BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN

Kết quả là hàm lượng acid lactic tích lũy trong môi trường lên men ngày càng tăng làm giảm pH môi trường và kéo theo các biến đổi hóa lý khác.. Lên men lactic đồng hình: quá trình lên me

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO

THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN

MODULE 1

SẢN PHẨM TRAO ĐỔI CHẤT BẬC 1

- Lên men sinh tổng hợp acid lactic

- Thu nhận acid lactic

CƠ SỞ LÝ THUYẾT:

1.1 Lên men lactic:

Acid lactic là một loại acid hữu cơ tự nhiên được sử dingj nhiều trong công nghiệp hóa chất, dệt, thực phẩm và dược phẩm Acid lactic thương mại được sản xuất nhờ lên men carbohydrate bằng vi khuẩn lactic Lên men lactic là một trong những loại hình lên men phát triển nhất trong tự nhiên

Lên men lactic là quá trình trao đổi năng lượng Các phân tử ATP được hình thành trong quá trình chuyển hóa cơ chất (lactose) sẽ được vi khuẩn giữ lại trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi và sinh trưởng của vi sinh vật Ngược lại, các sản phẩm như acid lactic, ethanol, CO2, được vi khuẩn thải vào môi trường lên men Kết quả là hàm lượng acid lactic tích lũy trong môi trường lên men ngày càng tăng làm giảm pH môi trường và kéo theo các biến đổi hóa

lý khác

Lên men lactic đồng hình: quá trình lên men mà lượng acid lactic tạo thành chiếm hơn 90%, chỉ một lượng nhỏ pyruvate được chuyển hóa thành acid

acetic, ethanol, CO2, acetoin

Lên men lactic dị hình: chỉ có khoảng 50% lượng đường tạo thành acid lactic, ngoài ra còn có các sản phẩm phụ tương rác với nhau tạo thành ester có mùi thơm Acid lactic tạo thành chiếm 40%, rượu ethylic 10%, các loại khí 20%

1.2 Vi khuẩn lactic:

Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacilliaceae Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram (+), không di động, thuộc nhóm yếm khí, không chứa cytochrome và enzyme catalase, có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxidase rất mạnh

Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng, gồm nhiều nhóm khác nhau, tế bào của chúng có thể là hình cầu hoặc hình que

1.3 Cơ chế quá trình lên men lactic:

Acid lactic được tạo thành qua quá trình lên men đồng hình như sau:

1.4 Nguyên liệu:

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều nguồn đường như lactose, glucose,

galactose, maltose, dextrin,…

Trong sản xuất công nghiệp, người ta thường sử dụng mật rỉ đường để lên men

vì rẻ tiền, dễ kiếm Trước tiên, mật rỉ cần được xử lý để tẩy màu và tách các chất keo trong mật rỉ Mật rỉ cần được làm loãng theo tỷ lệ 1:3, sau đó cho chảy qua cột than hoạt tính Than hoạt tính sẽ hấp thụ các chất màu Sau đó, làm loãng mật rỉ đến nồng độ chất khô 15% và H2SO4 5% theo khối lượng dịch để acid hóa môi trường H2SO4 như một chất chuyển hóa đường saccharose thành đường nghịch đảo giúp quá trình lên men sau này tốt hơn Trong giai đoạn này người ta đun dung dịch ở 90-95oC trong 6 giờ

1 CHUẨN BỊ DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ:

Glucose Glucose – 6 - phosphate Fructose – 6 - phosphate Fructose – 1,6 - diphosphate

Acid – 1,3 - diphosphoglyceric

Acid lactic Acid pyruvic

2 QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ

3.1 Chuẩn bị giống

- Giống Lactobacillus acidophillus được nhân giống trong môi trường lỏng MRS trước đó 12 giờ bằng cách cấy 1 ống giống hoặc 2 gói vi khuẩn đông khô vào 150 ml MRS

- Giống được lấy từ: Men đông khô

HÓA CHẤT VÀ VẬT LIỆU

1 Glucose 150 g

2 MT MRS 100 g

3 Cao nấm men 5 g

4 NaOH 30 g

5 H2SO4 500 ml

6 Tím kết tinh 50 ml

7 Lugol 50 ml

8 Nước cất 50 ml

9 Cồn 500 ml

10 Xanh methylene 15 ml

11 K2HPO4 2 g

12 MgSO4 3 g

13 ZnSO4.7H2O 1 g

14 (NH4)2SO4 18 g

15 Ca(OH)2 20 g

16 Bông không thấm nước 100 g

17 Bông thấm nước 50 g

THIẾT BỊ

1 Nồi hấp tiệt trùng

2 Cân điện tử

3 Kính hiển vi quang học

4 Tủ ấm

5 Tủ cấy

6 pH kế

7 Brix kế 10 - 30%

8 Tủ lạnh

9 Máy lắc

10 Máy ly tâm > 5000v/p

11 Fermenter 2 lít

12 Micropippet 1000ml

13 Micropippet 100ml

DỤNG CỤ

1 Ống nghiệm 18mm

2 Hộp petri 100mm

3 Bình tam giác 500ml

4 Ống hút 10ml

5 Quả bóp

6 Bình tia 500ml

7 Que cấy vòng

8 Que cấy móc

9 Lame + lamelle

10 Đèn cồn

11 Cốc thủy tinh 100ml

12 Cốc thủy tinh 200ml

13 Cốc thủy tinh 1000ml

14 Giá ống nghiệm inox

15 Phễu thủy tinh vừa

16 Đũa thủy tinh dài

17 Buret

18 Màng mỏng PVC

19 Giấy báo

20 Thung buộc

21 Ống ly tâm nhựa

22 Eppendorf 1.5ml

23 Đầu típ 1ml

24 Đầu típ 0.1ml

3.2 Môi trường nuôi cấy

- Pha môi trường MRS gồm các thành phần sau:

Tên chất Hàm lượng Proteose Peptone

Cao thịt bò

Cao nấm men

Dextrose

Polysorbate 80

Ammonium citrate

Natri acetate

MgSO4

MnSO4

K2HPO4

Agar

Nước

10 g

10 g

5 g

20 g

1 g

2 g

5 g 0,1 g 0,05 g

2 g

15 g

1000 mL

- Môi trường lên men acid lactic:

Tên chất Hàm lượng Glucose

(NH4)2SO4 MgSO4.7H20 ZnSO4.7H2O KH2PO4

pH cuối 6.5

25 g

3 g 0.3 g 0.05 g 0.2 g

- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:

+Canh môi trường lên men đưa vào fermenter: 1000 mL

+Môi trường MRS agar phân phối vào 30 ống nghiệm: 8 mL

+Môi trường MRS lỏng phân phối vào 2 bình tam giác 250 mL: 100mL +Môi trường PDA: 10 ống thạch nghiêng và 18 đĩa petri

3.3 Quy trình nuôi cấy

- Sơ đồ quy trình nuôi cấy:

- Thời gian nuôi cấy:

Ngày Thời điểm xác định các thông số

30/10/2019

8h 11h 14h 15h

31/10/2019

8h 11h 14h 16h

Tổng thời gian nuôi cấy: 64h

Tổng thời gian xác định các thông số: 32h

3 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN

4.1 Lập đường chuẩn acid lactic

- Bước 1: Pha 1ml acid lactic chuẩn và 9ml nước cất để được stock nồng độ

120 g/l (khối lượng riêng acid lactic là 1,2 g/ml)

- Bước 2: Pha loãng stock để được dãy nồng độ acid lactic gồm 0,1; 0,5; 1; 2; 5; 10 (g/l)

- Bước 3: Hút 50l dung dịch acid lactic nồng độ khác nhau cho vào mỗi ống nghiệm

- Bước 4: Cho thêm 2ml FeCl3 0,3% vào mỗi ống nghiệm trên

- Bước 5: Lắc đều và đo OD390 (dung dịch FeCl3 0,3% được dùng làm mẫu trắng)

- Bước 6: Vẽ đường tương quan giữa giá trị OD390 và nồng độ acid lactic tương ứng

4.2 Lên men thu nhận acid lactic

- Bước 1: Pha chế môi trường nhân giống, môi trường lên men acid lactic và dung dịch điều chỉnh pH

 Mỗi tổ pha : + 150 ml môi trường MRS lỏng phân phối vào 1 bình tam giác 250

+ 600 ml canh môi trường lên men phân phối vào 2 bình tam giác 500 ml

 Mỗi lớp pha:

+ 1000 ml canh môi trường lên men đưa vào fermenter

+ 250 ml NaOH 2M

+ 250 ml H2SO4 2M

- Bước 2: Bao gói giấy và bịt nắp dụng cụ và môi trường

+ Bao gói 2 pipet 10ml, dụng cụ chứa môi trường, đầu típ 100ml và 1000ml

- Bước 3: Hấp khử trùng môi trường nuôi cấy và dụng cụ ở 121oC, 20 phút

- Bước 4: Vệ sinh khu vực thao tác bằng cồn 70o và lấy môi trường để nguội

- Bước 5: Kiểm tra giống Lactobacillus acidophilus (kiểm tra trạng thái tế bào, xác định mật độ bằng phương pháp đo độ đục)

- Bước 6: Cấy giống Lactobacillus acidophilus từ môi trường MRS vào môi trường lên men ở bình tam giác và fermenter với tỷ lệ 5%

- Bước 7:

+ Đối với bình tam giác: nuôi trên máy lắc ở 35oC, tốc độ lắc 60

vòng/phút

+ Đối với fermenter: cài đặt nhiệt độ lên men ở 35oC, pH=6; Cài đặt tốc

độ bơm acid và base 0.5 m/s

- Bước 8: Kiểm tra các thông số (2 giờ một lần, điểm cuối là 72 giờ): hút 20mL dịch lên men

+ Xác định nồng độ sinh khối ( Đo OD dịch lên men tại bước sóng 660 nm)

+ Xác định nồng độ đường (oBrix)

+ Đo pH

+ Xác định nồng độ acid lactic tạo thành theo phương pháp đô quang phổ của Borshchevskaya và cộng sự (2016)

 Xác định nồng độ acid lactic bằng phương pháp quang phổ

+ Cho 50μl mẫu cần xác định nồng độ acid lactic vào ống nghiệm ( đối với mẫu canh trường cần lọc bỏ sinh khối trước)

+ Bổ sung 2ml dung dịch FeCl3 0,3% vào ống nghiệm chứa mẫu , lắc đều

+ Đo OD390 (dung dịch FeCl3 0,3% được dùng là trắng mẫu)

+ Dựa vào đường chuẩn tương quan giữa OD390 và nồng độ acid lactic

để xác định nồng độ acid lactic trong canh trường

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

5.1 Kết quả

 Đường chuẩn acid lactic:

OD 390 0.836 0.941 0.964 0.992 1.180 1.397

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6

Y (OD 390nm)

Y (OD 390nm)

Axis Title

 Lên men thu nhận acid lactic:

30/10/2019

8h 3,5 2 1,024 1,178 11h 3,5 3 1,06 1,673 14h 5,21 2,5 0,981 1,999 16h 5,31 2,4 1,32 1,999 31/10/2019 8h 5,05 2,8 1,771 1,999

11h 5,04 2,5 1,798 1,999 14h 5,7 2,4 1,319 1,999

16h 5,06 2,3 1,398 1,999

0

1

2

3

4

5

6

Thời gian nuôi cấy (h)

Biểu đồ thể hiện sự thay đổi của các thông số khảo sát theo thời gian nuôi cấy

 Nhận xét biểu đồ:

- pH: tăng giảm không đồng đều theo thời gian lên men, pH tăng nhanh từ 3h đến 7h và giảm dần đến 28h, pH thấp nhất ở 3h và cao nhất ở 30h

- Độ Brix: tăng giảm không đồng đều theo thời gian lên men, cao nhất ở 3h và thấp nhất ở thời điểm bắt đầu lên men, có xu hướng giảm dần trong khoảng 26 đến 32h

- Nồng độ acid lactic (OD 390): tăng dần trong 6h đầu, sau đó không thay đổi trong suốt khoảng thời gian lên men

- Mật độ sinh khối (OD 600): tăng dần trong suốt khoảng thời gian lên men, cao nhất ở 27h

 Quan sát hình thái vi khuẩn lactic (tiêu bản nhuộm gram)

- Men đông khô:

+ Nhóm 1

+ Nhóm 2

- Bình nhân giống

+ Nhóm 3

+ Nhóm 4

+ Nhóm 5

- Dịch nuôi cấy trong fermenter

+ Nhóm 6

+ Nhóm 8

 Nhận xét 3 loại tiêu bản:

- Tiêu bản trên men đông khô: số lượng vi khuẩn rất ít, tế bào bắt màu hồng

- Tiêu bản trong bình nhân giống: số lượng vi khuẩn nhiều hơn trong dịch men đông khô, một số tế bào bắt màu xanh tím, một số khác bắt màu hồng

- Tiêu bản trong bình lên men (fermenter): lượng vi khuẩn dày đặc trong dịch mẫu, chủ yếu các tế bào bắt màu xanh tím

 Giải thích sự khác biệt giữa 3 loại tiêu bản:

- Trong bình lên men, vi khuẩn được cấp đầy đủ chất dinh dưỡng để sinh trưởng và phát triển => nồng độ sinh khối tăng, mật độ tế bào nhiều Tế bào chủ yếu bắt màu xanh do Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn gram dương

có thành tế bào dày nên không bị ảnh hưởng bởi thuốc nhuộm

- Trong bình nhân giống: nguồn dinh dưỡng có thể chưa đủ để vi khuẩn phát triển nên một số tế bào sẽ già và chết đi nhanh chóng, các tế bào già có thành

tế bào yếu và dễ bị phá vỡ bởi thuốc nhuộm nên sẽ dễ bắt màu hồng của Saphain sau khi rửa trôi tím violet

5.2 Thảo luận

1 Giải thích sự biến động sinh khối vi khuẩn lactic, hàm lượng acid lactic, nồng độ đường, pH theo thời gian nuôi cấy?

0

1

2

3

4

5

6

Thời gian nuôi cấy (h)

- Trong 6h đầu lên men: nồng độ cơ chất giảm do vi khuẩn bắt đầu sử dụng nguồn cơ chất cho nhu cầu sinh trưởng và ngừng sản xuất acid lactic dẫn đến lượng acid lactic trong canh trường giảm (pH tăng) Vi khuẩn phát triển nhanh làm tăng lượng sinh khối và giảm nồng độ cơ chất tương ứng

- Trong khoảng thời gian từ 6h đến 27h: sau khi cung cấp đủ lượng dinh dưỡng cho nhu cầu sinh trưởng, vi khuẩn bắt đầu sản xuất acid lactic vào môi trường khiến pH giảm dần và nồng độ acid lactic tăng đến cực đại

- Trong khoảng thời gian từ 27h đến 32h: khi vi khuẩn sử dụng gần hết lượng

cơ chất (nồng độ cơ chất giảm), quá trình sinh trưởng ngừng lại một số vi khuẩn không đủ cơ chất để sử dụng sẽ chết đi dẫn đến nồng độ sinh khối giảm dần, vi khuẩn ngừng sản xuất acid lactic => pH tăng, nồng độ acid lactic không đổi

2 Trình bày một số công nghệ thu nhận acid lactic được ứng dụng hiện nay Ứng dụng rộng rãi trong nhều lĩnh vực như: Nông nghiệp, công nghiệp và môi trường, y dược và đặc biệt là trong lĩnh vực chế biến và bảo quản thực phẩm