Báo cáo thực hành công nghệ lên men mt

Báo cáo thực hành công nghệ lên men mt

Bài 1: Lý thuyết chung

ĐỘNG HỌC LÊN MEN THU SINH KHỐI VÀ QUY TRÌNH CHUNG SẢN

XUẤT CHẾ PHẨM SINH KHỐI.

1 Động học lên men thu sinh khối:

1.1 Phương pháp nuôi cấy sản xuất sinh khối

- Nuôi cấy theo mẻ

- Nuôi cấy liên tục

- Nuôi cấy theo mẻ tiếp liệu liên tục

1.2 Phương trình động học nuôi cấy theo mẻ

X= x 0 e µt ; N= N 0 e µt ; OD= OD 0 e µt

- Xác định x bằng phương pháp khối lượng

- Xác định N bằng phương pháp đổ/trải đĩa nếm khuẩn lạc

- Xác định OD bằng phương pháp đo độ đục

Hình 1.1.Đo OD canh trường bằng spectrophotometer

A) Mẫu trắng: môi trường trong suốt, cường độ ánh sáng đến được tế bào quang điện được coi là cường độ lớn nhất và OD được chỉnh về 0 ở bước sóng đo (thường 600 – 610 nm).

B) Khi trong cuvette có vi khuẩn, một phần ánh sáng bị phân tán và không đến được tế bào quang điện, OD>0

Chú ý: Chỉ đo OD trực tiếp nếu môi trường dinh dưỡng không màu hoặc màu nhạt Khi môi trường có màu nâu phải ly tâm mẫu, sử dụng môi

trường trong suốt hoặc nước muối sinh lý để đưa về thể tích ban đầu và làmmẫu sáng

Đối với một số VSV, OD chỉ tuyến tính với nồng độ tế bào khi nồng độ này thấp vì vậy chỉ nên nhận giá trị khi OD <=0.4 Với mẫu có OD>0.4 thì nên pha loãng 2 lần

Hình 1.2 Tương tác giữa giá trị OD và nồng độ tế bào

Ví dụ: OD <0,4 ;OD = 0,270

Pha loãng mẫu 2 lần (1 ml mẫu + 1ml môi trường tiệt trùng): OD = 0,135

OD hc (OD hiệu chỉnh) = OD * n = 0.135*2= 0.270

OD>0,4 ; OD = 0.540

Pha loãng mẫu 2 lần(1 ml mẫu + 1ml môi trường tiệt trùng): OD = 0.288

OD hc (OD hiệu chỉnh) = OD * n = 0.288*2 = 0.576

1.3 Đường cong tăng trưởng vi sinh vật

Vẽ đường cong tăng trưởng nhằm xác định các thông số động học nuôi cấy:Động học tăng trưởng (x(t), N(t) hoặc OD(t) đường cong (hàm mũ e)

Tuyến tính hóa bằng cách lấy logx, logN hoặc logOD

Hình 1.3 Tuyến tính hóa đường cong tăng trưởng bằng cách vẽ đồ thị logx, logN, logOD theo t

Để có được đường cong tăng tưởng cần thực hiện đo OD như bảng sau:

Thời

điểm

Thời gian (min)

loãng

OD pha loãng

Hình 1.4 Đường cong tăng trưởng VSV trong nuôi cấy theo mẻ (logOD theo t)

1.4 Các thông số từ đường cong tăng trưởng

- tlag, t log

- μ = [ln(OD/ODo)]/(t-to)=log(OD/ODo)/[loge*(t-to)]ln(OD/ODo)]/(t-to)=log(OD/ODo)/[ln(OD/ODo)]/(t-to)=log(OD/ODo)/[loge*(t-to)]loge*(t-to)]

=(logOD-logODo)/0.434(t-to)= 2.303(logOD-logODo)/(t-to)

- μmax

- t d = thời gian thế hệ = 2.303*log2/μmax = 0.69/μmax

- Để xác định năng suất sinh khối:

Năng suất R = (Xf-Xo)/(tf-to)

Cần xác định Xf, Xo hoặc Nf, N0

Muốn vậy cần thiết lập đường chuẩn tế bào

1.5 Đường chuẩn tế bào: tương quan tuyến tính giữa OD (OD<=0.4) và

nồng độ tế bào

Nồng độ tế bào xác định bằng phương pháp khối lượng, đếm trực tiếp hoặc đếmkhuẩn lạc

1.6 Hiệu suất

Để xác định hệ số kinh tế (hiệu suất sử dụng cơ chất để tổng hợp sinh khối) YX/S

Y = x/s = (X f -X o )/(S o -S)

Quy trình chung sản xuất sinh khối

Hình 1.5 Quy trình chung sản xuất sinh khối

Đĩa Petri

(khuẩn lạc đặc trưng trên môi

trường giữ giống)

Chuẩn bị môi trường lên men

(môi trường nhân giống)

Lên men thu sinh khối

(t,oxy, lấy mẫu, thời gian)

1.7 Chuẩn bị môi trường

Chú ý trong nhiều trường hợp có sự khác biệt giữa môi trường giữ giống thạch nghiêng, môi trường nhân giống và môi trường lên men chính

Trong quá trình pha tránh hiện tượng tạo kết tủa khi tiệt trùng hoặc phản ứng Maillard, một số trường hợp nên tiệt trùng riêng các một số thành phần môi trường rồi trộn chung sau khi đã tiệt trùng

1.8 Cấy giống

Tỉ lệ cây giống % theo thể tích phai thỏa điều kiện về mật độ cấy giống Xác định Xo

1.9 Lên men thu sinh khối

Tuân thủ các thông số quá trình: nhiệt độ, oxy

Thời gian len men: xác định dựa vào sinh lý sinh khối (sinh dưỡng, trạng thái nghỉ, kén, bào tử): kết hợp đo thông số động học và soi kính (nhuộm hoặc soi uống)

1.10 Downstream processing

Trong đa số trường hợp sinh khối phải được tách ra khỏi sinh trường bằng lytâm hay lọc để tránh ảnh hưởng của các hợp chất trao đổi chất bất lợi đối vớitế bào Một số dạng sản phẩm, thu sinh khối dưới dạng tế bào nghỉ, kén hoặcbào tử, các quá trnh Downstream Processing được giảm thiểu (hạn chế năng lượng), chế phẩm được tạo trực tiếp từ canh trường bằng cách trộn canh trường với chất mang Đó là trường hợp chế phẩm phân bón vi sinh và chế phẩm xử lý môi trường

1.11 Tạo chế phẩm

1.11.1 Chế phẩm trên cơ sở chất mang (carrier – based products)

Tiêu chuẩn chất mang:

- Rẻ

- Sẳn có trên thị trường

- Chứa hàm lượng chất hữu cơ cao

- Không chứa chất độc

- Có khả năng giữ nước tốt (>50%)

- Dễ dàng sử dụng

1.11.2 Chế phẩm lỏng (liquid products)

Sinh khối thường được đưa về dạng trạng thái ngủ, tốt nhất trong trường hợp vi sinh vật có kén, bào tử

BÀI 2: SẢN XUẤT CHẾ PHẨM AZOTOBACTER SPP (PHÂN BÓN CỐ

ĐỊNH ĐẠM)

I.1 Lý thuyết:

Cố định N là khả năng đồng hóa N phân tử của một số vsv và dung làm nguồn kiếm tạo tế bào Các vsv cố định N sống tự do có nhiều trong đất, hay sống cộng sinh trong nốt sần cây họ đậu Nguồn N có thể là nitơ phân tử, cũng có thể là muối amon, nitrate, nitrite, amoni acid Tùy thuộc nồng độ các hợp chất có nitơ này trong môi trường mà quá trình cố định nitơ phân tử sẽ bị ức chếnhiều hay ít Đồng thời chúng có nhu cầu lớn đối với P và Ca, cũng như để cố

định nitơ mạnh mẽ chúng cần Mo và B Phần lớn các loài Azotobacter chỉ phát

triển ở pH lớn hơn 6 và độ ẩm cao

I.2 Tạo chế phẩm: Công nghệ sản xuất phân bón trên cơ sở chất mang Chất mang phải đáp ứng những nhu cầu sau:

- Rẻ

- Sẳn có trên thị trường

- Chứa hàm lượng chất hữu cơ cao

- Không chứa chất độc

- Có khả năng giữ nước tốt (>50%)

- Dễ dàng sử dụng

II Thực hành:

1 Vật liệu:

VSV: Azotobacter chroococcum

Hóa chất: môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vsv thông thường

- Đường: mannitol, glucose, sucrose

- Nguồn N: cao nấm men

- Bao nilon

Dụng cụ:

- Dụng cụ thủy tinh nuôi cấy vsv: đĩa Petri, ống nghiệm, bông không thấm nước

- Bình tam giác

2 Tiến hành thí nghiệm:

2.1 Giữ giống ( cấy truyền từ đĩa Petri vào thạch nghiêng)

- Chuẩn bị 10 ống thạch nghiêng chứa Ashby (1) 8ml/ống Chọn khuẩn lạc đặc trưng từ đĩa petri cấy vào ống thạch nghiêng

- Ủ 300 C, trong 48 giờ

mt lỏng Ashby (2)_50ml lắc 150v/ph

mt thạch nghiêng Ashby (1) + gar -8ml/ốngCấy truyền từ

đĩa Petri

nhân giống

Bảng 2.1: Thành phần môi trường giữ giống, nhân giống

Thể tích môi trường Thạch nghiêng 50 ml

2.3 Xác định thông số động học:

- Chuẩn bị môi trường lên men chính (môi trường 3) để theo dõi thông số động học trong 48 giờ

- Cơ chất giớ hạn là đường khử phân tích theo phương pháp DNS

Bảng 2.2: Thành phần môi trường thu sinh khối (3)

Dung dịch khoáng đa lượng

0.66 g/l K2HP40.16 g/l KH2PO4

0.2 g/l MgSO4.7H2O0.134 g/l FeSO40.2 g/l NaCl0.2 g/l CaCl2Dung dịch khoáng vi lượng

(pha dung dịch mẹ nồng độ

x10 sau đó sử dụng 10ml dung

dịch mẹ cho 1lit môi trường)

0.0008 g/l CuSO4.5H2O0.00024 g/l ZnSO4.7H2O0.0028 g/l H2BO30.002 g/l Na2MoO4.4H2O0.003 g/l MnSO4.H2O

Bảng 2.3: Thí nghiệm theo dõi các thông số động học

Từ bảng thí nghiệm trên ta vẽ được đường cong tăng trưởng của Azotobacter spp

Từ đường cong tăng trưởng trưởng trên ta thấy điểm thứ 2 và điểm thứ 3 có hệ số

góc là lớn nhất Nên ta chọn 2 điểm đó để tìm .

Hình 2.1 Đồ thị đường công tăng trưởng của Azotobacter spp

Dựng đường chuẩn đường glucose:

Suy ra lượng đường tiêu tốn trong từng giờ.

- Từ bảng trên ta thấy 3 ống nghiệm 9,10,11 là sai vì : lượng đường là nguồn

Lượng đường tiêu thụ theo thời gian

đường càng giảm dần Nhưng ở 3 ống nghiệm trên thì lượng đường lại tăng lên.

- Tóm lại: Nhìn vào độ thi trên thì ta thấy lượng đường giảm dần theo thời gian Đều đó chứng tỏ là số lượng tế bào tăng dần theo theo thời gian

2.4 Sản xuất sinh khối:

Chuẩn bị môi trường lên men chính (3) 238ml + cấy 12ml/mẫu = 250ml

1 bình lắc 150v/ph, khoảng 48 giờ và 1 bình lắc 250v/ph

2.5 Thiết lập đường chuẩn tế bào:

Từ 1 huyền phù tế bào, tiến hành pha loãng theo dãy thập phân (106, 107, 108, 109) và tiến hành trải đĩa (mt Ashby agar), ủ 300C 24 giờ đếm khuẩn lạc

Bảng 2.4: Thiết lập đường chuẩn tế bào

Phường trình đường chuẩn để tính số lượng tế bào:

Hình 2.5 Đồ thị đường chuẩn tế bào

Từ phương trình đường chuẩn tế bào của Azotobacter spp ta có thể xác định được

số lượng tế bào khi biết được OD của nó

2.2.7 Phân tích chế phẩm

- Sinh khối: pha loãng, trải đĩa , đếm khuẩn lạc, phải đạt 108cfu/g

 Khả năng cố định đạm: chuyển một khuẩn lạc vào môi trường Ashby lỏng (8ml), ử nhiệt độ phòng 2-4ngày, thử NH4+ tạo thành bằng thuốc thử Nessler Cácbước tiến hành như sau:

+ Chuẩn bị bình 1 ( ở giai đoạn nghỉ) và bình 2 ( ở trên kệ lắc ) và giống trênmôi trường thạch ( môi trường asbly ) và 1 đối chứng âm và 1 đối chứng dương ly

Hình 2.5 Thử khả năng cố định dạm của Azotobacter spp

 Khả năng sinh Auxin (IAA): Salkowsky’s technique

Đưa 2ml canh ttrường vào tube Epp Ly tâm 10min trong 15000rpm

Sau đó 1ml dung dịch trộn với 2 ml thuốc khử salkowsky: kết quả cho ra không màu Vậy trong môi trường trên không có sinh IAA

II.4. Kết quả tính toán.

Số lượng tế bào lúc đầu và lúc cuối được tính bằng cách ta thế vào phương trình đườn chuẩn tế bào: y=3.1914x +0.1257

Cfu/ml

Đối chứng dương

Giống trên môi trường thạch

Bình 2

Bình 1 Đối chứng âm

Cfu/ml

Bảng tóm tắt thông số động học

Thông số Đơn vị Giá trị xác định, tính toán

S0 15

S

Mật độ tế bào trong sản phẩm Cfu/g

Câu 3:Sự khác biệt của giữa các môi trường nuôi cấy Azotobacter:

- Môi trường Asbly gồm có 2 môi trường: môi trường 1 và môi trường 2:

o Môi trường 1: là môi trường thạch vì có chưa agar và môi trường này không chứa yeast extract Môi trường này là môitrường giữ giống vì không chưa nitơ

o Môi trường 2: khác với môi trường 1 vì nó có chứa cao nấm men Cao nấm men là thành phần c9hứa nitơ Đây chính là môi trường nhân giống

- Môi trường thu sinh khối: môi trường này khác với 2 môi trường trên là sử dụng đường glucose

 Hình2.6 Hình thái khuẩn lạc

Azotobacter: có dạng nhầy, đàn hồi,

khá lồi, một số ở dạng nhăn nheo, màutrắng trong. Hình 2.8 Hình thái tạo kénAzotobacter spp: Hình giọt nướccó các tế bào kén màu trắng nâubóng,các kén nằm tập hợp thànhtừng cụm

 Hình 2.7 Hình thái tế bào Azotobacter

spp: khi nhuộn gram(âm) thì có màu hồng, hình que, hình cầu.

Bài 3 SẢN XUẤT CHẾ PHẨM BACILLUS SPP HỖ TRỢ XỬ LÝ NƯỚC

THẢI GIÀU PROTEIN VÀ TINH BỘT – SẢN XUẤT CHẾ PHẨM BÀO TỬ

BACILLUS SUBTILIS

I lý thuyết

I.1 Vi khuẩn Bacilluas subtilis

Có nhiều hoạt tính sinh học :

_ Tiết enzyme ngoại bào ( amylase, protease, cellulase, chitinase …) xử lý nước thải, giống sản xuất enzyme

I.2 Sản xuất sinh khối

Sản xuất sinh khối dưới dạng bào tử lên men chìm hoặc lên men thể rắn

I.3 Downstream processing

Lên men chìm : Ly tâm thu bào tử, tạo chế phẩm

Lên men thể rắn : môi trường đồng thời đóng vai trò chất mang, sấy

I.4 Tạo chế phẩm

Chế phẩm khô: trộn chất mang – sấy

Chế phẩm lỏng: chất lỏng hạn chế nảy mầm, nhiễm Ví dụ nước + acetic acid

II Chuẩn bị nguyên liệu, dụng cụ, tiến hành thí nghiệm:

II.1 Chuẩn bị

- VSV : Bcillus subtilis

- Vật liệu/ Hóa chất: môi trường dinh dưỡng nuôi cấy VSV thông thường : + Tinh bột, cám gạo

+ Peptone, cao thịt, cao nấm men, (NH4)2SO4

+ Các muối NaCl, MgCl2, MnCl2, FeSO2, ZnSO4

+ Cao

+ Giấm ăn ( AcOH lên men)

+ Kính hiển vi quang học x 1000

II.2 Tiến hành thí nghiệm

II.2.1 Cấy truyền từ đĩa petri vào thạch nghiêng:

- Chuẩn bị chứa thạch nghiêng chứa môi trường giữ giống ( nutrient agar ) : 2ống/nhóm Chọn khuẩn lạc đặc trưng từ đĩa petri cấy vào ống thạch

nghiêng

- Ủ 300C, 48 giờ

II.2.2 Nhân giống

- Chuẩn bị môi trường lỏng ( mt nhân giống) 50 ml : lắc 150 vòng/ phút Kiểm tra OD sau 24 giờ Tính toán lượng giống đủ cho lên men chìm và lênmen bề mặt

Bảng 3.1 Thành phần môi trường giữ giống

Thành phần Môi trường giữ giống g/

Thời gian 24h 15-18h

Thể tích môi trường Thạc nghiêng 50 ml

II.2.3 Xác định các thông số động học

- Chuẩn bị môi trường lên men chính (mt thu sinh khối) để theo dõi thông sốđộng học trong 72 giờ.Kết quả ghi chép vào bảng 3.3

Bảng 3.2 a Thành phần môi trường thu sinh khối bào tử (len men thể rắn)

Peptone 20 g/l

Cao nấm men 20 g/l Tinh bột tan 20 g/l

Dung dịch khoáng

NaCl 5 g/lMgCl2 0.2 g/lMnCl2 0.2 g/lCaCl2 0.2 g/lFeSO4 0.2 g/lZnSO4 0.2 g/l

Tiệt trùng môi trường : 1210C, 30 phút, cấy giống 1%, ủ 30-350C, lắc, 250 vòng/ phút 24-72h

Bảng 3.3 Thí nghiệm theo dõi các thông số động học nuôi cấy chìm

Ống Giờ Thời

gian

OD600

II.2.4 Sản xuất sinh khối bằng phương pháp lên men chìm

- Chuẩn bị môi trường lên men chính ,238 ml/nhóm, cấy 12ml/mẫu.Lắc 150,250 vòng/phút, khoảng 48-72 giờ

- Khảo sát ảnh hưởng của oxy lên sự tổng hợp sinh khối ( cooper et al, 1944)

- Hóa chất:

+Dung dịch thiosulfat 0.1 N (Na2S2O3) đã hiệu chỉnh nồng độ

+Dung dịch tinh bột 1%

+Dung dịch iod 0.1 N mới pha chế

+Dung dịch sulfit (Na2SO3) 0.8 N chứa CuSO4 (0.001 M)

- Nguyên tắc:

Mức độ thông khí được đánh giá một cách gián tiếp bằng phương pháp sulfit.Phương pháp dựa trên cơ sở của việc xác định tốc độ oxy hóa sulfit thành sulfat khi có mặt của chất xúc tác là đồng Lượng sulfit dư sẽ phản ứng với iod Lượng iod dư sẽ được chuẩn độ bằng thiosulfat

Na2SO3 + ½ O2 Na2SO4

4Na2SO3 + I2 3Na2SO4 + 2NaI

I2 + 2Na2S2O3 NaI + 2Na2S4O6Như vậy oxy hòa tan nhiều thì tương đương thể tích thiosulfat chuẩn độ sẽ lớn

- Tiến hành

Xác định thể tích dung dịch iod cần thiết cho thí nghiệm

- Cho dung dịch iod 0.1N từ burette chảy dần vào bình tam giác 250 ml chứa

5 ml dd Na2SO3 mới pha chế cho đến khi xuất hiện màu nâu sáng,ghi nhận thể tích iod a

- Thêm 0.5 ml dung dịch tinh bột 1% vào và chuẩn độ bằng thiosulfat cho đếnkhi mất màu xanh lam(1-3 ml thiosulfat 0.1 N)

- Cho  ml dung dịch I2 0.1N vào bình tam giác 250 ml, chuẩn độ bằng

thiosulfat như trên ( chỉ thị tinh bột vào ở giai đoạn cuối ) đến khi mất màu- V thiosulfat khoảng 30-40 ml là được

Xác định trị số sulfit trước và sau khi thông khí

- 5 ml sulfit cho vào bình tam giác 250 ml chứa sẵn a ml iod Đậy bình bằng nắp kính để vào chỗ tối 5-10 phút, sau đó dùng nước cất tráng kính đậy, thu hếtnước rửa vào bình tam giác trên, chuẩn độ dịch chứa bằng thiosulfat 0.1N Thể tích thiosulfat chuẩn độ là PN ml

( CuSO4)