THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH NHẬN DẠNG 10 týp KHÁNG NGUYÊN PHẾ cầu TRONG vắc XIN SYNFLORIX™

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ──────*****────── LÊ THỊ HÒA THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH NHẬN DẠNG 10 TÝP KHÁNG NGUYÊN PHẾ CẦU TRONG VẮC XIN SYNFLORIX™ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ──────*****────── LÊ THỊ HÒA THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH NHẬN DẠNG 10 TÝP KHÁNG NGUYÊN PHẾ CẦU TRONG VẮC XIN SYNFLORIX™ Chuyên ngành : Động vật học (Vi sinh vật học) Mã số : 60420103 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Văn Hùng Hà Nội - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận văn “Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu vắc xin Synflorix™” công trình nghiên cứu cá nhân thực hướng dẫn TS Phạm Văn Hùng Các nội dung nghiên cứu kết trình bày luận văn trung thực rõ ràng Hà Nội, ngày 29/10/2015 Học viên Lê Thị Hòa LỜI CẢM ƠN Lời xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn: TS Phạm Văn Hùng, Phó viện trưởng Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế tận tình hướng dẫn truyền dạy nhiều kiến thức quý báu đồng thời động viên tạo điều kiện thuận lợi cho trình nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo đồng nghiệp Viện Sinh Thái Tài Nguyên Sinh Vật-Viện Hàn Lâm Khoa học Công Nghệ Việt Nam giúp đỡ, chia sẻ truyền đạt cho nhiều kiến thức bổ ích trình học tập Viện Tôi xin chân thành cảm ơn tới anh, chị đồng nghiệp Khoa Quản lý chất lượng Viện kiểm định quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế động viên, chia sẻ hỗ trợ công việc để có điều kiện học tập thực tốt đề tài nghiên cứu luận văn Nhân dịp xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ban Lãnh đạo Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế, Ths Lưu Anh Thư đồng nghiệp Khoa Kiểm định vắc xin Vi khuẩn, phòng Tổ chức cán bộ, phòng Khoa học Đào tạo hỗ trợ tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập, làm việc để hoàn thành luận văn Đặc biệt, xin dành những tình cảm thân thương gửi tới gia đình tôi, những người bên tôi, ủng hộ, động viên suốt trình học tập hoàn thành luận văn Xin trân trọng cảm ơn ! Học viên Lê Thị Hòa DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt BSA Bovine Serum Albumin Huyết bào thai bê CV Coefficient Variation Hệ số biến thiên DT Diphtheria toxoid Giải độc tố Bạch Hầu ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Phương pháp miễn dịch gắn assay Enzyme EU European Union Liên hiệp Châu âu GMP Good Manufacturing Practice Thực hành sản xuất tốt GSK Glaxo Smith Kline International Conference on Hiệp hội quốc tế về hài hòa ICH IEC ISO IU Harmonization International Electrotechnical Commission International Organization for Standardization Internationnal Unit kỹ thuật về Dược phẩm Ủy ban kỹ thuật điện quốc tế Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế Đơn vị quốc tế KKT Kháng kháng thể KN Kháng nguyên KT Kháng thể LAL Limulusamoebocyte lysate LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng OD Optic density Pneumococcal Polysaccharide Độ hấp thu mẫu thử PCV vaccine PD PPV Pneumococcal polysaccharide Vắc xin phế cầu cộng hợp Protein D Vắc xin phế cầu polysaccharide PS vaccine Polysaccharide SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SOP Standard Operating Procedure Qui trình chuẩn National Institute for Control of Viện kiểm định quốc gia vắc NICVB Vaccine and Biologicals xin sinh phẩm y tế NTHi Non-typeable H influenzae TB Haemophilus influenza không định týp Giá trị trung bình TMB Tetramethylbenzidine Cơ chất TRS Technical Report Series Báo cáo kỹ thuật TT Tetanus toxoid Giải độc tố uốn ván TTB Trang thiết bị WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới USP United States of Pharmacopeia Dược điển Mỹ MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Phế cầu khuẩn số bệnh gây phế cầu khuẩn .4 1.1.1 Phế cầu khuẩn .4 1.1.2 Một số bệnh gây phế cầu khuẩn 1.2 Vắc xin phế cầu vắc xin Synflorix™ .7 1.2.1 Vắc xin phế cầu .7 1.2.2 Vắc xin Synflorix™ 10 1.3 Phương pháp phân tích miễn dịch sử dụng emzym đánh dấu (ELISA) 15 1.3.1 Nguyên lý chung 15 1.3.2 Một số phương pháp ELISA 15 1.4 Thẩm định quy trình 18 1.4.1 Định nghĩa thẩm định quy trình 18 1.4.2 Phân loại thẩm định quy trình .19 1.4.3 Các thông số thẩm định quy trình 23 1.5 Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu vắc xin SynflorixTM phương pháp ELISA 26 1.5.1.Quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu vắc xin SynflorixTM phương pháp ELISA .26 1.5.2 Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu vắc xin SynflorixTM phương pháp ELISA 29 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .31 2.1 Đối tượng nghiên cứu 31 2.2 Vật liệu nghiên cứu 31 2.3 Phương pháp nghiên cứu 32 2.3.1 Thiết kế thử nghiệm .32 2.3.2 Cỡ mẫu 33 2.3.3 Xây dựng quy trình thẩm định cho thông số tiêu chuẩn chấp thuận thông số cần thẩm định 33 CHƯƠNG KẾT QUẢ 36 3.1 Giới hạn phát .36 3.2 Độ mạnh .43 3.3 Độ đặc hiệu 47 CHƯƠNG BÀN LUẬN 58 4.1 Giới hạn phát .58 4.2 Độ mạnh .59 4.3 Độ đặc hiệu 59 KẾT LUẬN 61 KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 66 PHỤ LỤC .66 DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Thành phần týp kháng nguyên phế cầu vắc xin Synflorix™ 11 Bảng 1.2 Các thông số dùng thẩm định toàn phần .20 Bảng 1.3 Các thông số dùng thẩm định phần 21 Bảng 1.4 Các thông số dùng tái thẩm định 21 Bảng 1.5 Các thông số dùng thẩm định 26 Bảng 2.1 Mẫu chuẩn, hóa chất sử dụng cho thí nghiệm 31 Bảng 2.2 Dụng cụ, thiết bị sử dụng cho thí nghiệm 32 Bảng 3.1 Giới hạn phát thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp qua lần thử nghiệm 36 Bảng 3.2 Giới hạn phát thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp qua lần thử nghiệm 37 Bảng 3.3 Giới hạn phát thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 7F qua lần thử nghiệm .37 Bảng 3.4 Giới hạn phát thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 14 qua lần thử nghiệm .38 Bảng 3.5 Giới hạn phát thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 19F qua lần thử nghiệm .39 Bảng 3.6 Giới hạn phát thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp qua lần thử nghiệm 39 Bảng 3.7 Giới hạn phát thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 9V qua lần thử nghiệm 40 Bảng 3.8 Giới hạn phát thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 18C qua lần thử nghiệm 40 Bảng 3.9 Giới hạn phát thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 6B qua lần thử nghiệm 41 Bảng 3.10 Giới hạn phát thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 23F qua lần thử nghiệm .43 Bảng 3.11 Kết lần thử nghiệm nhận dạng 10 kháng nguyên phế cầu 44 Bảng 3.12 Kết lần thử nghiệm nhận dạng 10 kháng nguyên người thực 46 Bảng 3.13 Kết lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp mẫu thử 48 Bảng 3.14 Kết lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp mẫu thử 49 Bảng 3.15 Kết lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 7F mẫu thử .49 Bảng 3.16 Kết lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 14 mẫu thử 50 Bảng 3.17 Kết lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 19F mẫu thử .52 Bảng 3.18 Kết lần thử nghiệm nhận dạng týp mẫu thử 52 Bảng 3.19 Kết lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 9V mẫu thử .53 Bảng 3.20 Kết lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 18C mẫu thử .54 Bảng 3.21 Kết lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 6B mẫu thử .55 Bảng 3.22 Kết lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 23F mẫu thử .57 Bảng Giới hạn phát týp kháng nguyên phế cầu .58 Bảng 3.22 Kết lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 23F mẫu thử Lần thử nghiệm Mẫu Kết Cut- thử off Lần thử nghiệm Mẫu Kết thử Cut- Lần thử nghiệm Mẫu Kết off thử Cutoff Lần thử nghiệm Mẫu Kết thử Cutoff Lần thử nghiệm Mẫu Kết thử Cutoff Lần thử nghiệm Mẫu Kết thử Cutoff 0.978 0.192 0.967 0.216 1.068 0.168 1.077 0.216 1.057 0.186 1.034 0.210 0.989 0.162 0.968 0.174 0.989 0.150 0.934 0.144 1.046 0.150 0.984 0.156 0.009 0.024 0.003 0.018 0.003 0.016 0.003 0.024 0.006 0.018 0.005 0.012 So sánh kết nhận dạng kháng nguyên týp 23F mẫu thử với giá trị cut-off lần thử nghiệm bảng 3.22 cho thấy: + Mẫu thử 1: Vắc xin Synflorix™ dương tính với kháng nguyên týp 23F + Mẫu thử 2: Vắc xin thương hàn Vi (Typhim Vi) lô số L0035-2 thêm vào vắc xin Synflorix™ theo tỉ lệ 1:1, dương tính kháng nguyên týp 23F + Mẫu thử 3: Vắc xin thương hàn Vi (Typhim Vi) lô số L0035-2, âm tính với kháng nguyên týp 23F 57 CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Giới hạn phát Giới hạn phát là lượng nhỏ mẫu phân tích xác định không định lượng giá trị xác Áp dụng nghiên cứu này, giới hạn phát quy trình độ pha loãng lớn mẫu thử mà phản ứng còn dương tính Trong nghiên cứu này, dựa vào giá trị OD thu độ lặp lại, tiến hành pha loãng bậc 10 týp kháng nguyên phế cầu Kết giới hạn phát thể bảng 4.1 Bảng Giới hạn phát týp kháng nguyên phế cầu STT Týp kháng nguyên phế cầu Giới hạn phát (độ pha loãng) Týp 1/80 Týp 1/320 Týp 1/640 Týp 6B 1/80 Týp 7F 1/40 Týp 9V 1/320 Týp 14 1/80 Týp 18C 1/40 Týp 19F 1/320 10 Týp 23F 1/80 Giới hạn phát týp kháng nguyên phế cầu nằm khoảng từ độ pha loãng 1/40 đến 1/640 Như vậy, khả phát kháng nguyên quy trình cao có khác về giới hạn phát giữa týp kháng nguyên Sở dĩ có khác giữa giới hạn phát 58 týp kháng nguyên hàm lượng kháng nguyên giữa týp vắc xin thành phẩm khác sản phẩm tạo thành phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể không bị rửa trôi quy trình kháng nguyên khác 4.2 Độ mạnh Độ mạnh quy trình thể qua việc đánh giá độ lặp lại, độ xác trung gian điều kiện hay thay đổi điều kiện thử nghiệm mẫu thử, quy trình đều cho kết Với độ lặp lại, người tiến hành lần thử nghiệm lô vắc xin Synflorix™ Kết lần thử nghiệm nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu: 1, 4, 7F, 14, 19F, 5, 9V, 6B, 18C 23F đều cho kết dương tính (bảng 3.12) Kết lần thử nghiệm ổn định nằm khoảng TB ± 2SD tương ứng với khoảng tin cậy 95% Để xác định độ xác trung gian, thiết kế có thay đổi về thời gian người thực Nghiên cứu thực lần thử nghiệm người mẫu vắc xin ngày khác So sánh kết quả, người thực khác nhau, thời gian tiến hành khác kết đều dương tính với kháng nguyên phế cầu Kết người thực phân tích phần mềm phân tích thống kê SPSS kháng nguyên phế cầu khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0.05) Do đó, kết thử nghiệm Như vậy, với quy trình, hai người thử nghiệm khác cho kết lặp lại lần thử nghiệm người thực cho kết tương đương (dương tính), quy trình nhận dạng đạt độ mạnh 4.3 Độ đặc hiệu 59 Để đánh giá độ đặc hiệu (khả xác định chất cần tìm có mẫu thử có mặt thành phần khác: tá dược, tạp chất,…), nhóm nghiên cứu sử dụng mẫu trắng (mẫu không chứa 10 týp kháng nguyên phế cầu mẫu vắc xin thương hàn Vi - Typhim Vi), mẫu thêm (thêm lượng 10 týp kháng nguyên phế cầu biết vào vắc xin thương hàn - Typhim vi có chất với kháng nguyên phế cầu polysaccharide) mẫu có chứa 10 týp kháng nguyên phế cầu (vắc xin Synflorix™) Kết bảng từ 3.13 đến 3.22 cho thấy, mẫu trắng mặt 10 kháng nguyên phế cầu týp 1, 4, 7F, 14, 19F, 5, 9V, 6B, 18C 23F; mẫu thêm mẫu Synflorix™ đều dương tính với 10 týp kháng nguyên phế cầu; Mặt khác kết OD thu mẫu thêm mẫu Synflorix™ tương đương nhau, tức có kháng nguyên phế cầu tham gia phản ứng kết hợp đặc hiệu với kháng thể tương ứng Như vậy, quy trình thử nghiệm cho kết dương tính có mặt chất cần nhận dạng, có lẫn thành phần khác âm tính mặt chất cần nhận dạng; điều cho thấy quy trình nhận dạng 10 kháng nguyên phế cầu đạt độ đặc hiệu 60 KẾT LUẬN Quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu vắc xin Synflorix™ đạt: Giới hạn phát Giới hạn phát kháng nguyên phế cầu nằm khoảng từ độ pha loãng 1/40 đến 1/640 Độ mạnh thử nghiệm Quy trình đạt độ mạnh thay đổi điều kiện thực quy trình, giống thực thử nghiệm thường quy Các kết thu sau những thay đổi đều khác biệt có ý nghĩa thống kê Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu quy trình đánh giá thông qua việc nhận dạng kháng nguyên phế cầu mẫu có chứa nhiều thành phần khác nhau, đều cho kết dương tính 61 KIẾN NGHỊ Quy trình “nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu vắc xin Synflorix™” đạt yêu cầu về giới hạn phát hiện, độ mạnh, độ đặc hiệu theo tiêu chuẩn WHO Đề nghị sử dụng quy trình để kiểm tra nhận dạng vắc xin Synflorix™ Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Bộ môn Vi sinh y học - trường Đại học Y Hà Nội (2007),“Vi sinh y học”, nhà xuất Y học, Hà nội, tr 160-163 [2] Bộ Y tế (2009), "Dược điển Việt Nam IV", nhà xuất Y học, Hà Nội, mục 15.11.Phụ lục 323 [3] Đặng Đức Hậu (2008), “Xác xuất thống kê”, nhà xuất giáo dục, y tế, tr 80-89, 141-143 [4] Hoàng Thanh Dương (2009), “Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp”, văn phòng Công nhận chất lượng, Tổng cục Tiêu chuẩn đo lường chất lượng [5] Học viện quân y (1992),“Vi sinh vật học”, nhà xuất giáo dục đào tạo chuyên nghiệp, Hà nội, tr 242-243 [6] Học viện quân y (2008),“Vi sinh vật y học”, nhà xuất Quân đội nhân dân, tr 96 [7] Học viện quân y (1999), “Bệnh học truyền nhiễm”, nhà xuất y học, Hà nội, tr.15-17 [8] Lê Văn Hiệp (2006), “Vắc xin học vấn đề bản”, nhà xuất y học [9] tr 286 Lê Văn Phủng (2009), “Vi khuẩn y học”, nhà xuất Giáo dục Việt Nam tr 33-37 [10] Nguyễn Lê Huyền Trang (2014), “Hướng dẫn thầm định thử nghiệm”, tài liệu nội Viện kiểm định quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế [11] Viện Kiểm định quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế ( 2014), “Bộ tiêu chuẩn xuất xưởng vắc xin- sinh phẩm”,tài liệu lưu hành nội bộ, tr.150 – 155 [12] Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), “Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật”, nhà xuất khoa học kỹ thuật, tr.10-59 Tài liệu tiếng anh [13] Anh DD, Kilgore PE, Slack MP, Nyambat B, le Tho H, Yoshida LM, Nguyen HA, Nguyen CD, Chong CY, Nguyen D, Ariyoshi K, Clemens JD, Jodar L (2009), “Surveillance of pneumococcal-associated disease among hospitalized children in Khanh Hoa Province, Vietnam”, Clin Infect Dis, 48:57–64 [14] Black RE, Cousens S, Johnson HL, Lawn JE, Rudan I, Bassani DG, Jha P, Campbell H, Walker CF, Cibulskis R, Eisele T, Liu L, Mathers C (2010), “Global, regional, and national causes of child mortality in 2008: a systematic analysis”, Lancet, 375:1969–1987 [15] Bogaert D, Ha NT, Sluijter M, Lemmens N, De Groot R, Hermans PW (2002), “Molecular epidemiology of pneumococcal carriage among children with upper respiratory tract infections in Hanoi, Vietnam”, J Clin Microbiol, 40:3903–3908 [16] Chung Keel Lee (2011), “Validation system and inspection”, WHO global Learning Opptunities for vaccine quanlity, KFDA [17] European Medicines Agency (2009), “Assessment report for Synflorix”, London, UK [18] GAVI Alliance (2013), “Pneumococcal disease”, GAVI Factsheet, Geneva [19] Guidelines for Independent Lot Release of Vaccines by Regulatory Authorities, World Health Organization, 2010 [20] ICH Q2A (1995),“Guidline for validation of analytical methods: definitions and terminology”,CPMP/ICH/381/95, The International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, London, UK [21] ICH Q2B,(1995), “Guidline for validation of analytical procedures: methodology”, CPMP/ICH/381/95, The International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use , London, UK [22] Kim SH, Song JH, Chung DR, Thamlikikul V, Yang Y, Wang H, Lu M, So TM, Hsueh PR, Yasin RM, Carlos CC, Pham HV, Lalitha MK, Shimono N, Perera J, Shibl AM, Baek JY, Kang CI, Ko KS, Peck KR (2012), “Changing trend of antimicrobial resistance and serotypes in Streptococcus pneumoniae in Asian countries: an ANSORP study”, Antimicrob Agents Chemother, 56:1418-1425 [23] Lin T Z Summary of invasive pneumococcal disease burden among children in the Asia-Pacic region Vaccine 28 (2010), pp7589–7605 [24] Lonneke Levels (2010), "Method validation, part one" Nederlands Vaccin Institute (NVI) [25] Teeranart Jivapaisarnpong (2006), "Validation of bioassay" Training course on quality control of vaccines used in EPI, Ha Noi [26] Summary Protocol for Synflorix™ vaccine (2010), GSK [27] USP (2013), “Validation and Verification of Analytical procedures” Training course, Hà nội pp 3-7 [28] WHO (1992), "Good manufacturing practices for biological products WHO expert committee on biological standardization" Technical Report Series No.822, forty - second Report [29] WHO (1997),“ Part 2: validation,WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirement”, Geneva [30] WHO-TRS No 927 Annex (2005), “Recommendation for production and control of pneumococcal conjugate vaccines”, pp72-84 [31] Whale walker (2008), “The ELISA guide book”, 2nd edition, Humana Press, New York, USA [32] WHO (1997), “Manual of laboratory methods” For testing of vaccines used in the WHO Expanded programe on Immunization, pp 72-86 [33] WHO (2001), “Part 2: Validation”, A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements, pp.63 - 85 [34] WHO (2004), “Part 2: Validation”, A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements, pp.63 - 87 [35] WHO (2006), “Validation” Supplementary guidelines on good manufacturing practice (GMP) Technical report series, No 937, annex 4, pp 107-119 [36] WHO (2000), “Supplementary information on vaccine safety”, departmnet of vaccines and biologys, pp75 [37] WHO in- country workshop on analytical method validation, 17 February 2014, Ha Noi –Viet Nam [38] WHO position paper-Wkly Epidemiol Dec 2012, 87 (14): 129-144 [39] Yeowon Sohn (2011), “Analytical method validation of bioassay” Training course on quanlity control of vaccines used in EPI, Ha Noi Các trang Web [40] Http://niheold.nihe.org.vn/new-vn/thuong-quy-va-huong-dan-kythuat/954/Qui-trinh-nuoi-cay-phan-lap-vi-khuan-Streptococcuspneumoniae.vhtm [41] Http://www.historyofvaccines.org/content/timelines/Pneumococcal [42] Http://www.phoiviet.com/benh-tiem-ngua-phe-cau [43] Http://www.nihe.org.vn/new-vn/thuong-quy-va-huong-dan-kythuat/147/phe-cau-khuan-spneumoniae.vhtm PHỤ LỤC PHỤ LỤC CÁCH PHA LOÃNG KHÁNG THỂ Kháng thể Độ pha Công thức pha kháng týp 7F 14 loãng 1/100 40µl dung dịch mẹ + 3960µl dung dịch post-coating - Dung dịch 1: 10µl dung dịch mẹ + 490µl dung dịch post-coating (1/50) 19F 1/5000 - Dung dịch 2: 50µl dung dịch + 4950µl dung dịch post-coating (1/100) - Dung dịch 1: 10µl dung dịch mẹ + 990µl dung dịch post-coating (1/100) - Dung dịch 2: 50µl dung dịch + 4950µl dung dịch 1/150000 post-coating (1/100) 9V 18C - Dung dịch 3: 350µl dung dịch + 4900µl dung dịch post-coating (1/15) 1/250000 - Dung dịch 1: 10µl dung dịch mẹ + 990µl dung dịch post-coating (1/100) - Dung dịch 2: 50µl dung dịch + 4950µl dung dịch post-coating (1/100) - Dung dịch 3: 200µl dung dịch + 4800µl dung dịch 6B 1/50 post-coating (1/25) 50µl dung dịch mẹ + 2450µl dung dịch post-coating 23F PHỤ LỤC CÔNG THỨC PHA DUNG DỊCH RỬA VÀ HẬU PHỦ PHIẾN Pha dung dịch rửa: Tên hóa chất NaCl KH2PO4 Na2HPO4 Công thức 8.0g 0.2g 1.15g KCl Tween 20 Nước cất lần 0.2g 1ml Vừa đủ 100ml Pha dung dịch hậu phủ phiến PBS Tween 20 – BSA 1%: Tên hóa chất BSA Dung dịch rửa Công thức 1g 100ml Chú ý: Sử dụng không tháng kể từ ngày pha chế PHỤ LỤC CÔNG THỨC PHA DUNG DỊCH DỪNG PHẢN ỨNG Tên hóa chất H2SO4 98% Nước cất lần Công thức 2.717ml Vừa đủ 100ml Chú ý: Sử dụng không tháng kể từ ngày pha chế PHỤ LỤC CÔNG THỨC PHA DUNG DỊCH ĐỆM CARBONATE 0,05M a b Pha dung dịch đệm carbonate 0,2M: Tên hóa chất Công thức Natri bicarbonate 1.172g Natri carbonate 0,636g Nước cất lần Vừa đủ 100ml Pha dung dịch đệm carbonate 0,05M: Tên hóa chất Dung dịch đệm carbonate 0,2M Nước cất lần Công thức 25ml 75ml Chú ý: Sử dụng không tháng kể từ ngày pha chế PHỤ LỤC CÔNG THỨC PHA DUNG DỊCH CỘNG HỢP - Dung dịch 1: Tên hóa chất Dung dịch hậu phủ phiến (post-coating) Dung dịch Protein A – peroxidase - Công thức 980 µl 20µl Dung dịch 2: Tên hóa chất Dung dịch hậu phủ phiến (post-coating) Dung dịch Chú ý: Dung dịch dùng sau pha Công thức 9.1ml 15ml [...]... mạnh của quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™ 2 Đánh giá độ đặc hiệu của quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™ 3 Giới hạn phát hiện của quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™ 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Phế cầu khuẩn và một số bệnh gây bởi phế cầu khuẩn 1.1.1 Phế cầu khuẩn Hình thái: Phế cầu- Streptococcus... xin Synflorix™ chưa được thẩm định và chưa được xác nhận giá trị sử dụng theo tiêu chuẩn của ISO 17025, theo tổ chức Y tế thế giới Chính vì vậy, với mục đích sử dụng quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên chứa trong vắc xin Synflorix™ áp dụng tại phòng kiểm định của NICVB Chúng tôi tiến hành đề tài Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™ 2 Với mục tiêu... vắc xin Synflorix™ Tại Việt Nam, Synflorix™ là vắc xin được nhập khẩu từ nhà sản xuất GSK Để đảm bảo tính an toàn cho người sử dụng, việc đảm bảo chất lượng vắc xin là rất quan trọng Quy trình kiểm định chất lượng vắc xin gồm rất nhiều chỉ tiêu, trong đó thử nghiệm nhận dạng là một trong những chỉ tiêu quan trọng; Tuy nhiên thử nghiệm nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™. .. khác nhau 10 Bảng 1 1 Thành phần týp kháng nguyên phế cầu của vắc xin Synflorix™ Týp kháng nguyên phế cầu cộng hợp Hàm lượng của với protein mang từng týp (μg/ml) 1 Týp 1 cộng hợp với PD 1,0 2 Týp 4 cộng hợp với PD 3,0 3 Týp 5 cộng hợp với PD 1,0 4 Týp 6B cộng hợp với PD 1,0 5 Týp 7F cộng hợp với PD 1,0 6 Týp 9V cộng hợp với PD 1,0 7 Týp 14 cộng hợp với PD 1,0 8 Týp 18C cộng hợp với TT 3,0 9 Týp 19F... Phân loại thẩm định quy trình Có 03 loại thẩm định quy trình [10] ,[16],[20],[21],[37]: Thẩm định toàn phần: là xem xét và đánh giá một cách khoa học tất cả các thông số quy định cho quy trình này Loại thẩm định này được áp dụng khi: + Quy trình thực hiện theo phương pháp thử nội bộ hoặc phương pháp cũ nhưng có một số thay đổi + Phát hiện sự không ổn định của quy trình đã phê duyệt + Quy trình có thay... vắc xin thế hệ sau được sử dụng từ năm 2009 là Synflorix™ gồm 10 týp kháng nguyên (1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 23F) và Prevnar 13 gồm 13 týp kháng nguyên (1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, and 23F) [17],[18] 9 1.2.2 Vắc xin Synflorix™ 1.2.2.1 Đặc điểm vắc xin Synflorix™ Vắc xin Synflorix là vắc xin phế cầu cộng hợp, hấp phụ, gồm các vỏ polysaccharide (PS) của 10 týp kháng nguyên. .. với nó Kháng nguyên cạnh tranh càng hiện diện nhiều thì kháng nguyên cần xác định trong mẫu càng ít và ngược lại [31] 1.4 Thẩm định quy trình 1.4.1 Định nghĩa thẩm định quy trình Theo Dược điển Mỹ (USP): Thẩm định là quá trình phân tích bằng các phương pháp thiết lập phù hợp trong phòng thí nghiệm, quá trình phân tích này đòi hỏi phải tuân theo mục đích mong muốn đặt ra [27] Có rất nhiều định nghĩa... giới hạn định lượng, độ mạnh phù hợp với từng phương pháp [32],[33], [35] Việc thẩm định quy trình làm nhằm chứng minh quy trình đó có phù hợp với mục đích sử dụng hay không Thẩm định quy trình được tiến hành 18 khi: áp dụng một quy trình mới, áp dụng các quy trình có trong Dược điển, hoặc nếu có thay đổi lớn về quy trình thử nghiệm (thay đổi dụng cụ, trang thiết bị, công thức hoặc quy trình thực... phối trộn các týp với nhau sau đó thêm các tá dược và sản xuất thành vắc xin thành phẩm, sau khi sản xuất xong điều quan trọng mà ta cần quan tâm đến đầu tiên đó chính là xem trong vắc xin có chứa 10 týp kháng nguyên của phế cầu khuẩn hay không Do đó, việc kiểm tra nhận dạng kháng nguyên trong vắc xin synflorix™ phải được thực hiện trong từng loạt sản xuất và ở từng công đoạn (từ nguyên liệu đầu... đã được sử dụng ở một số nước bằng vắc xin polysaccharide của vỏ phế cầu Trên thế giới, có rất nhiều sản phẩm thương mại vắc xin phòng bệnh gây ra bởi phế cầu: Synflorix™ (GSK), Pneumo 23 (Sanofi Pasteur), Prevenar (Phzer) [18] Có 2 loại vắc xin phế cầu: vắc xin vỏ polysaccharide phế cầu và vắc xin phế cầu cộng hợp [18] Vắc xin vỏ polysaccharide phế cầu (PPV – Pneumococcal polysaccharide ... mạnh quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu vắc xin Synflorix™ Đánh giá độ đặc hiệu quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu vắc xin Synflorix™ Giới hạn phát quy trình nhận dạng 10. .. dụng quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên chứa vắc xin Synflorix™ áp dụng phòng kiểm định NICVB Chúng tiến hành đề tài Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu vắc xin Synflorix™ ... 23 1.5 Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu vắc xin SynflorixTM phương pháp ELISA 26 1.5.1 .Quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu vắc xin SynflorixTM phương