Nghiên cứu về phân lân vi sinh hữu cơ

Phân vi sinh vật (phân vi sinh) là sản phẩm chứa các vi sinh vật sống, đã được tuyển chọn có mật độ phù hợp với tiêu chuẩn ban hành, thông qua các hoạt động sống của chúng tạo nên các chất dinh dưỡng mà cây trồng có thể sử dụng được (N,P,K, S, Fe…) hay các hoạt chất sinh học, góp phần nâng cao năng suất hoặc chất lượng nông sản. Phân vi sinh vật phải bảo đảm không gây ảnh hưởng xấu đến người, động, thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản. Mật độ vi sinh vật: Ở Việt Nam mật độ vi sinh vật có ích hay nói cách khác mật độ vi sinh vật sống đã được tuyển chọn chứa trong phân bón vi sinh vật phải đảm bảo từ 108109 vi sinh vậtgam(g) hoặc mililit (ml) phân bón vi sinh vật trên nền cơ chất đã được khử trùng hoặc 105106 vi sinh vậtg hoặc ml phân bón vi sinh vật trên nền cơ chất không vô trùng. Một số giống vi sinh vật đang được sử dụng trong sản xuất phân bón vi sinh vật ở Việt Nam như: + Phân vi sinh vật cố định nitơ là sản phẩm chứa các vi sinh vật sống cộng sinh với cây họ đậu (đậu tương, đậu đen, đậu xanh, lạc…) Acetobacter, Aerobacter, Azospirillum, Azotobacter, Azotomonas, Clostridium, Chlorobidium, Frankia, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodospirillium, Pisolithus hội sinh trên vùng rễ cây trồng cạn hay tự do trong đất, nước có khả năng sử dụng nitơ từ không khí, tổng hợp thành đạm cung cấp cho đất và cây trồng. + Phân vi sinh vật phân giải hợp chất photpho khó tan (phân lân vi sinh) sản xuất từ các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các hợp chất photpho khó tan thành dễ tiêu cho cây trồng sử dụng. Một số giống vi sinh vật khó tan như Achromobacter, Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Serratia… + Phân vi sinh vật kích thích, điều hòa sinh trưởng thực vật có chứa các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học có tác dụng điều hòa hoặc kích thích quá trình trao đổi chất của cây. Một số giống vi sinh vật điều hòa sinh trưởng như Agrobacterium, Anthrobacter, Flavobacterium, VAM. + Phân vi sinh vật chức năng là một dạng của phân bón vi sinh vật, ngoài khả năng tạo nên các chất dinh dưỡng cho đất, cây trồng, còn có thể ức chế, kìm hãm sự phát sinh, phát triển của một số nấm bệnh vùng rễ cho vi khuẩn và vi nấm gây nên. Một số tác nhân ảnh hưởng đến hiệu lực của vi sinh vật như: + Thuốc diệt trừ nấm, trừ sâu: các loại hóa chất xử lý hạt giống, chứa các kim loại nặng như thủy ngân, đồng hay chì đều độc với các vi sinh vật. Do vậy không nên trộn hạt giống đã xử lý hóa chất diệt trừ nấm, trừ sâu với vi sinh vật. Hiện nay chưa có nghiên cứu về ảnh hưởng của thuốc trừ sâu đến sự tồn tại và hoạt tính của vi sinh vật có ích. + Các dinh dưỡng khoáng Đạm: Để phát huy hiệu quả của phân bón vi sinh vật cần thiết phải cân đối được khả năng cung cấp dinh dưỡng của vi sinh vật và nhu cầu của cây trồng. Nếu bón quá nhiều phân khoáng sẽ gây nên lãng phí và ngược lại nếu cung cấp không đủ cây trồng sẽ bị thiếu dinh dưỡng . Do vậy khi sử dụng phân bón vi sinh vật nhất thiết phải tuân thủ theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Phân lân: Vi sinh vật phân giải lân có khả năng khoáng hóa lân hữu cơ hoặc chuyển hóa lân vô cơ khó tan thành lân dễ tiêu cung cấp cho đất và cây trồng, nghĩa là chỉ có tác dụng khi có sẵn nguồn lân vô cơ hoặc hữu cơ trong đất. Do vậy khi bón phân hữu cơ vi sinh có vi sinh vật phân giải lân nên bón thêm lân để tăng hiệu quả. Phân kali: Một số loài vi khuẩn có nhu cầu về kali. Vai trò của kali là tạo áp suất thẩm thấu trong quá trình trao đổi chất của vi khuẩn cũng như trong dịch huyết tương của cây trồng. Cần bón đủ kali theo nhu cầu sinh trưởng và phát triển của cây để cây phát triển tốt và các vi sinh vật hoạt động. Độ chua của đất: Vi sinh vật nói chung đều bị ảnh hưởng bởi độ pH đất, hoạt tính sinh học của chúng sẽ giảm trong điều kiện pH thấp vì tác động trực tiếp của pH thấp đến sự sinh trưởng hoặc trao đổi chất. Đất có pH thấp thường ít các nguyên tố Ca, Mg, P, Mo…và chứa nhiều nguyên tố độc hại với cây trồng như nhôm và mangan. Hiện nay đã nghiên cứu tuyển chọn ra nhiều chủng vi sinh vật có dải pH rộng nên có nhiều phân vi sinh vật có khả năng sử dụng cho mọi loại đất trồng với pH khác nhau. Nhiệt độ: Nhiệt độ đất ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt động sống và quá trình sinh tổng hợp các chất sinh học của vi sinh vật. Dải nhiệt độ tốt nhất đối với các vi sinh vật làm phân bón vi sinh khoảng 25350C. Độ ẩm đất: Độ ẩm đất có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp hoạt chất sinh học của vi sinh vật tồn tại trong đất. Thiếu nước vi khuẩn không di chuyển được, đồng thời cũng không sinh sản được. Thiếu nước ngăn cản sự phát triển của cây ảnh hưởng gián tiếp đến hoạt động của vi sinh vật. Đa số vi sinh vật sống hiếu khí nghĩa là cần ôxy để sinh trưởng phát triển do vậy nước dư thừa sẽ có hại cho quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng. Phèn mặn: Trên vùng đất khô, phèn mặn có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động sống của vi sinh vật. Nồng độ muối cao ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc màng tế bào của vi sinh vật, đồng thời tác động đến quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Hiện nay người ta quan tâm nhiều đến việc tuyển chọn các vi sinh vật chịu được nồng độ cao và kết quả đã tạo được một số loại phân bón vi sinh vật có khả năng thích ứng với độ phèn mặn cao. Vi khuẩn cạnh tranh: Trong đất nhất là ở các vùng trồng chuyên canh đặc biệt là độc canh tồn tại rất nhiều vi sinh vật tự nhiên, các vi sinh vật này cạnh tranh với vi sinh vật hữu hiệu và làm giảm hiệu quả của chúng. Do vậy việc tuyển chọn ra các vi sinh vật có khả năng cạnh tranh cao sử dụng cho sản xuất phân bón vi sinh vật được quan tâm và hiện nay Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam đã tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn đáp ứng yêu cầu cạnh tranh cao.

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CNSH & MT .o0o

BÁO CÁO SEMINAR CÔNG NGHỆ VI SINH VẬT

Chủ đề 2 : ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ VI SINH VẬT TRONG SẢN

XUẤT PHÂN LÂN VI SINH

GVHD : Th.S NGUYỄN THỊ KIM CÚC SVTH : Nhóm 6

Trang 2

Th.S NGUYỄN THỊ KIM CÚC Page 2

MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT 4

LỜI NÓI ĐẦU 5

1 Giới thiệu 6

1.1 Định nghĩa 7

1.2 Phân loại 7

1.2.1 Dựa vào thành phần 7

1.2.2 Dựa vào nguyên liệu 8

1.3 Các loại phân lân vi sinh phổ biến hiện nay 9

2 Các chủng vi sinh vật thường sử dụng 11

3 Cơ chế phân giải 12

3.1 Lân vô cơ 12

3.2 Lân hữu cơ 13

4 Yêu cầu về chất lượng 14

5 Quy trình sản xuất 15

5.1 Đặt vấn đề 15

5.2 Phân lập tuyển chọn 15

5.2.1 Phân lập vi sinh vật có khả năng phân giải lân 15

5.2.2 Kiểm tra đặc điểm sinh hóa 17

5.3 Nuôi cấy thu sinh khối 19

5.3.1 Dựa trên cơ sở các thông số kỹ thuật trong lên men sinh khối vi sinh vật để thu enzyme 20

5.3.2 Cách tiến hành 20

5.3.3 Quy trình thu nhân sinh khối, phương pháp li tâm lắng 22

5.4 Pha trộn tạo sản phẩm phân vi sinh trên nền cơ chất là mụn dừa 23

Trang 3

5.5 Bao gói tạo sản phẩm 24

6 Ứng dụng trong nông nghiệp 24

Trang 4

Trang 5

LỜI NÓI ĐẦU

Với mục đích nâng cao năng suất trong sản xuất Nông Nghiệp và cải thiện môi trường thì sản xuất phân bón vi sinh là một phương án hay và độc đáo Trong đó, phân lân vi sinh đóng chiếm một vai trò quan trọng không kém Trải qua quá trình khảo sát và đã phát hiện ra chủng Bacillus subtilis từ đất có đủ các điều kiện thuận lợi để đưa vào trong quy trình sản xuất phân lân vi sinh giá rẻ hợp với túi tiền người nông dân Mục tiêu đặt ra là sản xuất được 10 tấn phân lân vi sinh đáp ứng nhu cầu người dân vùng Tây Nguyên nước ta Quy trình sản xuất bao gồm phân lập tuyển chọn chủng, nuôi cấy thu sinh khối, pha trộn tạo sản phẩm trên nền

cơ chất là mụn dừa và bao gói tao sản phẩm Nếu quy trình thành công, sản phẩm này sẽ góp phần không nhỏ giúp người dân nâng cao chất lượng cuộc sống và môi trường và đó cũng là điều chúng tôi mong muốn!

Trang 6

Mặt khác, thiên tai và hạn hán cũng làm suy giảm chất lượng đất canh tác Bên cạnh đó, việc khai thác và sử dụng quá mức cũng dẫn tới tình trạng thoái hóa đất nghiêm trọng

Do nhu cầu xã hội ngày càng phát triển yêu cầu con người phải sử dụng nhiều biện pháp để nâng cao năng suất Đồng thời, những hoạt động này cũng gây

ô nhiễm môi trường Đặc biệt, phân bón hóa học được sử dụng và tồn dư với dư lượng lớn trong môi trường

Vậy làm thế nào để trả lại độ phì nhiêu cho đất?

Đó là sử dụng sản phẩm phân hữu cơ vi sinh vật Với khả năng phân giải các chất hữu cơ tạo ra sinh khối dinh dưỡng cho cây trộng.Đồng thời, những sản phẩm này được bán với giá hợp túi tiền của người nông dân Nhờ bón phân vi sinh nên sản phẩm rất an toàn, đất không bị ô nhiễm, tăng chất lượng đất trồng và khả năng hấp thụ dinh dưỡng của cây

Trang 7

Phospho là một trong những yếu tố quan trọng với cây trồng.Chính vì Phospho dễ tiêu trong đất không đáp ứng được nhu cầu của cây trồng có năng suất cao Bón phân lân vi sinh là biện pháp hay nhất để bảo vệ sức khỏe con người và an toàn môi trường

1.1 Định nghĩa

Phân lân vi sinh vật là sản phẩm phân giải các hợp chất photpho khó tan thành dạng dễ tiêu chứa chủng vi sinh vật sống đã được tuyển chọn với mật độ tế bào đạt tiêu chuẩn hiện hành, cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng, tạo điều kiện nâng cao năng suất và chất lượng nông sản Phân lân và các chủng vi sinh vật này không ảnh hưởng xấu đến con người, động thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản

1.2 Phân loại

1.2.1 Dựa vào thành phần

 Phân lân vô cơ: Thường ở trong các dạng khoáng như apatit, phosphoric, phosphat sắt, phosphat nhôm … Muốn cây trồng sử dụng được phải qua chế biến, để trở thành dạng dễ tan

Cũng như các yếu tố khác, Phospho luôn luôn tuần hoàn chuyển hóa.Nhờ VSV lân hữu cơ được vô cơ hóa biến thành muối của axit phosphoric Các dạng lân này một phần được sử dụng, biến thành lân hữu cơ, một phần bị cố định dưới dạng lân khó tan như Ca3(PO4)2, FePO4, AlPO4 Những dạng khó tan này trong những

Trang 8

môi trường có pH thích hợp sẽ chuyển hóa thành dạng dễ tan VSV giữ vai trò quan trọng trong quá trình này

 Phân lân hữu cơ: Các dạng lân thường gặp trong đất là:

- Phytin và các họ hàng: Là muối Ca và Mg của axit phytic Trong đất những chất có họ hàng với phytin là inositol, inositolmonophosphat, inositoltriphosphat Tất cả có nguồn gốc thực vật Phytin chiếm 40 – 80% phospho hữu cơ trong đất

- Axit nucleic và nucleoprotein: Có nguồn gốc từ thực vật và VSV, hàm lượng của chúng trong đất < 10%

- Phospholipit: Sự kết hợp giữa lipit và phosphat không nhiều trong đất Phân lân hữu cơ thường nằm trong các hợp chất hữu cơ có trong xác động vật và thực vật.Tuy nhiên cây trồng không thể hấp thụ được loại phân vô cơ ở dạng hòa tan Đo dó, vi sinh vật trong đất đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình chuyển hóa này

1.2.2 Dựa vào nguyên liệu

 Phân VSV trên nền chất mang không khử trùng Đó là sản phẩm phân VSV, trong đó chất mang sau xử lý được phối trộn trực tiếp với sinh khối VSV

không thông qua khử trùng

 Phân VSV trên nền chất mang khử trùng Sinh khối VSV sau khi lên men được chủng VSV và cho vào chất mang vô trùng theo tỉ lệ 1:1 tạo ra phân

VSV trên nền chất mang vô trùng

Chất mang là chất để VSV trú ngụ và duy trì mật độ trong thời gian từ khi sản xuất đến khi sử dụng Ngoài ra, các yêu cầu về đặc tính vật lý, cảm quan,

Trang 9

chất mang phải đảm bảo không gây ảnh hưởng xấu đến VSV, thực vật và môi trường Loại chất mang thường được sử dụng là than bùn và mụn dừa

1.3 Các loại phân lân vi sinh phổ biến hiện nay

Trên thị trường hiện nay dòng phân lân vi sinh thuần túy rất ít, chủ yếu là phân lân vi sinh hỗn hợp kết hợp giữa các dòng vi sinh vật có khả năng phân giải nitơ, kali, photpho,…

Ví dụ:

Phân hữu cơ vi sinh Triscomix ( lân vi sinh): sản xuất từ nguồn vi sinh vật phân giải lân và cellulose; dùng để hạ phèn, cải tạo đất, hạn chế ngộ độc hữu

cơ, phân giải lân khó tan thành dễ tan, phòng ngừa nấm hại rễ

 Phân lân vi sinh Bio-gro:

Trang 10

 Phân vi sinh Bio-Plant:

- 1ml phân chứa 109 tế bào vi sinh vật bao gồm: VSV cố định đạm, VSV chuyển hóa photpho, VSV chuyển hóa kali, VSV chuyển hóa magiê, canxi, sắt, …

- Vai trò: Tăng dinh dưỡng, cải thiện chất lượng cây trồng, kích thích tăng trưởng, tạo chất kích thích cho sinh trưởng, tăng sức đề kháng với sâu bệnh

Trang 11

 Phân vi sinh siêu đậm đặc Trichomix:

- Hỗn hợp VSV bao gồm: Bacillus subtilis,

Pseudomonas sp, Streptomycess spp

- Vai trò: Phòng ngừa bệnh vàng lá, thối rễ, chạy dây, cây non, thối trái, phân hủy nhanh rơm rạ, hạn chế ngộ độc hữu cơ, phân giải lân, kích thích rễ cây phát triển tốt, dưỡng cây xanh tốt, dùng để ủ phân hữu cơ, phân chuồng, xác bã thực vật, khử mùi chuồng trại, rác thải

2 Các chủng vi sinh vật thường sử dụng

VSV phân hủy Phospho chủ yếu thuộc 2 chi Bacilluss và Pseudomonass

- Bacilluss có các loài phân giải mạnh là: B.megaterium, Serratia,

B.subtilis, Proteus, Arthrobster,…

Trang 12

- Pseudomonas có các loài phân giải mạnh là: Alcaligenes,

Achromobacter, Agrobacterium, Aerobacter, Brevibacterium, Micrococcus, Flavobacterium,…

3 Cơ chế phân giải

3.1 Lân vô cơ

- Sự phân giải Ca3(PO4)2 có liên quan mật thiết với sự sản sinh axit trong quá trình sống của VSV Trong đó axit cacbonic rất quan trọng Chính H2CO3làm cho Ca3(PO4)2 phân giải

- Quá trình phân giải theo phương trình sau:

Ca3(PO4)2 + 4 H2CO3 + H2O  Ca(PO4)2H2O + Ca(HCO3)2

- Trong đất, VK nitrat hóa và VK chuyển hóa S cũng có tác dụng quan trọng trong việc phân giải Ca3(PO4)2

- Điều kiện ngoại cảnh thích hợp để hệ VSV tăng cường phân giải lân:

o Độ pH: 6.5 – 7.0 ảnh hưởng tốt đến sự phát triển của hệ VSV phân giải lân

Trang 13

o Độ ẩm: Lớn, ở những nơi ngập nước, hàm lượng axit hữu cơ cao (do hoạt động của VSV)

o Hợp chất hữu cơ: Hàm lượng hợp chất hữu cơ tươi làm tăng sự sinh trưởng của hệ VSV

o Hệ rễ: Kích thích sự sinh trưởng của VSV và tăng cường giải lân

3.2 Lân hữu cơ

- Nhiều VSV đất có men dephosphorylaza phân giải phytin theo phản ứng sau:

Trang 14

4 Yêu cầu về chất lượng

Theo TCVN của bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn – Viện khoa học

kỹ thuật Nông Nghiệp Việt Nam quy định tiêu chuẩn phân bón vi sinh vật phân giải Phosphate

 Thời gian bảo hành của phân lân vi sinh ít nhất là 6 tháng

 Mật độ vi sinh vật phải phù hợp:

Bảng xác định mật độ vi sinh vật phù hợp

Thông thường một phân bón có chất lượng tốt, có hoạt tính phân giải cao

và có ảnh hưởng tốt đến cây trồng với mật độ từ 108

– 109 tế bào VSV/g hay ml môi trường (đối với chất mang thanh trùng) và 106

tế bào VSV/g hay ml môi trường đối với chất mang không thanh trùng

 Cần kiểm tra chất lượng sản phẩm tạo ra sau mỗi công đoạn để cho được phân lân vi sinh có chất lượng cao

Trang 15

5 Quy trình sản xuất

5.1 Đặt vấn đề

Vi khuẩn B.subtilis có khả năng chuyển hóa lân thành dạng hòa tan cao,

thời gian hình thành vòng phân giải ngắn (3 ngày) Mức độ hòa tan lân là đồng nhất

không có chênh lệch nhiều giữa các chủng Ngoài ra, vi khuẩn B.subtilis cũng

không gây hại cho cây trồng nên có thể sử dụng để sản xuất phân bón

Đây cũng là loài vi khuẩn có vùng phân bố rộng dễ phân lập, dễ dàng nuôi cấy để thu sinh khối, có thể mở rộng quy mô sản xuất từ nhỏ đến lớn và có thể

áp dụng các kĩ thuật hiện đại vào sản xuất Nguồn nguyên liệu lên men đơn giản, dễ tìm, giá thành rẻ giúp tiết kiệm chi phí sản xuất từ đó hạ giá thành sản phẩm

Vì những lí do trên nên nhóm tiến hành tìm hiểu về: “Quy trình sản xuất

phân lân vi sinh từ vi khuẩn Bacillus subtilis”

5.2 Phân lập tuyển chọn

5.2.1 Phân lập vi sinh vật có khả năng phân giải lân

Bước 1: Thu mẫu

Lấy mẫu đất trồng ngô, lúa, đậu tương, mẫu quặng, ở tầng mặt bằng thìa vô trùng, độ sâu từ 2 đến 5cm, lần lấy từ 40 -50g, mỗi khu đất lấy từ 8 – 10 vị trí lấy khác nhau Mẫu đất được đựng trong túi nilon polypropylen đã được khử trùng, ghi nhãn cho từng mẫu và đem đến phòng thí nghiệm tiến hành phân lập

Trang 16

Bước 2: Phân lập vi khuẩn B.subtilis trên môi trường TSA có bổ sung

Ca3(PO4)2

Các mẫu đất lấy ở các vị trí khác nhau được trộn đều Cân mỗi mẫu đất 10g cho vào bình tam giác chứa 99ml nước cất vô trùng lắc thật đều Sau đó pha loãng liên tục từ 10-1

- 10-7Dùng que trang thủy tinh dàn đều dịch vừa nhỏ lên bề mặt thạch sao cho

bề mặt thạch thật khô Các thao tác làm trên ngọn lửa đèn cồn trong tủ box để tránh lây nhiễm vi sinh vật

Nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 25- 300

C từ 3- 5 ngày, vi sinh vật có vòng phân giải Ca3(PO4)2

Cấy truyền vào ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng giữ ở tủ ấm 3- 5 ngày Khi các chủng vi sinh vật đã phát triển kín bề mặt thạch ở ống nghiệm thì đem cất giống vào tủ lạnh ở nhiệt độ 40

C Giữ giống ở 4 -50C trong 2- 3 tháng, 2 tháng cấy truyền 1 lần

Bước 3: Đếm số lượng tế bào

Số lượng tế bào sống trong môi trường dinh dưỡng đặc, được biểu thị bằng đơn vị CFU, 1 CFU là một khuẩn lạc phát triển từ một tế bào ban đầu của một loại vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng mà ta quan sát được

Trang 17

Cách đếm: Tiến hành pha loãng như phương pháp phân lập trên môi trường thạch đĩa Nuôi cây từ 3 - 5 ngày ở 300

C trong tủ ấm, lấy ra đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa Từ đó tính ra số lượng tế bào trong 1g hoặc 1ml cơ chất

5.2.2 Kiểm tra đặc điểm sinh hóa

5.2.2.1 Xác định khả năng phân giải Ca 3 (PO 4 ) 2

- Cấy chấm điểm vi sinh vật đã phân lập trên môi trường thạch Pikovskaya

- Theo dõi khả năng hình thành vòng phân giải của các chủng trong 3 –

7 ngày

- Vi sinh vật có hoạt tính phân giải sẽ tạo thành vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc còn chưa phân giải có màu đục hơn

- Đo đường kính vòng phân giải

- Kết quả khảo sát khả năng phân giải phosphat:

Trang 18

Từ bảng kết quả cho thấy tất cả các chủng vi sinh vật đều có khả năng chuyển hóa Ca3(PO4)2 trên môi trường đặc thành dạng hòa tan Trong đó chủng B14 có đường kính phân giải lớn nhất

Các nghiên cứu cũng cho thấy các nguồn phosphate khác nhau cũng có

ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, phát triển của B.subtilis cũng như mức độ hòa

tan lân của chúng Ca3(PO4)2 là nguồn Phospho được sử dụng tốt nhất Cả hai loại quặng apatide và phososphoride đều không có ảnh hưởng tốt đến khả năng sinh

trưởng của Bacillus, chúng ức chế khả năng sinh trưởng của vi khuẩn do đó làm giảm khả năng phân giải lân

5.2.2.2 Quan sát hình thái và nhuộm Gram và nhuộm bào tử

chủng vi sinh vật thu được

 Nhuộm Gram: Tiến hành nhuộm kép bằng các hóa chất thuốc tím, dung dịch lugol, cồn 700 và fucsin

 Nhuộm bào tử: Nhuộm bằng các hóa chất HCl 1% (hoặc phemnol 5%), fucsin ziel, cồn 330 hay H2SO4, methylene – loeffler

Kết quả: Bào tử bắt màu hồng đỏ, còn vi khuẩn bắt màu xanh

Trang 19

Kết quả cho thấy B.subtilis là chủng vi khuẩn Gram dương, có khả năng

di động, sinh nội bào tử, tế bào sinh dưỡng có dạng hình que

5.3 Nuôi cấy thu sinh khối

Trang 20

5.3.1 Dựa trên cơ sở các thông số kỹ thuật trong lên men sinh khối

vi sinh vật để thu enzyme

- Môi trường lên men cấp 1 : môi trường rỉ đường + 2% tinh bột

Giống gốc chứa Bacillus sbutilis được tăng sinh trong môi trường tăng

sinh có pH = 7 trong 24h có nhiệt độ 37o

C Cho dung dịch này vào môi trường lên men cấp 1 : rỉ đường + tinh bột 2% Với điều kiện các thông số:

- pH = 6,5 – 7,0

- Độ ẩm 60-65%

- Nhiệt độ lên men :30

- Thời gian len men : 36h

Trang 21

o 12 - kết thúc : 350v/phút

Lên men cấp 2

Lượng giống sử dụng môi trường cấp 2 là 10% với:

- Độ ẩm 60-65%, pH = 7

- Nhiệt độ lên men :30

- Thời gian len men : 36h

Trang 22

- Lưu lượng cung cấp khí 0,75% (m 3 khí/ 1m 3 môi trường ) Kết quả

nhân sinh khối phương pháp lên men chìm đạt 108

-109 CFU/ml sau 36- 48h lên

men cho cả 2 môi trường lên men

5.3.3 Quy trình thu nhân sinh khối, phương pháp li tâm lắng

Dịch lên men sau khi được nhân sinh khối trên thiết bị lên men chìm được đưa vào máy li tâm liên tục (separator) để tách nước tự do Vận tốc li tâm ban đầu 15000 vòng/phút sau đó tăng từ từ 20000vòng/ phút Sau đó sấy khô rồi phối trộn với các hợp chất hữu cơ

Thiết bị sấy thu sinh khối

Đánh giá chất lượng

Sinh khối sau khi thu được, chúng ta tiến hành xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo OD Nếu mật độ tế bào đạt 108 – 109 tế bào VSV/g hay ml

Định dạng
Số trang	29
Dung lượng	1,08 MB