BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH TÁCH VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC PHÔI CHUỘT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HCM KHOA SINH HỌC *****  ***** BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ ĐỀ TÀI : BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH TÁCH VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC PHÔI CHUỘT MÃ SỐ : CS.2004.23.64 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TS Dương Thò Bạch Tuyết Thành Phố Hồ Chí Minh - 12/2005 Cộng tác viên: ThS.Phan Kim Ngọc ThS.Nguyễn Đăng Quân CN.Phạm Văn Phúc (ĐHKHTN Tp HCM) CN.Lê Phan Quốc CN.Trương Văn Trí (ĐHSP Tp.HCM) DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AS Adult stem cell Tế bào mầm trưởng thành D`MEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Môi trường D`MEM dpc day postcoitum Ngày sau giao phối Ebs Embryonic bodys Thể phôi EC Embryonic carcinoma Tế bào khối u EGC Embryonic germ cell Tế bào mầm phôi ES Embryonic stem cell Tế bào gốc phôi FBS Fetal bovine serum FGF Fibroblast growth factor GC Germ cell Tế bào mầm ICM Inner mass cell Khối tế bào bên LIF Leukimia inhibitory factor MEF Mouse embryonic fibroblast MHC Major Histocompatibitity complex PGC Primordial germ cell Huyết bào thai bò Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi Nhân tố ức chế bạch cầu Tế bào fibroblast phôi chuột Phức hợp tương hợp mô Tế bào mầm sinh dục sơ khai LỜI MỞ ĐẦU Thế kỷ 21 - với bùng nổ thành tựu Công Nghệ Sinh học đem lại nguồn lợi to lớn cho sống nhân loại Con người không ngừng tìm kiếm hướng nghiên cứu Sinh học Phân tử Sinh học tế bào Đặc biệt việc nghiên cứu tế bào gốc (Stem cell) nhằm tận dụng nguồn giá trò vô tận loại tế bào công tác chữa bệnh bệnh nan y “Tế bào gốc” trở thành khái niệm không xa lạ lónh vực YSinh học đặc tính ưu việt Tuy nhiên Công nghệ tế bào gốc (Stem cell biotech) trở thành nỗi băn khoăn cho nhân loại nghiên cứu thao tác người Nhiều quốc gia giới cho phép tiến hành thao tác tế bào gốc phôi người (Human embryo) có nhiều nước cấm, có Việt Nam Vấn đề có nhiều tranh cãi hiển nhiên bò hạn chế tìm phương pháp kiểm soát chặt chẽ Trong đối tượng nghiên cứu phổ biến nay, chuột nhắt trắng có lẽ quen thuộc phòng thí nghiệm đặc tính thuận lợi nó: kích thước nhỏ, vòng đời ngắn, đặc điểm sinh lý gần với người … Việc thu nhận tế bào gốc từ phôi chuột thực từ lâu giới đạt nhiều thành tựu Tuy nhiên, lónh vực nghiên cứu hạn chế Việt Nam Để bắt đầu tiếp cận với đối tượng nghiên cứu này, bước đầu nghiên cứu qui trình tách nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột Mặc dù bước đầu đạt số kết đònh chắn nhiều điều chưa hoàn thiện Rất mong quan tâm góp ý quan tâm đến vấn đề để đề tài hoàn thiện Chân thành cảm ơn TP HCM, tháng 12/2005 Thay mặt nhóm tác giả Dương Thò Bạch Tuyết PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU TẾ BÀO GỐC 1.1 Khái niệm Tế bào gốc loại tế bào chưa chuyên hoá, có khả phân chia vô hạn tổ chức sống, có nguồn gốc từ phôi, bào thai hay mô thể trưởng thành Dưới điều kiện thích hợp hay có tín hiệu kích thích, tế bào gốc phát triển thành nhiều loại tế bào chuyên hoá tạo thành quan hay tổ chức thể [1][2] 1.2 Đặc điểm  Có khả phân chia vô hạn  Cấu trúc di truyền (Bộ NST lưỡng bội) tế bào trì ổn đònh với loài  Có thể biệt hoá thành loại tế bào chuyên hoá khác thu từ lớp mầm nguyên thủy  Có khả nhân dòng tế bào.[1][2] 1.3 Phân loại Gồm nhóm : [7][9]  Tế bào gốc phôi (Embryonic Stem Cell – ES)  Tế bào gốc phôi – ES  Tế bào mầm phôi (Embryonic Germ Cell – EGC)  Tế bào gốc trưởng thành (Adult Stem Cell – AS) 1.4 Sơ lược tình hình nghiên cứu Các tế bào gốc phôi (ES _ Embryo stem cell, ) lần cô lập vào năm 1980 nhiều nhóm nghiên cứu làm việc độc lập Những nhà nghiên cứu nhận đặc tính biệt hóa đa hướng tế bào ES loại tế bào ba lớp mầm sơ khởi Gossler cộng miêu tả khả lợi điểm việc dùng tế bào ES để tạo động vật chuyển gene Thomas Capechi báo cáo khả biến đổi gene tế bào ES tái tổ hợp tương đồng Smithies đồng nghiệp sau chứng minh tế bào ES biến đổi gen vào Blastocyst, truyền lại biến đổi di truyền qua dòng tế bào Ngày biến đổi di truyền gene chuột kỹ thuật tế bào ES cách tiếp cận quan trọng để tìm hiểu chức tế bào động vật hữu nhũ in vivo Các nghiên cứu tế bào ES động vật hữu nhũ: chuột đồng, chuột, chồn, heo bò công bố; nhiên, có tế bào ES chuột thành công việc truyền lại biến đổi di truyền từ tế bào ES thông qua dòng tế bào mầm sinh dục Gần đây, quan tâm tế bào gốc tăng mạnh nhờ báo cáo cô lập tế bào ES người linh trưởng Các công trình tạo phôi lai người thỏ, biến tế bào gốc thành trứng tinh trùng, thu tế bào mầm mà không làm chết phôi … thu nhiều kết khả quan hai thập kỷ qua Đặc biệt, vào tháng 5/2004 A Melton cộng biệt hoá 17 loại tế bào khác từ ES thu nhận từ khối tế bào bên blastocyst người Các nhà khoa học Hàn quốc tỏ vượt trội có công trình có tính tiên phong lónh vực thu nhận tế bào gốc phôi người Tính đến nay, giới, có ngân hàng tế bào gốc đời vào hoạt động (Hàn quốc, Anh, Mỹ, Trung quốc) Hình 1.1 : a) Blastocyst b) phôi người giai đoạn tế bào Riêng Việt Nam, việc nghiên cứu tế bào gốc giai đoạn khởi đầu tập trung chủ yếu hai trung tâm lớn (Đại học Khoa học Tự nhiên Hà nội Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM) Mặc dầu vậy, phòng Thí nghiệm công nghệ cao hai Trường nói đạt số thành tựu làm tiền đề cho nghiên cứu sâu tế bào gốc Chẳng hạn xây dựng quy trình thu nhận nguồn phôi in vitro, in vivo từ động vật làm nguyên liệu cho khai thác tế bào gốc, cấy ghép da thu từ nuôi cấy tế bào để điều trò ca bỏng, ghép tế bào gốc CD34+ máu ngoại vi để để điều trò bệnh lý ác tính, thu tế bào gốc sinh máu từ tuỷ xương, cuống rốn … [7][9] TẾ BÀO GỐC PHÔI 2.1 Khái niệm đặc điểm Tế bào gốc phôi đònh nghóa nguồn gốc nó, chúng có nguồn gốc từ dạng blastocyst phôi Blastocyst dạng phát triển tất yếu phôi trước bám vào thành tử cung Ở giai đoạn này, phôi chuột gồm lớp tế bào (ngoại phôi bì), khoang phôi khối tế bào bên Tế bào gốc tăng nhanh số lượng biệt hóa chức thành quan trưởng thành Nếu tách tế bào gốc khỏi phôi chuyển chúng vào quan khác hay thể trưởng thành, chúng hòa nhập, tiếp tục phân chia thể khả chuyên biệt theo quan Tương tự, tế bào cô lập invitro, tạo dòng (colony) tác động biệt hóa, chúng có khả biến đổi hình thái đặc điểm sinh lý dạng tế bào khác phòng thí nghiệm.[1][2] Hầu hết tế bào thể có nguồn gốc từ tự chép tế bào gốc Do đó, nhà khoa học nhận thấy cần phải phát triển đặc điểm đặc biệt để giúp tế bào gốc biệt hóa tốt Austin Smith xác đònh đặc điểm cụ thể tế bào gốc phôi sau:  Chuyển hóa từ lớp tế bào bên hay nội phôi bì blastocyst  Tồn trì ổn đònh nhiễm sắc thể dạng lưỡng bội  Có thể phát triển thành loại tế bào khác xuất phát từ lớp mầm riêng biệt phôi (nội bì, trung bì ngoại bì)  Có khả hợp thành thể thống tất mô thai suốt thời kỳ phát triển  Có khả nhân dòng tế bào phát triển thành tế bào trứng tinh trùng  Biểu nhân tố chép Octo-4, làm hoạt hóa hay kìm hãm gene đích trì phát triển nhanh tế bào gốc phôi không biệt hóa  Có thể tiếp tục phát triển tự đổi  Dòng tế bào gốc phôi đơn bào phát triển thành dòng tế bào hay dòng tế bào có nguồn gốc  Trong tổng hợp DNA, khác với tế bào sinh dưỡng, tế bào gốc phôi không đòi hỏi tác nhân kích thích bên bắt đầu chép DNA Hình 3.7: Tế bào phôi sau nuôi giếng ngày 3.5 KẾT QUẢ TÁCH, THU NHẬN VÀ TINH SẠCH TẾ BÀO MẦM 3.5.1 Thu nhận cầu sinh dục Tiến hành giải phẫu chuột mang thai, thu phôi thu nhận cầu sinh dục Theo phương pháp mục 2.2.3, thu kết trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 : Số lượng cầu sinh dục thu qua đợt thí nghiệm Đợt Số chuột Số phôi Số cầu sinh dục Tỷ lệ (%) Tổng 3 2 1 15 11 18 20 13 13 93 16 25 40 24 26 12 16 166 72.7 69.4 87.5 100 92.3 100 100 100 90.2 Hình 3.8: Cầu sinh dục trung thận Cầu sinh dục ( ) trung thận ( ) Nhận xét : Theo lý thuyết phôi thu nhận cầu sinh dục hai bên, nhiên thực tế tổng số lượng cầu sinh dục thu hơn, đạt 90.2% Điều giải thích trình thu nhận khó khăn thao tác chưa hoàn thiện phôi thu 1, hay cầu sinh dục 3.5.2 Thu nhận hỗn hợp tế bào từ cầu sinh dục Tiến hành thao tác theo mục 2.2.7 phần phương pháp, thu hỗn hợp tế bào từ cầu sinh dục phân cắt Cầu sinh dục sau xử lí với collagenase tạo huyền phù tế bào Trong dòch huyền phù hỗn hợp tế bào bao gồm loại tế bào tế bào mầm, tế bào sinh dưỡng tế bào hồng cầu Hỗn hợp tế bào tiếp tục đem nuôi cấy, xác đònh, thu nhận tinh Hình 3.9:Hỗn hợp tế bào thu nhận từ cầu sinh dục 3.5.3 Nhận diện tế bào mầm Theo phương pháp mục 2.2.8, thu hình ảnh sau: Hình 3.10: Tế bào mầm nhuộm Alkaline phosphatase Nhận xét Các tế bào dương tính với Akaline Phosphatase có màu xanh Các tế bào dương tính tế bào mầm Như trình bày phần tổng quan, tế bào dương tính với Akaline Phosphatase không tế bào mầm mà tế bào gốc, tế bào khối u tế bào khác trường hợp tế bào dương tính tế bào mầm Điều giải thích lí sau:  Các tế bào thu nhận từ cầu sinh dục tế bào gốc phôi hay tế bào khối u tế bào khác gan, ruột…  Trong cầu sinh dục tồn tế bào sinh dưỡng, tế bào máu tế bào mầm Những tế bào sinh dưỡng tế bào máu không dương tính với Alkaline Phosphatase enzym tồn với hàm lượng Như từ hình ảnh ta thấy có diện tế bào mầm cầu sinh dục giai đoạn phôi 12.5 ngày 3.5.4 Tinh tế bào mầm Như đề cập mục 2.2.9 phần phương pháp tế bào sinh dưỡng sau lắng bám tốt vào giá thể plastic, thủy tinh hay agar nuôi cấy Trong đó, tế bào mầm đặc tính Điều giải thích bề mặt tế bào mầm không tồn protein bám bề mặt tế bào sinh dưỡng Do vậy, tinh tế bào mầm khỏi tế bào sinh dưỡng (đây thành phần tế bào tạp nhiễm quan trọng nhất) phương pháp nuôi cấy Tiến hành theo phương pháp mục 2.2.9 sau nuôi cấy chừng 24 giờ, thu tế bào mầm tương đối Hình 3.11: Tế bào mầm sau tinh (Độ phóng đại 200 lần) Nhận xét Hình 3.12: Tế bào mầm sau tinh (Độ phóng đại 400) Quần thể tế bào mầm sau thu nhận thực tinh sạch, song tồn số tế bào hồng cầu – tế bào không bám vào đóa nuôi – kể tế bào chết Do quần thể tế bào mầm thu nhận không đạt độ tinh 100% Tuy nhiên khả sống nên sau vài lần nuôi cấy (nuôi cấy quần thể tế bào mầm thu sau tinh lớp feeder) tế bào hồng cầu tế bào chết loại bỏ khỏi môi trường nuôi cấy Điều giải thích tế bào mầm sống thời gian dài mà lớp feeder để bám vào, nên nuôi cấy tế bào mầm bám vào lớp feeder tế bào hồng cầu tế bào chết loại khỏi môi trường nuôi cấy sau vài lần thay môi trường Hơn thực tế không cần đánh giá mức độ nhiễm tế bào hồng cầu tế bào chết, lẽ chúng không ảnh hưởng lớn đến việc nuôi cấy sau bò loại bỏ sau vài lần thay môi trường nuôi cấy 3.6 KẾT QUẢ PHÁT HIỆN CÁC TẾ BÀO CO BÓP  Trong trình nuôi cấy phát ghi nhận hình ảnh hoạt động tế bào có khả co bóp môi trường theo dõi hoạt động tế bào vòng 14 ngày  Kết trình bày bảng 3.5 đồ thò 3.4 Thời gian Số lượng quan sát (ngày) (10 giếng) Sau ngày Sau ngày Sau ngày 14 Sau ngày 14 Sau ngày 15 Sau ngày 12 Sau ngày 10 Sau ngày Sau ngày Sau 10 ngày Sau 11 ngày Sau 12 ngày Sau 13 ngày Sau 14 ngày Bảng 3.5: Số lượng tế bào cụm tế bào co bóp môi trường nuôi cấy 16 14 Số tb co bóp 12 10 0 10 11 12 13 14 15 Ngày Đồ thò 3.4: Số lượng tế bào cụm tế bào co bóp môi trường nuôi cấy Nhận xét:  Khi tạo huyền phù tế bào, không thấy xuất tế bào có khả tự co bóp  Sau 24 nuôi cấy, bắt đầu xuất tế bào cụm tế bào có khả tự co bóp theo nhòp Các tế bào ghi nhận tế bào cơ, chúng tế bào tim biệt hóa trình phát triển phôi  Các tế bào cụm tế bào có tăng nhanh vòng ngày nuôi cấy, nhiều cụm tế bào phát tự co bóp giếng nuôi Trong cụm tế bào phát từ trước giữ hoạt động chúng  Số lượng tế bào có khả tự co bóp không đổi vào ngày Điều giải thích số lượng tế bào biệt hóa thành tế bào có khả đập biểu hết  Bắt đầu từ ngày thứ trở đi, tế bào giảm dần số lượng Có thể tế bào vào chu trình tự diệt có khả tập hợp lại thành mô điều kiện nuôi cấy in-vitro Các tế bào giảm mạnh ngày số ngày quan sát tế bào 14 ngày sau nuôi cấy  Những tế bào quan sát dạng mô cụm tế bào có khả tồn lâu tế bào riêng lẻ, tập hợp lại loại tế bào nên khả co bóp chúng mạnh nhiều Để xác đònh tế bào có khả co bóp nhòp nhàng tế bào tim, tiến hành tách tế bào từ phôi lớn hình thành vùng tim Dưới kính vi thao tác phôi tách thành vùng: vùng có tim vùng tim Tế bào từ hai vùng tách rời trypsin nuôi cấy theo phương pháp nêu mục 2.2.3 Kết cho thấy: - Những tế bào co đập xuất lô tế bào tách từ vùng phôi có tim - Hình dạng, kích thước kiểu co bóp tế bào hoàn toàn giống tế bào co bóp phân lập từ dãi mầm phôi - Các cụm tế bào co bóp sống hoạt động 30 ngày môi trường nuôi cấy Như kết luận quần thể tế bào phân lập từ dãi mầm phôi chuột có diện tế bào gốc tim, trình nuôi cấy tế bào gốc biệt hoá thành tế bào tim có khả co bóp Hình 3.13: Hình ảnh tế bào cụm tế bào tim PHẦN KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Đề tài đạt kết sau:  Thành công việc gây động dục nhân tạo tiến hành cho thụ tinh tự nhiên chuột nhắt trắng (Mus musculus Var Albino)  Xây dựng quy trình phân lập nuôi cấy tế bào phôi chuột nhắt trắng, khảo sát khả tăng sinh tế bào phôi điều kiện in vitro với môi trường D’MEM 10% FBS  Nhận diện diện tế bào mầm quần thể tế bào thu từ cầu sinh dục phương pháp nhuộm Enzym Alkaline phosphatase  Tách, tinh thu nhận quần thể tế bào mầm tinh  Khảo sát biệt hóa tế bào phôi thành tế bào có khả co bóp thời gian 14 ngày Tuy nhiên việc tinh tế bào mầm phương pháp nuôi cấy loại bỏ tế bào sinh dưỡng nhiễm vào không loại bỏ hết tế bào hồng cầu tế bào chết Dựa kết đạt , kết luận đề tài sau:  Tế bào phôi chuột có khả thích nghi tăng sinh điều kiện nuôi cấy in vitro với môi trường D’MEM 10% FBS, sử dụng quy trình nuôi cấy việc thu nhận tế bào fibroblast để tạo lớp feeder tiến hành nuôi cấy tế bào mầm thu nhận khảo sát phát triển chúng  Phương pháp nhuộm Enzym APase sử dụng để nhận diện tế bào mầm quần thể tế bào tách từ cầu sinh dục  Có thể ứng dụng quy trình để thu nhận tế bào mầm tinh từ cầu sinh dục phôi 12.5 dpc 4.2 ĐỀ NGHỊ  Thử nghiệm thiết lập phương pháp tinh khác để loại bỏ tế bào hồng cầu tế bào máu, từ thu nhận trực tiếp quần thể tế bào mầm không tạp nhiễm  Bổ sung hoàn thiện môi trường nuôi nhân tố ức chế biệt hoá LIF ( Leukemia Inhibitory Factor ) để tiến hành nuôi cấy tế bào mầm thu lớp feeder từ fibroblast khảo sát tăng sinh chúng  Tiến hành thu nhận tế bào mầm từ cầu sinh dục giai đoạn phôi khác : phôi dpc, phôi 10 dpc , phôi 14 dpc khảo sát số lượng tế bào mầm giai đoạn phôi khác  Hoàn thiện thao tác xây dựng phương pháp thích hợp với việc trang bò thiết bò tiên tiến để thu nhận tế bào gốc phôi ES TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Hoàng Trâm Anh, Lương Quế Anh, Cao Quốc Liên, Stem Cell, Seminar Công Nghệ Sinh Học Động Vật, ĐHQG Tp.HCM, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Khoa Sinh, môn Công Nghệ Sinh Học, Tp.HCM, 2003 [2] Nguyễn Thò Thanh Hiền, Giang Hoa, Nguyễn Giang Sơn, Trần Đặng Hiền Thảo, Stem Cell, Seminar Công Nghệ Sinh Học Động Vật, ĐHQG Tp.HCM, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Khoa Sinh, môn Công Nghệ Sinh Học, Tp.HCM, 2003 [3] Nguyễn Thò Thương Huyền, Thử nghiệm thu nhận, nuôi cấy chuyển phôi chuột nhắt trắng (Mus musculus var Albino), Luận văn thạc sỹ, 2004 [4] Phan Kim Ngọc, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, Sinh học sinh sản, Nhà xuất Giáo dục, 2000 [5] Phạm Văn Phúc, Thu nhận tinh tế bào mầm từ phôi chuột (Mus musculus Var Albino) (12,5 ngày) tạo lớp feeder mef nuôi tế bào mầm, Khoá luận cử nhân khoa học, 2005 [6] Nguyễn Đăng Quân, Xây dựng mô hình thử nghiệm chất chống ung thư, Luận văn thạc sỹ, 2003 [7] Lê Phan Quốc, Bước đầu phân lập nuôi tế bào phôi chuột nhắt trắng (Mus musculus Var Albino giai đoạn 9-13 ngày, Khoá luận tốt nghiệp, 2004 [8] Trần Linh Thước, Phan Kim Ngọc, Công Nghệ tế bào động vật, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, 2003 [9] Trương Văn Trí, Phân lập cụm tế bào phôi chuột nhắt trắng (Mus musculus Var Albino) khảo sát diện tế bào mầm, Khoá luận tốt nghiệp, 2005 [10] Nguyễn Lê Xuân Trường, Phân lập nuôi cấy tế bào phôi chuột nhắt trắng (Mus musculus Var Albino), Khoá luận cử nhân khoa học, 2004 Tài liệu Tiếng Anh [11] Committee on Defining Science – based Concerns Associated with Products of Animal Biotechnology, Animal Biotechnology: Science – based concerns, The National Academies Press, Washington, D.C, 2002 [12] Daniel R.Marshak, Richard L Gardner, David Gottlieb, Stem cell biology [13] K Skinboll, Ph.D Director, Stem cell: Scientific progress and future research directions, National instituses of Heath department of Heath and human services, June 2001 [14] Martin Evens, Tissue culture of Embryonic Stem cell, Cell and tissue, culture and associated techniques, 1998 [15] Paul M Wassarman, Melvin L Depamphilis, Guide to Techniques in mouse Development, Academic Press Inc, 1993 [16] Peter J Quesenbery, Gary S Stein, Bernard G Forget, Sterman M.Weirsman, Stem cell biology and gene theragy [17] Scott F Gilbert, Development biology, Surderland Massachusetts [...]... Chiến lược ghép tế bào gốc Hình 1.7: Chiến lược dùng tế bào gốc trong liệu pháp gene Đối với tế bào mầm ( cũng là tế bào gốc đa năng và là nguồn gốc cho các tế bào sinh dục) thì ngoài ứng dụng của một tế bào gốc đa năng thì tế bào mầm được sử dụng vào những mục đích chuyên biệt như :  Điều trò bệnh vô sinh bằng cách nuôi mô sinh dục để thu nhận tế bào mầm và cho biệt hoá thành tế bào sinh dục hoàn... huyền phù tế bào bằng pipette 1ml đến khi thu dòch tế bào đồng nhất  Xác đònh mật độ tế bằng buồng đếm hồng cầu  Cấy dòch huyền phù tế bào vào bình Roux môi trường D’MEM sao cho mật độ tế bào cuối cùng là106 tế bào/ 1ml  Ủ ở tủ ấm 37oC, 5%CO2 2.2.7 Quy trình thu nhận hỗn hợp tế bào chứa tế bào mầm (Germ Cell) từ cầu sinh dục Trong phôi chuột, các tế bào mầm sinh dục liên kết lỏng lẻo với các tế bào khác... khi tách tử cung Hình 2.6 : Phôi chuột ( ) và nhau thai ( ) Hình 2.7: Phôi chuột sau khi cắt nhau thai Hình 2.8: Vò trí cắt phôi để tách gan Gan chuột, Vò trí cắt, Dao cắt Hình 2.9: Phôi sau khi cắt phần đầu 2.2.4 Phương pháp tách và nuôi tế bào phôi  Dùng pipetteman hút phần phôi tách được cho vào eppendorf có chứa 0,5ml trypsin – EDTA 0,25%  Cho từ 2 – 5 phôi vào eppendorf tùy theo kích thước phôi. .. ngoại phôi bì và khối tế bào bên trong sẽ tạo ra tế bào gốc phôi tốt nhất.[9][10] 3 TẾ BÀO MẦM SINH DỤC 3.1 Khái niệm Tế bào mầm sinh dục (gọi tắt tế bào mầm – Germ Cell ) là những tế bào gốc đa năng có thể phân chia liên tục vừa tự làm mới vừa biệt hóa tạo thành các giao tử (tinh trùng, trứng) từ đó tạo ra cơ thể mới.[5] 3.2 Sự hình thành và tồn tại của các tế bào mầm Trong quá trình phát triển của phôi, ... kiện in vivo và cả trong điều kiện in vitro.[5] Các tế bào gốc đa năng có thể được thu nhận từ ba nguồn gốc:  Các tế bào gốc phôi (ES) thu nhận từ phôi giai đoạn blastocyst  Các tế bào mầm sinh dục (GC) thu nhận từ phôi thai (chuột từ giai đoạn 8,5 – 12,5 dpc, người 5 – 7 tuần tuổi)  Các tế bào khối u chứa nhiều loại tế bào khác nhau của các lớp mầm Hình 1.4 : Nguồn thu nhận các tế bào gốc đa năng... số lượng tế bào theo thời gian sau mỗi 24 giờ  Cho một lượng tế bào bằng nhau (106 tế bào/ 1ml) vào các giếng của đóa 24 giếng  Mỗi ngày thu tế bào và xác đònh số tế bào có trong một giếng  Tế bào được thu nhận như sau:  Hút bỏ môi trường trong giếng ra, rửa tế bào với 200μl PBS bằng cách tráng nhẹ vài lần  Cho vào giếng 50μl trypsin và ủ trong 3 phút  Cho vào giếng 450μl môi trường và huyền phù... màu xanh) 4 NGUỒN GỐC THU NHẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN TẾ BÀO GỐC ĐA NĂNG Hầu hết các nhà khoa học sử dụng tế bào gốc đa năng (pluripotent stem cell hay leuripotent stem cell) để chỉ những tế bào gốc thu nhận từ túi phôi Từ pluri có nguồn gốc từ tiếng Hy lạp là plures nghóa là nhiều Do vậy, những tế bào gốc đa năng có thể biệt hóa thành bất kì tế bào nào trừ các tế bào thu nhận từ màng phôi Đây là một... Ở mỗi tế bào sinh dưỡng của động vật hữu nhũ cái, một trong hai nhiễm xắc thể X trở nên bất hoạt hoàn toàn , nhưng sự bất hoạt của nhiễm sắc thể X không xuất hiện ở tế bào ES.[1][2][7][9] Hình 1.2: Sơ đồ biệt hóa các tế bào từ túi phôi ở người 2.2 Nguồn gốc của tế bào gốc phôi Phôi động vật có vú khi phát triển thì từng đám tế bào trong đám đại phôi bào chìm xuống, trước khi phôi bám vào thành... laser, và sau đó xuyên qua một trường điện từ Các tế bào huỳnh quang tích điện âm, trong khi các tế bào không huỳnh quang tích điện dương, sự khác điện tích cho phép các tế bào gốc được tách ra khỏi các tế bào khác Công cụ này còn được dùng để phân lập tế bào gốc dựa vào sự khác nhau về độ lớn tế bào, hình dạng bề mặt, độ trong suốt, độ đậm đặc NST, các marker bề mặt, marker bên trong của tế bào … Hình... dạng tế bào thông qua sự điều khiển biệt hóa, sau đó được cấy ghép để thay thế hoặc phục hồi các cơ quan bò tổn thương Các tế bào ES thuận lợi cho việc cấy ghép nếu chúng không bò hệ thống miễn dòch của cơ thể thải loại Tế bào gốc phôi người có thể được dùng để nghiên cứu các bất thường trong sự phát triển của phôi người: khuyết tật bẩm sinh, quái thai và nhất là sẩy thai… Việc nghiên cứu tế bào ES