Nghiên cứu quy trình kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc mô mỡ trên nền màng polymer sinh học PHB

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI    Nguyễn Thị Hằng NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC MÔ MỠ TRÊN NỀN MÀNG POLYMER SINH HỌC PHB Chuyên ngành: công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đỗ Minh Trung – Học viện Quân y TS Đặng Minh Hiếu – Đại học Bách Khoa Hà Nội HÀ NỘI – 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi in c n n u n n công nh ch nh ôi nghiên c u – Học iên Nguy n Thị H ng, chuyên ngành Th c s Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Th c h h àn hành ƣ i s hƣ ng nc iệu, ế u n u nh ày Hà Nội Đ i úy TS Đỗ Minh Trung – Học iện Quân y TS Đặng Minh Hiếu – Đ i học B ch Kh c u hành u c , T ƣ ng Đ i học B ch h Hà Nội Mộ số nhiệ hể ƣ c c c ồng s ch ng u n n ung h c chƣ h s nghiên ng C c số ƣ c công ố n h c T c gi u n n Nguyễn Thị Hằng ii ng c c LỜI CẢM ƠN Trung – Họ v ệ Q Nộ H Yv ặ ã ậ v dẫ v ọ ã ọ ả ro o Q ệ ro r r N YD ệ ả o ỉ ọ r P ả ọ v C ã ệ ậ v Họ v ệ Q ậ v ộ – Tê bào v ệ ả N K o H v v Phòng Protein – ộ ảo áo ọ Bá ệ C K o H Nộ ã ệ ả ọ C á r ọ ro ộ E ọ Q Họ Bá ỉ ảo ro ệ ệ - Tr r v H ả ộ ậ v E v v v è N ả o ộ ả Họ v Nguyễn Thị Hằng iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ii LỜI CẢM ƠN iii DANH MỤC CÁC CHỮ, KÍ HIỆU VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC BIỂU ĐỒ x ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 BỎNG DA VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐIỀU TRỊ 1.1.1 Da TẾ BÀO GỐC Kh i niệ 2 Phân i ế gốc Đặc iể Ứng c TBG 10 ng c ế gốc 10 Tế gốc ô ỡ ng ng TBG ô ỡ 12 POLY β – HYDROXYBUTYRATE (PHB) 16 Cấu úc hó học c PHB: 17 C c ặc nh hó ý c PHB 18 C c nghiên c u ng ng PHB 21 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 21 V iệu nghiên c u 25 2.2 Phƣơng h nghiên c u 26 2.2.1 Nuôi cấy ế 26 2.2.3 Phƣơng h àng PHB 27 2.2.4 Phƣơng h h ch ng c àng PHB 27 2 Phƣơng h nghiên c u hiệu u gh àng ế iều ị ế hƣơng h c nghiệ 28 iv 226 X ý hân ch số iệu 35 2 Đị iể 228 Đ nghiên c u 35 c nghiên c u 35 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 Kế u àng, h iện nuôi cấy ộ ch ng àng ế gốc c ô àng PHB h ỡ ên 1 Kế u 3.1.2 Kế u 3 Kế u nuôi cấy ng sinh ế gốc àng u c ịnh ộ h 3.2.1 Kế ô ch ng c ỡ ên àng PHB ên hỏ 37 ô ỡ 40 àng PHB 41 s c c iều iện nuôi cấy àng ế gốc ên y e sinh học PHB 42 Đ nh gi hiệu u ên ộng àng PHB 37 àng PHB 37 Nuôi cấy TBG Kế s c c iều àng ế ên àng PHB iều ị ế hƣơng ỏng h c nghiệ 52 u h y ổi 3.2.2 Th y ổi ế 3.2.3 Ảnh hƣởng c u ộ số số ộ số gh ế àn hân 52 nghiệ c chuộ ng gh ế 53 i iền ế hƣơng 55 3.2.4 Vi hu n học ế hƣơng ỏng h c nghiệ 60 KẾT LUẬN 66 KIẾN NGHỊ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 v DANH MỤC CÁC CHỮ, KÍ HIỆU VIẾT TẮT ACD Acid citric, Citrat natri, Dextrose ADSCs Adipose derived stem cells: Tế gốc BMSC Bone marrow Messenchymal Stem cell: Tế gốc ung ô ô ỡ y ƣơng FBS Fetal Bovine Serum: Huyế h nh MSCs Mesenchymal stem cells: Tế gốc ung ô SVF Stromal vascular fraction: Phân ch SLTB Số ƣ ng ế PBS Phosphate-buffered saline: Đệ PRP Platelet Rich Plasma: Huyế ƣơng giầu iểu cầu PHA PolyhydroxylAlkanoates PHB PolyhydroxylButyrate TB Tế TBG Tế gốc TG Tryacylglycerol vi h i ê n uối hố h u DANH MỤC BẢNG B ng 1 Mộ số nghiên c u ng ng TBG ỗ ỡ B ng1 S s nh ộ ài ặc nh giữ PHB nh B ng1 C c ch ng hu n h ng iều ị 13 PP .18 gi s n uấ PHB uy ô công nghiệ .20 B ng Kế u nh gi c ộ ch ng c àng PHB s u gi ắ àng 37 B ng Kế u nh gi c ộ ch ng c àng PHB s u 24 gi ắ àng 38 B ng 3 Kế u nh gi c ộ ch ng c àng PHB s u 48 gi ắ àng 38 B ng Kế u nh gi c ộ ch ng c àng PHB s u 72 gi ắ àng 39 B ng M ộ ế gốc ô ỡ ên PHB c c nồng ộ ổ àngPHB h c 43 B ng Kế u số ƣ ng ế nuôi màng PHB 1% h s c c hể ch h c 46 B ng Kh s B ng Kế u TBG h i gi n nuôi TB màng PHB 1% - 7ml .48 ng sinh TBG ô ỡ ên àng PHB 1% - 7ml ộ n ầu h c nh u .49 B ng 3.9 Th y ổi ọng ƣ ng c c ic c chuộ cống nghiên c u (XFD: T ọng ƣ ng chuộ – D0: Th i iể gây ỏng – D5: Th n ầu iể ngày s u gây ỏng – D10: Th i iể 10 ngày s u gây ỏng) 52 B ng 10 Th y ổi c c số huyế học c chuộ nghiên c u 53 B ng 11 Th y ổi c c số g uc se c e inin c B ng 12 Th y ổi h chuộ nghiên c u 54 ộ enzy GOT, GPT huyế h nh c chuộ nghiên c u .54 B ng 13 Di n iến â sàng ế hƣơng ỏng h c nghiệ .55 B ng 14 Th y ổi iện ch ế hƣơng ỏng 56 B ng 15 Tốc ộ iền ế hƣơng .56 B ng 16 Liên u n h i gi n số ế hƣơng iền h àn àn .56 B ng 17 Đặc iể h nh h i cấu úc ô ế hƣơng i c c h i iể 58 B ng 18 Th y ổi số ƣ ng ế iê i ô ế hƣơng 58 B ng 19 Th y ổi số ƣ ng nguyên s i i ô ế hƣơng 59 B ng 20 Th y ổi số ƣ ng ế s i i ô ế hƣơng 59 vii B ng 21 Th y ổi số ƣ ng ân ch i chỗ ế hƣơng .59 B ng 22 Tỷ ệ ế hƣơng cấy hu n ƣơng nh 60 B ng 23 Tỷ ệ uấ c c ch ng i hu n ngày D0 61 B ng 24 Tỷ ệ uấ c c ch ng i hu n ngày D7 62 B ng 25 Tỷ ệ nhi hối h c c i i hu n ên ộ ế hƣơng D0 62 B ng 26 Tỷ ệ nhi hối h c c i i hu n ên ộ ế hƣơng D7 63 B ng 27 Th y ổi ộ số ƣ ng i hu n ế hƣơng .64 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1 Cấu úc H nh Tế gốc H nh Công h c cấu u c H nh Cấu úc hó học c PHA 16 PHB 17 H nh Gây ỏng ch chuộ cống 29 H nh 2 H nh nh chuộ ƣ c gây ỏng (A) Vế gây ỏng c H nh Cắ ọc ỏ h i chuộ (B) 30 31 H nh H nh nh ề cấy hu n 33 Hình 3.1 Màng PHB 37 H nh H nh nh h h n ng H nh 3 H nh nh TBG ô ch ng c àng PHB ên hỏ 39 ỡ 40 H nh Nuôi cấy TBG ên àng PHB 41 H nh H nh nh ề àng PHB (A) Màng ế Gie s (B) ƣ c s ng H nh H nh nh nhuộ ng h nghiệ ế gốc ên PHB ƣ c nhuộ ng 42 ô ỡ nuôi cấy ên PHB c c nồng ộ khác 44 H nh H nh nh nuôi cấy nhuộ àng TBG ô ỡ ên àng PHB 1% ƣ c ng Gie s 52 H nh Vế ỏng sâu ngày h s u ỏng ƣ c cắ ọc s ch h i , chu n ị gh ế Vùng nghiên c u ùng ối ch ng ƣơng ƣơng nh u ề iện ch 57 H nh Vế ỏng ngày h s u gh ế , ùng A có ấu hiệu iểu hó , ùng B có ấu hiệu iê ung huyế ế hƣơng 57 Hình 3.10 H nh h i cấu úc ô ế hƣơng 60 Hình 3.11 H nh nh nuôi cấy i hu n hân c chuộ số 1, ngày nghiên c u h s u gh ix ế hƣơng ùng A ùng B ế 61 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu X c ịnh ộ ế gốc àng PHB h c nh u (ĐC: nuôi TBG Biểu Kế u c ịnh ô ỡ ên PHB c c nồng ộ ổ c iế ên ộ ế gốc e) 43 ô ỡ h s àng ế hể ch PHB 1% h c nh u 46 Biểu 3 Kh s h i gi n nuôi TB ên Biểu T ng sinh TBG i ộ TB ộ TB ộ TB ộ TB ô ỡ ên PHB 1% - 7ml 51 ô ỡ ên PHB 1% - 7ml 51 n ầu IV 0,2 105 ± 0,08.105(TB/ ml) 51 Biểu T ng sinh TBG ic c ỡ ên PHB 1% - 7ml 50 n ầu III 0,40 105 ± 0,14.105 (TB/ ml) 51 Biểu T ng sinh TBG i ô n ầu II 0,50 105 ± 0,25.105(TB/ ml) 50 Biểu T ng sinh TBG i ỡ ên PHB 1% - 7ml 50 n ầu I 1,5 105 ± 0,7.105 (TB/ ml) 50 Biểu T ng sinh TBG i ô àng PHB 1% - 7ml 48 ộ TB ô ỡ ên PHB 1% - 7ml 51 n ầu I, II, III, IV 51 x Bảng 3.19 Thay đổi số lượng nguyên bào sợi mô vết thương Số lƣợng nguyên bào sợi/ĐVDT Thời điểm P Vùng A (n=12) Vùng B (n=12) D7 18,67 ± 1,41 11,45 ± 7,55