Nghiên cứu hoàn chỉnh kỹ thuật nuôi cấy đơn bào ký sinh và gây bệnh Phạm Trí Tuệ, Phạm Văn Thân, Trương Thị Kim Phượng, Phạm Ngọc Minh, Lê Thị Tuyết Khanh, Cao Vân Huyền Bộ môn Ký sinh
Trang 1Nghiên cứu hoàn chỉnh kỹ thuật nuôi cấy
đơn bào ký sinh và gây bệnh
Phạm Trí Tuệ, Phạm Văn Thân, Trương Thị Kim Phượng, Phạm Ngọc Minh, Lê Thị Tuyết Khanh, Cao Vân Huyền
Bộ môn Ký sinh trùng, Trường Đại học Y Hà Nội
Đáp ứng yêu cầu nuôi giữ dài ngày một số chủng đơn bào phục vụ nghiên cứu và giảng dạy, chúng tôi đã tiến hành đề tài này và có một số nhận xét sau:
1 Môi trường Palova có thể sử dụng tốt để nuôi giữ E histolytica và một số loại đơn bào khác như: E gingivalis, Acanthamoeba, T vaginalis Những yếu tố đảm bảo cho sự phát triển tốt của đơn bào trong nuôi
cấy là: nhiệt độ, tỷ lệ huyết thanh ngựa, pH của môi trường và lượng tinh bột gạo
2 Quy trình nuôi cấy
- Nhiệt độ nuôi cấy luôn giữ ổn định ở 37 0 C
- Đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy
- Môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự phát triển của đơn bào:
+ Tỷ lệ huyết thanh ngựa: 10%
+ pH của môi trường nuôi cấy: 6 - 6,5
+ Lượng tinh bột gạo: 5mg/1 ống nuôi cấy
- Khi cấy truyền, lấy ở rìa đáy ống môi trường có nhiều đơn bào nhất
- Thời gian cấy truyền tốt nhất là ngày đơn bào có mật độ cao nhất và hoạt động khỏe Với nuôi cấy amíp: + Ngày thứ 2 (3 lần cấy đầu)
+ Ngày thứ 3 (các lần cấy sau)
- Với quy trình này (tính đến tháng 7 năm 2004), chúng tôi đã nuôi giữ được 12 mẫu đơn bào thuộc các giống:
Entamoeba, Acanthamoeba và Trichomonas với thời gian từ 6 đến 24 tháng và hiện vẫn đang phát triển tốt
i Đặt vấn đề
Vấn đề nuôi cấy amíp trong phòng thí nghiệm
đã được chú ý từ lâu Đến năm 1918 hai tác giả là
Boeck và Drbohlav đã tìm ra môi trường để nuôi
cấy amíp gây bệnh Entamoeba histolytica
ở Việt Nam trong những năm trước đây cũng đã
có một số cơ sở trong đó có Bộ môn Ký sinh trùng
Trường Đại học Y Hà Nội đã nghiên cứu nuôi cấy E
histolytica bằng môi trường Palova và thu được
những kết quả nhất định Tuy nhiên việc nuôi cấy rất
khó khăn do thể hoạt động của amíp rất dễ chết nên
vẫn chưa nuôi cấy được dài ngày [1]
Để đáp ứng những yêu cầu cần thiết phải nuôi
giữ dài ngày các chủng đơn bào ký sinh, chúng tôi
đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu hoàn chỉnh kỹ thuật nuôi cấy đơn bào ký sinh và gây bệnh” nhằm các mục tiêu sau:
1 Xác định một số yếu tố chủ yếu ảnh hưởng
đến nuôi cấy đơn bào
2 Xây dựng qui trình nuôi cấy đơn bào thường qui áp dụng trong Labo để giữ các chủng đơn bào nuôi cấy dài ngày
ii đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu
1 Đối tượng
1.1 Quy trình nuôi cấy
Tiến hành nghiên cứu theo quy trình của Baillenger J trên môi trường Palova [3]
Trang 21.2 Các chủng đơn bào nghiên cứu
- E histolytica phân lập từ: phân bệnh nhân có
hội chứng lỵ, tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa Chúng
tôi đã phân lập được 4 mẫu bệnh phẩm có E
histolytica, ký hiệu là H1, H2, H3, H4 Mẫu H2 đã
làm phản ứng PCR với gen mồi là E histolytica và
cho kết quả dương tính
- E gingivalis: bốn mẫu bệnh phẩm có E
gingivalis được phân lập từ bựa răng của những
bệnh nhân viêm quanh răng, ký hiệu là G1, G2, G3
và G4
- Acanthamoeba: hai mẫu bệnh phẩm có
Acanthamoeba phân lập từ mảnh giác mạc của
bệnh nhân bị viêm loét giác mạc, ký hiệu là M1 và
M2 (Bệnh viện Mắt trung ương gửi đến)
- Trichomonas vaginalis: bốn mẫu bệnh phẩm
có T vaginalis phân lập từ dịch nhầy âm đạo của
bệnh nhân viêm âm hộ - âm đạo, ký hiệu là V1,
V2, V3 và V4
2 Vật liệu nghiên cứu
2.1 Môi trường nuôi cấy Palova
Là loại môi trường lỏng, rẻ tiền, dễ pha chế đã
được sử dụng từ lâu gồm:
Nước cất: 500ml
2.2 Huyết thanh động vật cho môi trường
nuôi cấy: huyết thanh ngựa được cho vào môi
trường ngay trước khi cấy với các tỷ lệ 5%, 10% và
15%
2.3 Tinh bột gạo: tinh bột gạo được sấy bảo
quản vô trùng và chỉ cho vào môi trường một
lượng nhỏ (3 - 10mg) trước khi tiến hành cấy
2.4 Dung dịch nhuộm để định loại:
hematoxylin, hematoxylin - eosin
3 Phương pháp nghiên cứu
3.1 Lấy bệnh phẩm: tùy theo vị trí ký sinh và
tính chất gây bệnh của từng loại đơn bào:
- Lấy ở nơi có thể có nhiều đơn bào (nhầy máu
đối với amíp…)
3.2 Kỹ thuật pha môi trường Palova: pha theo
công thức, điều chỉnh pH = 6 - 6,5 Chia vào các ống nuôi cấy, mỗi ống 5ml, hấp tiệt trùng Để nguội và bảo quản trong tủ lạnh
3.3 Kỹ thuật nuôi cấy [3], [6]
- Cấy bệnh phẩm: sau khi lấy bệnh phẩm, xét nghiệm thấy có đơn bào phải tiến hành cấy ngay vào môi trường (đã được làm ấm) và để ở tủ ấm
- Cấy truyền trên môi trường: cấy truyền liên tiếp từ môi trường đang cấy sang môi trường mới
- Đánh giá kết quả nuôi cấy:
+ Đơn bào sống/chết
+ Sự hoạt động của đơn bào
+ Mật độ của đơn bào
3.4 Kỹ thuật xác định mật độ đơn bào trong môi trường nuôi cấy: đếm số lượng đơn bào có
trong 0,05ml môi trường nuôi cấy
3.5 Kỹ thuật nhuộm đơn bào: nhuộm
Hematoxylin feric của Heidenhain và nhuộm cải tiến Hematoxylin – Eosin (HE)
3.6 Phản ứng PCR để định loại đơn bào: tiến
hành tại Labo Trung tâm, Trường Đại học Y Hà Nội
3.7 Xử lý số liệu: theo phương pháp thống kê y
sinh học
iii Kết quả
Trang 3Bảng 1 Theo dõi sự phát triển của mẫu amíp H2 trong môi trường Palova qua các lần cấy
Mật độ (số con/0,05ml MTNC)
L
ầ
n
c
ấ
ng 3 TB
ng 3 TB
ng 3 TB
ng 3 TB
ng 3 TB
1 3
5
37 40 3
7
4
7
4
6
5
1
4 8
2 4
2 5
2 4
2 4
1 2
1 2
1 1
1
1
2 4
1
46 45 4
4
6
0
6
4
6
5
6 3
2 7
2 5
2 1
2 4
1 2
1 2
1 1
1
1
3 5
1
58 65 5
8
7
2
7
9
8
3
7 8
2 4
2 6
2 8
2 6
1 3
1 1
1 5
1
3
4 5
7
67 55 5
9
7
8
8
5
7
2
7 8
8 5
9 1
7 9
8 5
3 1
2 9
2 5
2
8
1
2
1
2
1 1 11
5 5
5
62 59 5
8
7
4
8
5
7
0
7 6
8 9
9 5
9 2
9 2
2 9
3 2
2 8
2
9
1
1
1
5
6 5
2
49 61 5
4
7
7
8
0
8
3
8 0
9 1
8 8
9 7
9 2
3 2
3 1
3 1
3
1
1
2
1
1
1 5 12
7 5
6
51 58 5
5
7
4
7
9
8
3
7 8
8 5
9 2
9 4
8 9
2 7
3 3
2 9
2
9
9 1
5
1 0 11
Amíp đạt mật độ cao nhất vào ngày thứ 2 trong 3 lần cấy đầu, các lần cấy tiếp theo mật độ amíp đều
cao vào ngày thứ 3
Bảng 2 So sánh mật độ ngày thứ 3 của mẫu amíp H2 trong môi trường Palova huyết thanh ngựa 5%, 10% và 15%
Sự phát triển của amíp trong môi trường Palova huyết thanh ngựa 10% là cao nhất và cao hơn hẳn so
với môi trường Palova huyết thanh ngựa 5% và 15% Sự khác nhau này có ý nghĩa thống kê với p < 0,001
Bảng 3 So sánh mật độ ngày thứ 3 của mẫu amíp H2 trong môi trường
Palova huyết thanh ngựa pH 6, pH 6,5 và pH 7
Trang 4Trong môi trường Palova pH = 6,5 amíp phát triển rất tốt và không khác biệt so với môi trường có pH
= 6 (p > 0,05) Tuy nhiên trong môi trường Palova có pH = 7 amíp phát triển kém hơn rất nhiều và sự khác nhau này có ý nghĩa thống kê với p < 0,001
Bảng 4 So sánh mật độ ngày thứ 3 của mẫu amíp H2 trong môi trường Pavlova HT ngựa 10%, pH 6,5 với lượng tinh bột gạo khác nhau
Môi trường Palova với lượng tinh bột gạo 5mg amíp phát triển tốt nhất và đạt mật độ trung bình ngày thứ 3 cao hơn hẳn so với cùng môi trường nhưng lượng tinh bột gạo là 3mg và 10mg Sự khác nhau này
có ý nghĩa thống kê với p < 0,001
Bảng 5 Sự phát triển của mẫu amíp H2 trong môi trường Pavlova ở nhiệt độ 37 0 C
Mật độ amíp (số con/0,05ml MTNC) Ngày
bình
1 50 49 41 45 51 47
2 75 67 70 68 79 71
3 121 115 109 122 145 122
4 41 39 27 31 33 34
5 15 12 11 11 15 12
phát triển rất tốt và có mật độ trung bình vào ngày thứ 3 rất cao
Bảng 6 Sự phát triển của mẫu amíp H2 trong môi trường Pavlova ở nhiệt độ 36,5 0 C
Mật độ amíp (số con/0,05ml MTNC) Ngày
bình
1 41 39 47 45 46 43
2 70 64 73 65 71 68
4 39 35 41 36 42 38
0
Trang 5Bảng 7 Sự phát triển của mẫu amíp H2 trong môi trường Pavlova ở nhiệt độ 36 0 C
Mật độ amíp (số con/0,05ml MTNC) Ngày
bình
1 47 45 39 41 46 43
thứ 3 hầu như không còn
Bảng 8 Sự phát triển của mẫu amíp H2 trong môi trường Pavlova ở nhiệt độ 37,5 0 C
Mật độ amíp (số con/0,05ml MTNC) Ngày
bình
1 46 42 39 47 45 43
2 39 42 37 29 31 35
không còn kể từ ngày thứ tư
Bảng 9 Kết quả nuôi cấy các mẫu amíp gây bệnh (Tính đến hết tháng 7 năm 2004)
Mẫu bệnh phẩm H1 chỉ nuôi sống được 20 ngày và mẫu bệnh phẩm H2 nuôi sống được khoảng 7 tháng Nguyên nhân chết của cả 2 trường hợp này đều do sự cố mất điện không đảm bảo được nhiệt độ nuôi cấy Các mẫu bệnh phẩm H3, H4 hiện nay vẫn đang phát triển tốt
Trang 6Bảng 10 Kết quả nuôi cấy một số đơn bào khác (Tính đến hết tháng 7 năm 2004)
sống
E gingivalis
(Răng miệng)
G1 G2 G3
Palova pH = 6,5 huyết thanh ngựa 10%, 5mg tinh bột gạo
10 tháng
9 tháng
9 tháng
Entamoeba
Acanthamoeba
(Mắt)
M1
12 tháng
5 tháng
T vaginalis
(Sinh dục - tiết niệu)
V1 V2 V3
nt
15 tháng
8 tháng
8 tháng
6 tháng
Trong môi trường Palova giống như với amíp
gây bệnh, một số loại đơn bào trên cũng đã nuôi
cấy thành công, giữ sống được dài ngày và hiện
vẫn đang phát triển tốt
v Bàn luận
1 Các yếu tố chủ yếu liên quan đến qui trình
kỹ thuật nuôi cấy đơn bào
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng môi
trường Palova để nuôi cấy các loại đơn bào đã
phân lập được và lượng môi trường trong mỗi ống
nuôi cấy là 5ml Trong quá trình nuôi cấy, chúng
tôi nhận thấy một số yếu tố chủ yếu liên quan đến
nuôi cấy đơn bào gồm:
- Tỷ lệ huyết thanh ngựa trong môi trường nuôi
cấy: kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy
môi trường Palova với tỷ lệ huyết thanh ngựa 10%
đảm bảo tốt nhất cho sự phát triển của đơn bào
Với tỷ lệ huyết thanh ngựa 5% và 15% đơn bào
phát triển kém hơn hẳn Các sự khác nhau này có ý
nghĩa thống kê với p < 0,001 (bảng 2) Kết quả
nghiên cứu của chúng tôi cũng hoàn toàn phù hợp
với kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác [5],
[7]
> 0,05) Môi trường Palova pH 7, đơn bào phát triển kém hơn hẳn và sự khác nhau này có ý nghĩa thống kê với p < 0,001 (bảng 3) Như vậy môi trường Palova pH từ 6 đến 6,5 đơn bào đều có thể phát triển tốt Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với các nghiên cứu của một số tác giả khác [4]
- Lượng tinh bột gạo trong môi trường: kết quả
nghiên cứu của chúng tôi cho thấy với môi trường Palova huyết thanh ngựa 10%, pH 6,5 có 5mg tinh bột gạo thì đơn bào phát triển tốt nhất Lượng tinh bột gạo 3mg và 7mg, đơn bào phát triển kém hơn hẳn Sự khác nhau này có ý nghĩa thống kê với p < 0,001 (bảng 4) Nghiên cứu của một số tác giả khác chỉ nói nên cho một chút tinh bột gạo, mà không đề cập cụ thể nên chúng tôi không so sánh
được [2], [8]
2 Qui trình nuôi cấy đơn bào: như đã tiến hành nghiên cứu áp dụng thích hợp trong Labo
để giữ chủng dài ngày
- Bệnh phẩm có amíp phải được tiến hành nuôi cấy ngay Môi trường nuôi cấy cần thiết phải làm
- Khi cấy từ bệnh phẩm sang môi trường nuôi
Trang 7với amíp) Sau khi cho bệnh phẩm vào môi trường
- Khi cấy truyền, lấy ở rìa đáy ống môi trường
có nhiều đơn bào nhất (khoảng 0,5ml = 10 giọt),
cho vào các ống cấy mới mỗi ống 3 - 5 giọt
- Nhiệt độ nuôi cấy luôn đảm bảo ổn định ở
- Theo dõi sự phát triển hàng ngày của đơn bào
- Đối với amíp, trong 3 lần cấy đầu mật độ cao
nhất vào ngày thứ 2 và giảm rất nhanh kể từ ngày
thứ 3 Các lần cấy sau amíp đều có mật độ cao nhất
vào ngày thứ 3 và đến ngày thứ 4 mới bắt đầu giảm
nhưng giảm chậm hơn (bảng 1) Điều này có lẽ là
do khi vừa cấy từ bệnh phẩm sang môi trường,
trong những lần đầu môi trường còn lẫn tạp khuẩn
trong phân, amíp lại chưa thích nghi nên thời gian
tồn tại sẽ ngắn hơn Trong các lần cấy sau, amíp đã
thích nghi và môi trường lại thuần nhất hơn nên
thời gian tồn tại của amíp dài hơn Chính vì vậy,
theo chúng tôi với 3 lần cấy đầu nên cấy chuyển
vào ngày thứ 2, các lần cấy sau thì nên cấy chuyển
vào ngày thứ 3 Như vậy vừa tiết kiệm được môi
trường lại vừa tiết kiệm được thời gian
v Kết luận
1 Một số yếu tố chủ yếu ảnh hưởng đến nuôi
cấy đơn bào
- Môi trường Palova có thể sử dụng tốt để nuôi
giữ E histolytica và một số loại đơn bào khác như:
E gingivalis, Acanthamoeba, T vaginalis
- Các yếu tố đảm bảo cho sự phát triển tốt của
đơn bào trong nuôi cấy là:
+ Tỷ lệ huyết thanh ngựa
+ pH của môi trường nuôi cấy
+ Lượng tinh bột gạo
+ Nhiệt độ nuôi cấy
2 Qui trình nuôi cấy đơn bào trong Labo để
giữ chủng dài ngày
- Nhiệt độ nuôi cấy luôn giữ ổn định ở 370C
- Đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình
nuôi cấy
- Môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự phát triển của đơn bào:
+ Tỷ lệ huyết thanh ngựa: 10%
+ pH của môi trường nuôi cấy: 6 - 6,5
+ Lượng tinh bột gạo: 5mg/1 ống nuôi cấy
- Khi cấy truyền, lấy ở rìa đáy ống môi trường
có nhiều đơn bào nhất
- Thời gian cấy truyền tốt nhất là ngày đơn bào
có mật độ cao nhất và hoạt động khỏe Với nuôi cấy amíp:
+ Ngày thứ 2 (3 lần cấy đầu)
+ Ngày thứ 3 (các lần cấy sau)
- Với quy trình này (tính đến tháng 7 năm 2004), chúng tôi hiện đang nuôi giữ được 12 mẫu
đơn bào thuộc các giống: Entamoeba, Acanthamoeba và Trichomonas với thời gian từ 6
đến 24 tháng
Tài liệu tham khảo
1 Vũ Văn Phong, Đỗ Dương Thái, Vi Kim
Ngọc (1985), “Phương pháp nuôi cấy đơn bào”, Kỹ
thuật Ký sinh trùng Y học, NXB Tổng cục hậu cần,
tr 29 - 80
2 Đỗ Dương Thái và CS (1975), Ký sinh trùng
và bệnh ký sinh trùng ở người, Quyển III, NXB Y
học, tr 966 - 989
3 Baillenger J (1992), Coprologie parasitaire
et fontionelle, Editeur Arcachon - Bordeau -
France
4 Dagci H, Balcioglu IC, Ertabaklar H, Kurt O, Atambay M (2003), “Effectiveness of
peptone - yeast extract (P - Y) medium in the
cultivation and isolation of Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar in Turkish patients”, Diagn Microbiol Infect Dis, Feb, 45 (2), pp 127 -
30
5 Diamond LS, Cunnick CC (1991), “A
serum - free, partly defined medium, PDM - 805,
for axenic cultivation of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 and other Entamoeba”, J Protozool, May - Jun, 38 (3), pp 211 - 6
Trang 86 Mata - Cardenas BD, Vargas - Villarreal
J, Navarro - Marmolejo L, Said - Fernandez S
(1998), “Axenic cultivation of Trichomonas
vaginalis in a serum - free medium”, J Parasitol,
Jun, 84 (3), pp 638 - 9
7 Mata - Cardenas BD, Vargas - Villarreal
J, Martinez - Rodriguez HG, Said - Fernandez
S (1995), “Entamoeba histolytica axenic growth
improvement by ox bile”, Arch Med Res, 26 (4),
pp 441 - 4
8 Said - Fernandez S, Mata - Cardenas BD
(1992), “Axenic cultivation of Entamoeba
histolytica in suspension”, Trans R Soc Trop Med Hyg, Mar - Apr, 86 (2), pp 173 - 4
Summary
Study on culture technique improvement of routine, standard procedure for maintenance of several parasitic protozoa
Responding to our research purposes of considerable interest in improvement of culture techniques to maintain long time several strains of E histolytica and other parasitic protozoa as material serving for research work and for formation in practice, one study of improved culture techniques has been carried out with result obtained as follows:
1 The Palova culture medium could be applied effectively to maintain long time trophozoites of E histolytica and some other parasitic protozoa
- Optimal proportion of horse serum added into the medium is 10% Optimal quantity of purified rice starch added into medium 5mg/500ml medium
- Optimal pH of culture medium trophozoites should be from 6 to 6.5 and 37 o C should be optimal incubation temperature
2 Three types of media for material samples transport have been applied successfully: sterile 0,85% salin solution, Method of Silard, Method of Gleason can keep trophozoites surviving from 12 hours to 3, 4 days in outside environtment
3 One routine standard culture procedure for E histolytica and other protozoa with 4 steps of performance has been established and introduced to collect 144 material samples and to cultivate successfully 4 strains of
E histolytica, 3 strains of Entamoeba Sp, 3 strains of Entamoeba gingivalis, 2 strains of free - living pathogenic amebae of genera Acanthamoeba, and 4 strains of Trichomonas vaginalis
4 All cultivated protozoa strains mentioned above have been surviving from over 8 months to over two years and at present show continuation of their development.
