c c thay m i ngày/1 l n n ngày nuôi c y th 22, quan sát th y t bào b u m c t rìa c a m nh mơ (Hình 4.1B) Hình 4.1: T bào m c t rìa m nh mơ A (Bên trái): M B (Bên ph i): M c y cu ng r n c s lý b c s lý b c i kính hi c th y s ng t bào r t t bào ch m i m c t rìa c a m nh mơ, có d ng nguyên bào s u t bào t bào d ng tròn nh , chúng khơng bám xu ng b m ng d ng huy n phù Sau 21 ngày ni c y, t bào có ti nr tl nhanh t o thành nh ng m ng song song v i nh ng l p cu n xo n g i lên Qu n th t ng nh t cao Có th th y b m t ni ngồi t bào d ng nguyên bào s i chi t bào ng c d ng tròn, nh c xu có bào phân chia t t bào lý m nh mô b ng enzyme cho th y th i gian thu nh n ct ym u có th gi i thích l p mơ liên k t m nh mô cu ng r n b enzyme phân c t, giúp t bào quan tâm d dàng ti p xúc v ng th ng cm r Khi t s i, cu n theo dòng nh bao ph b m t nuôi c y 80% d ng nguyên bào nh (h 4.3), ti n hành c y chuy n i x 10) Hình 4.2: T bào 80% d ng h ng: Các t bào hình thoi gi ng nguyên bào s i; :Các t bào ng c d ng tròn, nh 4.2 Ti n hành c y chuy n b ng cách s d thu l y t bào (t bào có d ng tròn nh bong kh i b m ni c y), c y chuy ng kính 35mm Sau c y chuy n, Hình thái t bào trì d ng nguyên bào s i, m (Hình 4.3A) Các t t u b m c tách kh i b m y sau s lý enzyme kho ng phút B t ho t enzyme b ng DMEM/F12 ch a huy t bào thai bò (FBS) Chuy n t ngày c y chuy n, quan sát th y t thái t bào trì d y y m i Sau nh c c y truy n, m Hình t bào ti p t c (Hình 4.3B) Khi t t 80% h n hành c y truy n l n ti p theo Hình 4.3: T bào sau c y chuy n A (Bên trái): T bào sau c y chuy n B (Bên ph i): T bào c y chuy n sau ngày nuôi c y 4.3 K t qu tách RNA M u RNA sau tách chi tinh s nh n s d ng cho phân tích ti p theo K t qu u RNA tách chi c trình bày B ng 4.1: B ng 4.1: K t qu tách RNA L n tách S ng t bào A260/A280 OD 5x106 l 0.229 5x106 l 0.232 5x106 l 0.235 T k t qu ta th y, giá tr OD c a RNA cao 1,8 ch ng t RNA s ch c n thi t cho nghiên c u phân tích ti p theo giá quy trình tách chi t RNA s d ng b kít RNeasy® Mini Kit cho k t qu t t 4.4 Bi u hi n marker c a MSCs M d t bào nuôi c y cn ch y RT PCR v i m tinh s ch c n thi cs c hi u, giá tr Tm c a m i x p x c th c hi n m t l n ch y RT - PCR Ph n ng phiên mã c khu c th c hi n m t ph n ng v i h n h p enzyme c chu n b theo b kít QIAGEN® OneStep RT PCR Kit S n ph m RT c ki K t qu ch n di gel agarose 1.5% n di: Hình 4.4: K t qu n di v i marker ch th K t qu ch n di v i marker ch th c trình bày qua b ng sau: B ng 4.2: K t qu bi u hi n c a marker ch th Tên marker c (bp) AFP Bi u hi n 216 _ 350 _ GATA4 290 + CD34 367 + Oct 297 + CD86 290 + CD90 265 + 230 + Eras 315 + TAT 800 + CD105 179 + CD73 308 + T hình 4.4 b ng 4.2 cho th y, CD90, CD73, CD86, CD105 s là: c bi u hi n Ngoài marker b c bi u hi a t bào g c phôi 1, Eras Các y u t phiên mã tham gia vào trình phát tri n c ng ct n c bi u hi phân t CD86 m t protein th hi n di n c a hi n t nguyên, cung c p tín hi u costimulatory bào trình di n kháng ng kích thích) c n thi t cho vi c kích ho t t bào T h th ng mi n d ch c phù h p v i nh ng nghiên c u marker c a MSCs K t qu hoàn toàn c kh nh Trong nghiên c u này, chúng tơi th nghi m marker c a t bào i ch ng âm cho ph n ng RT - c bi t hóa thành t bào gan nên k t qu u không bi u hi n p nuôi c y thành công t bào g c trung mô t l p WJ t dây r i 4.5 S d ng h n h ng nuôi c y ch t b o qu n DMSO 10% thu nh n t bào sau c y chuy n B o qu n ng l l ng (-1960C) Sau kho ng th i gian 10-20 ngày b m u gi m tra k t qu ng nuôi c y DMEM/F12 có b sung 10% FBS ti m at ng khơng b sung FBS, FBS có ch a r t nhi u y u t t ng t bào (các ch ng), nhiên huy ng, y u ng v t có th ngu n g c c a kháng ng v t (ví d : Các prion) s d ng MSCs a protein peptide có th n ng mi n d ch Do v huy t r xu t gi c quan tâm ni c y t Hình 4.5: T bào gi A (Bên trái): T bào m i b B (Bên ph i): T bào gi c k t h p v i MSCs u gi y ng ng v t T bào quan sát th y sau gi che ph b m thành dòng ch y nh tm kho y T bào d ng nguyên bào s i, x p sát t o nh (80% d ng h Sau nuôi c n ngày th B m i kính hi n vi Các t bào v n ti p t n m nh, s xu t hi n c a t bào b nhi m hay t bào ch t ch ng t công 5.1 T nh ng k t qu nghiên c c, có th k t lu Phân l p nuôi c y thành công t bào g c trung mô t l p n tr Qu n th MSCs ng nh t sau tu n ni c y ch n l c, i marker c a t bào g c trung mô CD90, CD105 CD73 âm tính v i marker c a t bào bi t hóa dòng gan Hồn thi n quy trình b o qu n t bào ng -1960 mb o c tính c a MSCs m t th i gian dài 5.2 T k t qu c, có th nh ng ki n ngh sau: Ti p t c theo dõi trì dòng t bào g c trung mô phân l c qua l n c y chuy n Th nghi m bi t hóa MSCs thành t ch ng a chúng Th nghi m chuy n gene tr li u m t s b nh vào MSCs ti n hành c ng v t TÀI LI U THAM KH O I, Tài li u ti ng vi t 1.Tr u máu dây r n t i b nh vi n K y u h i th o nghiên c u ng Truy n máu Huy t h d ng t bào g c y h c, tr.9-15 Nguy n T n B u nghiên c thân TBGMNV khơng gi u tr b nh máu ác tính, Lu n án Ti nh , t p chí nghiên c 11 (15) tháng 11/2006 nh cs Ph c(2009), Công ngh T bào g c, NXB Giáo d c Vi t Nam Nguy n Th Thu Hà (2004) T bào g c ng d ng y sinh h c TCNCYDH ph b n 32 (6): 13-26 Nguy nh i Lâm, Nguy n Thanh Ngà(2015) u ng c a DMSO bi t hóa t o t bào gi ng t bào gan t g c cu ng r T p chí sinh h c 2015,37(lse): 190-195 Ph m M ông(2005), T bào g c hi n tr ng nghiên c u, ng d ng t bào g c Vi t Nam, B Giáo d t o i h c Duy Tân Phan Kim Ng c(2009), công ngh t bào g c, NXB Giáo D c Ph c(2006), Công ngh sinh h i ng v t, NXB Giáo d c, pp367-391 10 Ph Thu Huy n, Ph u phân l p t bào g c trung mô t màng dây r n tr p trí Thơng tin Y c, trang 11 Nguy n H thu n nh t c a qu n th t bào g c phân l p t l ch dây r n tr y c T nhiên Hà n i, trang 16 12 Mai M nh Tu n, Chu Qu ng, Tr n Thanh Loan, Bùi Th Nga, Nguy n Thông, Phan Toàn Th ng(2007), K t qu u s d ng t bào g c trung mô dây r u tr v TC Nghiên c c h c c truy n Vi t Nam, Trang 27 33 II, Tài li u ti ng anh 13 The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 36 (4), pp 568 584 14 Folia Histochem Cytobio, 44 (4), pp 215 230 15 Bongso A., Fong C Y Future Clinical Directions of Stem Cells from the WJ of the Human Stem Cell Rev and Re, 9, pp 226 240 16 Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, Deans R, Keating A, Prockop Dj, Horwitz E(2006), The International Society for Cellular Therapy position statement, Cytotherapy 8(4):315-7 17 Jinlian Hua, Pubin Qiu, Haijing Zhu, Hui Cao, Fang Wang Wei African Journal of Biochemistry Research, 5(4), 113-123 18 Logeart-Avramoglou D.; Anagnostou F.; Bizios R.; Petite H(2005) J Cell Mol Med 9, 72 84 19 Monnipha Sila-ASNA, V Nardone, R Zonefrati, C Mavilia, C Romagnoli, S Ciuffi, S Fabbri, G Palmini, G Galli, A Tanini, and M L Brandi Formation Gene Expression in Strontium-inducing Bone Marrow Stem Cell, Kobe Journal of Medical Sciences, 53(1), pp 25-35 20 Parvin Salehinejad & Noorjahan Banu Alitheen &Abdul Manaf Ali & Abdul Rahman Omar &Maryam Mohit & Ehsan Janzamin &Fazel Sahraneshin Samani & Zahra Torshizi &Seyed Noureddin Nematollahi-Mahani for the isolation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord In Vitro Cellular & Developmental Biology Animal, 48, pp 75-83 21 Biology Bulletin, 33(1), pp 18 18 22 Qian Qian, Hui Qian, Xu Zhang, Wei Zhu, Yongmin Yan, Shengqin Ye, Xiujuan Peng , Wei Li, Zhe Xu, Lingyun Sun, Wenrong Xu(2012), Azacytidine Induces Cardiac Differentiation of Human Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells by Activating Extracellular Regulated Kinase Stem Cells Dev, 21(1): 67 75 23 alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells: candidate MSCStem Cells 21, 105 110 24 Toai T., Thao H., cs(2 Cell and Tissue Banking, 11 (3), pp 269 280 280 25 William Tse, Mary J Laughlin(2005), Umbilical cord blood transplantation: A new alternative option Hematology 377-383 26 stromal cells derived from umbilical cord WJ into hepatocyte-like Cytotherapy, 11(5), pp 548 558 III, Tài li u internet 27 http://khoahoc.tv/khampha/sinh-vat-hoc/20361_tim-hieu-ve-te-b-o-gocphan-1.aspx 28 http://www.anninhthudo.vn/xa-hoi/ngan-hang-mau-cuong-ron-cong-dongy-nghia-nhan-van-to-lon/595191.antd 29 http://t5g.org.vn/Default.aspx?u=dt&id=6970 30 http://www.kilobooks.com/phan-lap-te-bao-goc-trung-mo-tu-day-ron-treso-sinh-343010 31 http://chiasetailieu.vn/threads/nghien-cuu-xay-dung-ngan-hang-te-baogoc-day-ron-khu-vuc-mien-nam-va-ung-dung-dieu-tri-benh-onguoi.29664/ 32 http://123doc.org/document/1141139-tieu-luan-cac-ky-thuat-pcr-va-ungdung-doc.htm 33 http://www.baomoi.com/Thai-phu-luu-y-Te-bao-goc-tu-day-ron-la-gia-trinhat/82/11092699.epi A.1 D ng c v Các d ng c v n thi cs d th c hi n thí nghi m c li t kê sa ng Falcon 15ml, 50ml u côn vàng, pipet lo B m g m: dao, kéo nh , kéo v y t bào gi ng nh th y tinh Xilanh lo ul c Chai th y tinh C A.2 Thi t b nghiên c u Các thi t b nghiên c u c n thi Tên thi t b Kính hi cs d Hãng s n xu t c tài g m: c s n xu t Nikon Nh t Bu ng c y vô trùng Bassaire Anh T l nh Sanyo Nh t Máy ly tâm Sigma M T s y Binder c T Sanyo Nh t m CO2 Máy RT PCR Eppendorf Máy ch p gel Và m t s thi t b khác Biorad B ngu n bu vortex, Máy nh, c USA n di, Máy A.3 Hóa ch t Các hóa ch t ni c y x Tên hóa ch t c nêu chi ti t b ng Hãng s n xu t c s n xu t Gibco M Gibco M Sigma M Gibco M L-glutamin Gibco M RT-PCR kit Qiagen M Eagle Medium(DMEM) Fetal Bovine Serum(FBS) Trypsin Phosphate buffer saline (PBS) ... M c tiêu c tài tài - Phân l p t bào g c trung mô t l p Whatson's jelly dây r n i - Nuôi c y t bào g c trung mô t l p Whatson's jelly dây r n ng i - T o ngân hàng t bào g c dây r n ph c v m 1.2.2... c u tài - Phân l p thành công t bào g c trung mô t l p Whatson's jelly dây r n i - Nuôi c y thành công t bào g c trung mô t l p Whatson's jelly dây r n i - T o ngân hàng t bào g c dây r n ph... t bào g c khác khác (tùy thu c cách phân lo i) Các t bào g bi t hóa thành h u h t lo i t t bào g m t lo i t bào v i ch i ch bi t hóa thành nh Ví d : T bào g c máu t bào g c bi t hóa thành t bào