BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN MODULE SẢN PHẨM TRAO ĐỔI CHẤT BẬC - Lên men sinh tổng hợp acid lactic Thu nhận acid lactic CƠ SỞ LÝ THUYẾT: 1.1 Lên men lactic: Acid lactic loại acid hữu tự nhiên sử dingj nhiều công nghiệp hóa chất, dệt, thực phẩm dược phẩm Acid lactic thương mại sản xuất nhờ lên men carbohydrate vi khuẩn lactic Lên men lactic loại hình lên men phát triển tự nhiên Lên men lactic trình trao đổi lượng Các phân tử ATP hình thành trình chuyển hóa chất (lactose) vi khuẩn giữ lại tế bào để phục vụ cho trình trao đổi sinh trưởng vi sinh vật Ngược lại, sản phẩm acid lactic, ethanol, CO2, vi khuẩn thải vào môi trường lên men Kết hàm lượng acid lactic tích lũy mơi trường lên men ngày tăng làm giảm pH môi trường kéo theo biến đổi hóa lý khác Lên men lactic đồng hình: trình lên men mà lượng acid lactic tạo thành chiếm 90%, lượng nhỏ pyruvate chuyển hóa thành acid acetic, ethanol, CO2, acetoin Lên men lactic dị hình: có khoảng 50% lượng đường tạo thành acid lactic, ngồi có sản phẩm phụ tương rác với tạo thành ester có mùi thơm Acid lactic tạo thành chiếm 40%, rượu ethylic 10%, loại khí 20% 1.2 Vi khuẩn lactic: Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacilliaceae Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram (+), không di động, thuộc nhóm yếm khí, khơng chứa cytochrome enzyme catalase, có khả sinh tổng hợp enzyme peroxidase mạnh Nhóm vi khuẩn lactic đa dạng, gồm nhiều nhóm khác nhau, tế bào chúng hình cầu hình que 1.3 Cơ chế trình lên men lactic: Acid lactic tạo thành qua trình lên men đồng sau: Glucose Glucose – - phosphate Fructose – - phosphate Fructose – 1,6 - diphosphate Phospho dioxyacetone Phosphoglyceraldehyde Acid – 1,3 - diphosphoglyceric Acid pyruvic Acid lactic 1.4 Nguyên liệu: Vi khuẩn lactic sử dụng nhiều nguồn đường lactose, glucose, galactose, maltose, dextrin,… Trong sản xuất công nghiệp, người ta thường sử dụng mật rỉ đường để lên men rẻ tiền, dễ kiếm Trước tiên, mật rỉ cần xử lý để tẩy màu tách chất keo mật rỉ Mật rỉ cần làm loãng theo tỷ lệ 1:3, sau cho chảy qua cột than hoạt tính Than hoạt tính hấp thụ chất màu Sau đó, làm lỗng mật rỉ đến nồng độ chất khô 15% H2SO4 5% theo khối lượng dịch để acid hóa mơi trường H2SO4 chất chuyển hóa đường saccharose thành đường nghịch đảo giúp q trình lên men sau tốt Trong giai đoạn người ta đun dung dịch 90-95oC CHUẨN BỊ DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ: - DỤNG CỤ STT Tên dụng cụ Quy cách Ống nghiệm 18mm Hộp petri 100mm Bình tam giác 500ml Ống hút 10ml HĨA Quả CHẤT bóp VÀ VẬT LIỆU Bình tia 500ml Số STT Tên Que hóa cấy vòng chất lượng Que cấy móc Glucose 150 g Lame + lamelle MT MRS 100 g 10 Đèn nấm cồn men Cao 5g 11 Cốc thủy tinh 100ml NaOH 30 g 12 Cốc thủy tinh 200ml H2SO4 500 ml 13 Cốc thủy tinh 1000ml Tím kết tinh 50 ml 14 Giá ống nghiệm inox Lugol 50 ml 15 Phễu thủy tinh vừa Nước cất 50 ml 16 Đũa thủy tinh dài Cồn 500 ml 17 Xanh Buret methylene 10 15 ml 18 K2HPO4 Màng mỏng PVC 11 2g 19 MgSO4 Giấy báo 12 3g 20 Thung buộc 13 ZnSO4.7H2O 1g 21 Ống ly tâm nhựa 14 (NH4)2SO4 18 g 22 Eppendorf 1.5ml 15 Ca(OH)2 20 g 23 Bơng Đầu típ 16 khơng thấm nước 1ml 100 g 24 Bơng Đầu típ 0.1ml 17 thấm nước 50 g THIẾT BỊ Quy STT Tên thiết bị cách Nồi hấp tiệt trùng Cân điện tử QUY Kính hiển vi quang NGHỆ học 3.1 Chuẩn bị Tủ ấm Tủ cấy Giống pH kế acidophillus Brix kế 10 - 30% môi Tủ lạnh Máy lắc > 10 Máy ly tâm 5000v/p 11 Fermenter lít 12 Micropippet 1000ml 13 Micropippet 100ml TRÌNH CƠNG giống Lactobacillus nhân giống trường lỏng MRS - trước 12 cách cấy ống giống gói vi khuẩn đông khô vào 150 ml MRS Giống lấy từ: Men đông khô - 3.2 Môi trường nuôi cấy Pha môi trường MRS gồm thành phần sau: Tên chất Proteose Peptone Cao thịt bò Cao nấm men Dextrose Polysorbate 80 Ammonium citrate Natri acetate MgSO4 MnSO4 K2HPO4 Agar Nước - 10 g 10 g 5g 20 g 1g 2g 5g 0,1 g 0,05 g 2g 15 g 1000 mL Môi trường lên men acid lactic: Tên chất Glucose (NH4)2SO4 MgSO4.7H20 ZnSO4.7H2O KH2PO4 pH cuối 6.5 - Hàm lượng Hàm lượng 25 g 3g 0.3 g 0.05 g 0.2 g Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: + Canh môi trường lên men đưa vào fermenter: 1000 mL + Môi trường MRS agar phân phối vào 30 ống nghiệm: mL + Môi trường MRS lỏng phân phối vào bình tam giác 250 mL: 100mL + Mơi trường PDA: 10 ống thạch nghiêng 18 đĩa petri 3.3 Quy trình ni cấy - Sơ đồ quy trình ni cấy: - Thời gian nuôi cấy: Ngày 30/10/2019 31/10/2019 Thời điểm xác định thông số 8h 11h 14h 15h 8h 11h 14h 16h Tổng thời gian nuôi cấy: 64h Tổng thời gian xác định thông số: 32h CÁC 4.1 - Bước - BƯỚC THỰC HIỆN Lập đường chuẩn acid lactic 1: Pha 1ml acid lactic chuẩn 9ml nước cất để stock nồng độ 120 g/l (khối lượng riêng acid lactic 1,2 g/ml) Bước 2: Pha loãng stock để dãy nồng độ acid lactic gồm 0,1; 0,5; 1; 2; 5; 10 (g/l) Bước 3: Hút 50µl dung dịch acid lactic nồng độ khác cho vào ống nghiệm Bước 4: Cho thêm 2ml FeCl3 0,3% vào ống nghiệm Bước 5: Lắc đo OD390 (dung dịch FeCl3 0,3% dùng làm mẫu trắng) Bước 6: Vẽ đường tương quan giá trị OD390 nồng độ acid lactic tương ứng 4.2 Lên men thu nhận acid lactic - Bước 1: Pha chế môi trường nhân giống, môi trường lên men acid lactic dung dịch điều chỉnh pH • Mỗi tổ pha : + 150 ml môi trường MRS lỏng phân phối vào bình tam giác 250 + 600 ml canh môi trường lên men phân phối vào bình tam giác 500 ml • Mỗi lớp pha: + 1000 ml canh môi trường lên men đưa vào fermenter + 250 ml NaOH 2M + 250 ml H2SO4 2M - - Bước 2: Bao gói giấy bịt nắp dụng cụ mơi trường + Bao gói pipet 10ml, dụng cụ chứa mơi trường, đầu típ 100ml 1000ml Bước 3: Hấp khử trùng môi trường nuôi cấy dụng cụ 121oC, 20 phút Bước 4: Vệ sinh khu vực thao tác cồn 70o lấy môi trường để nguội - - Bước 5: Kiểm tra giống Lactobacillus acidophilus (kiểm tra trạng thái tế bào, xác định mật độ phương pháp đo độ đục) Bước 6: Cấy giống Lactobacillus acidophilus từ môi trường MRS vào mơi trường lên men bình tam giác fermenter với tỷ lệ 5% Bước 7: + Đối với bình tam giác: ni máy lắc 35oC, tốc độ lắc 60 vòng/phút + Đối với fermenter: cài đặt nhiệt độ lên men 35oC, pH=6; Cài đặt tốc độ bơm acid base 0.5 m/s Bước 8: Kiểm tra thông số (2 lần, điểm cuối 72 giờ): hút 20mL dịch lên men + Xác định nồng độ sinh khối ( Đo OD dịch lên men bước sóng 660 nm) + Xác định nồng độ đường (oBrix) + Đo pH + Xác định nồng độ acid lactic tạo thành theo phương pháp quang phổ Borshchevskaya cộng (2016) • Xác định nồng độ acid lactic phương pháp quang phổ + Cho 50l mẫu cần xác định nồng độ acid lactic vào ống nghiệm ( mẫu canh trường cần lọc bỏ sinh khối trước) + Bổ sung 2ml dung dịch FeCl3 0,3% vào ống nghiệm chứa mẫu , lắc + Đo OD390 (dung dịch FeCl3 0,3% dùng trắng mẫu) + Dựa vào đường chuẩn tương quan OD390 nồng độ acid lactic để xác định nồng độ acid lactic canh trường KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 5.1 Kết Đường chuẩn acid lactic: • Ống thí nghiệm Nồng độ acid lactic (g/L) OD390 0.1 0.836 0.5 10 0.941 0.964 0.992 1.180 1.397 Lên men thu nhận acid lactic: • Ngày 30/10/2019 31/10/2019 Giờ 8h 11h 14h 16h 8h 11h 14h 16h pH 3,5 3,5 5,21 5,31 5,05 5,04 5,7 5,06 o Brix 2,5 2,4 2,8 2,5 2,4 2,3 OD600 1,024 1,06 0,981 1,32 1,771 1,798 1,319 1,398 OD390 1,178 1,673 1,999 1,999 1,999 1,999 1,999 1,999 Biểu đồ thể thay đổi thông số khảo sát theo thời gian nuôi cấy Nhận xét biểu đồ: pH: tăng giảm không đồng theo thời gian lên men, pH tăng nhanh từ 3h đến 7h giảm dần đến 28h, pH thấp 3h cao 30h Độ Brix: tăng giảm không đồng theo thời gian lên men, cao 3h thấp thời điểm bắt đầu lên men, có xu hướng giảm dần khoảng 26 đến 32h Nồng độ acid lactic (OD 390): tăng dần 6h đầu, sau không thay đổi suốt khoảng thời gian lên men Mật độ sinh khối (OD 600): tăng dần suốt khoảng thời gian lên men, cao 27h  - - + Quan sát hình thái vi khuẩn lactic (tiêu nhuộm gram) Men đơng khơ: Nhóm + Nhóm + Bình nhân giống Nhóm • 10 + Nhóm 11 + Nhóm + Dịch ni cấy fermenter Nhóm + Nhóm 12  -  - - Nhận xét loại tiêu bản: Tiêu men đông khô: số lượng vi khuẩn ít, tế bào bắt màu hồng Tiêu bình nhân giống: số lượng vi khuẩn nhiều dịch men đông khô, số tế bào bắt màu xanh tím, số khác bắt màu hồng Tiêu bình lên men (fermenter): lượng vi khuẩn dày đặc dịch mẫu, chủ yếu tế bào bắt màu xanh tím Giải thích khác biệt loại tiêu bản: Trong bình lên men, vi khuẩn cấp đầy đủ chất dinh dưỡng để sinh trưởng phát triển => nồng độ sinh khối tăng, mật độ tế bào nhiều Tế bào chủ yếu bắt màu xanh Lactobacillus acidophilus vi khuẩn gram dương có thành tế bào dày nên không bị ảnh hưởng thuốc nhuộm Trong bình nhân giống: nguồn dinh dưỡng chưa đủ để vi khuẩn phát triển nên số tế bào già chết nhanh chóng, tế bào già có thành tế bào yếu dễ bị phá vỡ thuốc nhuộm nên dễ bắt màu hồng Saphain sau rửa trơi tím violet 13 5.2 Thảo luận Giải thích biến động sinh khối vi khuẩn lactic, hàm lượng acid lactic, nồng độ đường, pH theo thời gian nuôi cấy? - Trong 6h đầu lên men: nồng độ chất giảm vi khuẩn bắt đầu sử dụng nguồn chất cho nhu cầu sinh trưởng ngừng sản xuất acid lactic dẫn đến lượng acid lactic canh trường giảm (pH tăng) Vi khuẩn phát triển nhanh làm tăng lượng sinh khối giảm nồng độ chất tương ứng Trong khoảng thời gian từ 6h đến 27h: sau cung cấp đủ lượng dinh dưỡng cho nhu cầu sinh trưởng, vi khuẩn bắt đầu sản xuất acid lactic vào môi trường khiến pH giảm dần nồng độ acid lactic tăng đến cực đại Trong khoảng thời gian từ 27h đến 32h: vi khuẩn sử dụng gần hết lượng chất (nồng độ chất giảm), trình sinh trưởng ngừng lại số vi khuẩn không đủ chất để sử dụng chết dẫn đến nồng độ sinh khối giảm dần, vi khuẩn ngừng sản xuất acid lactic => pH tăng, nồng độ acid lactic không đổi - - Trình bày số cơng nghệ thu nhận acid lactic ứng dụng Ứng dụng rộng rãi nhều lĩnh vực như: Nông nghiệp, công nghiệp môi trường, y dược đặc biệt lĩnh vực chế biến bảo quản thực phẩm 14 ... vào môi trường lên men Kết hàm lượng acid lactic tích lũy mơi trường lên men ngày tăng làm giảm pH môi trường kéo theo biến đổi hóa lý khác Lên men lactic đồng hình: trình lên men mà lượng acid...vi khuẩn lactic Lên men lactic loại hình lên men phát triển tự nhiên Lên men lactic trình trao đổi lượng Các phân tử ATP hình thành trình chuyển hóa chất (lactose) vi... vào mơi trường lên men bình tam giác fermenter với tỷ lệ 5% Bước 7: + Đối với bình tam giác: ni máy lắc 35oC, tốc độ lắc 60 vòng/phút + Đối với fermenter: cài đặt nhiệt độ lên men 35oC, pH=6;