HOẠT TÍNH ức CHẾ VK KIỂM ĐỊNH của một số LOÀI THỰC vật NGẬP mặn tại vườn QUỐC GIA

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2013, 35(3): 342-347 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ VI KHUẨN KIỂM ĐỊNH CỦA MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT NGẬP MẶN TẠI VƯỜN QUỐC GIA XUÂN THỦY, NAM ĐỊNH Trần Mỹ Linh1*, Vũ Hương Giang1, Lê Quỳnh Liên1, Nguyễn Tường Vân2, Ninh Khắc Bản1, Châu Văn Minh1 Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *tmlinh@imbc.vast.vn Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam TÓM TẮT: Với 3.000 km bờ biển, Việt Nam quốc gia có lợi hệ sinh thái rừng ngập mặn, cung cấp nguồn nguyên liệu phong phú cho việc sàng lọc tìm kiếm sản phẩm tự nhiên có khả ức chế vi sinh vật gây bệnh Nhằm nghiên cứu tiềm ứng dụng thực vật sinh trưởng khu vực rừng ngập mặn, chúng tơi thu thập chín lồi thực vật: Kandelia obovata, Pluchea pteropoda Hemsl., Aegiceras corniculatum (L.) Blanco, Lumnitzera racemosa Wild., Sonneratia caseolaris (L.) Engl., Sonneratia apetala Buch Ham, Bruguiera gymnorrhiza (L.) Lam, Rhizophora stylosa Griff Avicennia marina (Forsk.) Vierh từ Vườn quốc gia Xuân Thủy, tỉnh Nam Định Dịch chiết methanol từ cành loài thực vật sử dụng để đánh giá hoạt tính ức chế lồi vi khuẩn: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis Proteus vulgaris phương pháp khuếch tán giếng đĩa thạch Kết nghiên cứu cho thấy, loài thực vật thể hoạt tính ức chế với chủng vi khuẩn kiểm định; lồi Lumnitzera racemosa (Cóc trắng), Sonneratia caseolaris (Bần chua) Sonneratia apetala (Bần myanma) có hoạt tính ức chế vi khuẩn cao nhất; loài Aegiceras corniculatum (Sú) Avicennia marina (Mắm biển) cho hoạt tính trung bình; loài Kandelia obovata (Trang), Pluchea pteropoda (Nam sài hồ), Rhizophora stylosa (Đước) Bruguiera gymnorrhiza (Vẹt dù) có hoạt tính yếu Từ khóa: Aegiceras, Avicennia, Bruguiera, Kandelia, Lumnitzera, Pluchea, Rhizophora, Sonneratia, hoạt tính ức chế vi khuẩn, thực vật ngập mặn, Vườn quốc gia Xuân Thủy MỞ ĐẦU Rừng ngập mặn (RNM) coi tài nguyên quý trái đất, đó, nhiều thực vật ngập mặn nguồn dược liệu thuốc dân gian nhiều quốc gia khu vực châu Á-Thái Bình Dương Các nghiên cứu hóa học phát 120 hợp chất loài Avicennia marina (Mắm biển) 20 hợp chất từ loài Sonneratia caseolaris (Bần chua) Trong số đó, có hợp chất mang nhiều hoạt tính sinh học có giá trị hoạt tính ức chế vi khuẩn, ức chế nấm, chống gốc oxy hóa-khử hay gây độc tế bào [8, 9] Hệ sinh thái RNM Việt Nam có độ đa dạng sinh học cao, xuất trải dài ba miền Bắc-Trung-Nam với nhiều loài thực vật sử dụng làm nguồn nguyên liệu công nghiệp dược Vườn quốc gia (VQG) Xuân Thủy (20o10'N-20o15'N; 106o20'E-106o32'E) tiêu biểu cho hệ sinh thái đất ngập nước cửa sông ven biển đồng châu thổ sơng Hồng, nơi sinh sống 190 lồi thực vật thuộc 137 chi, 60 họ Nhiều loài thực vật 342 cộng đồng khu vực vùng đệm VQG Xuân Thủy sử dụng làm thuốc chữa bệnh theo kinh nghiệm dân gian chưa kiểm định mặt khoa học Gần đây, có số nghiên cứu sơ thành phần hóa học thăm dò hoạt tính sinh học lồi Clerodendrum inerme (Ngọc nữ biển) [5] hay nghiên cứu thành phần hóa học lồi Lumnitzera racemosa (Cóc trắng) [1] Với mục tiêu đánh giá tiềm ứng dụng rừng ngập mặn, tiến hành nghiên cứu đánh giá sàng lọc hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh số loài thực vật ngập mặn VQG Xuân Thủy, tập trung vào loài thực vật ngập mặn lồi sử dụng số thuốc dân gian Đước, Trang, Vẹt dù, Mắm Nam sài hồ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Các phận mặt đất (cành, lá) loài thực vật VQG Xuân Thủy thu thập phục vụ cho nghiên cứu (bảng 1) Mẫu thực vật Tran My Linh et al sấy khô nhiệt độ 40oC-50oC, nghiền nhỏ, bổ sung methanol chiết siêu âm 40oC vòng (thí nghiệm chiết lặp lại lần) Phần dịch chiết methanol thu sau lọc cất loại dung môi máy cất quay chân không 50oC để thu cặn chiết methanol (cặn chiết tổng) Cặn chiết methanol sử dụng thí nghiệm đánh giá hoạt tính Chủng vi khuẩn nuôi cấy: Các chủng vi khuẩn kiểm định sử dụng thí nghiệm gồm: Escherichia coli ATCC®25922™*, Staphylococcus aureus ATCC®25923™, Proteus mirabilis ATCC®29245™ Proteus vulgaris ATCC®33420™* (Microbiologics, Hoa Kỳ) Các chủng vi khuẩn nuôi cấy từ ống chủng gốc, môi trường LB đặc 37oC, ủ qua đêm Phương pháp Thử hoạt tính ức chế khuẩn phương pháp khuếch tán đĩa thạch Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn phương pháp Hadacek et al (2000) [3] có điều chỉnh phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Chủng vi khuẩn sau hoạt hóa từ ống chủng gốc mơi trường LB đặc, khuẩn lạc cấy chuyển sang ml môi trường LB lỏng lắc qua đêm nhiệt độ 37oC Đĩa thử hoạt tính chuẩn bị cách cấy trải 200 µL dịch khuẩn, nồng độ tương đương 4-5 × 108 CFU/ml lên bề mặt đĩa petri có chứa mơi trường LB đặc, để khơ đục 5-6 giếng, đường kính khoảng mm cho giếng cách khoảng 2-3 cm Chuẩn bị dịch chiết thử cách hòa tan cặn chiết methanol mẫu thực vật Dimethyl Sulfoxide (DMSO) thành nồng độ theo yêu cầu Bổ sung 50 µL dịch chiết thử vào giếng thạch đĩa petri giữ đĩa thí nghiệm nhiệt độ phòng tiếng, tới dịch chiết từ giếng khuếch tán mơi trường ni cấy vi khuẩn; sau đó, đặt đĩa vào tủ ấm 37oC 24 Đối chứng dương dung dịch kháng sinh (Ampicilin 0,1 mg/ml với E coli P mirabillis; Kanamycin mg/ml với S aureus P vulgaris); đối chứng âm DMSO Hoạt tính ức chế khuẩn đánh giá cách đo bán kính (BK) vòng ức chế vi sinh vật cơng thức: BK (mm) = D-d; D = đường kính vòng vơ khuẩn d = đường kính lỗ khoan thạch Thí nghiệm lặp lại ba lần lấy giá trị bán kính trung bình Bảng Cơng dụng lồi thực vật sử dụng nghiên cứu STT Tên khoa học Tên thông thường Kandelia obovata Trang, Vẹt Pluchea pteropoda Hemsl Nam sài hồ Aegiceras corniculatum (L.) Blanco Lumnitzera racemosa Wild Sonneratia caseolaris (L.) Engl Sonneratia apetala Buch Ham Bruguiera gymnorrhiza (L.) Lam Rhizophora stylosa Griff Avicennia marina (Forsk.) Vierh Công dụng Chứa nhiều tannin, dùng để khử mùi Giảm nhiệt, chữa sốt, cảm, cúm, lợi tiểu, điều kinh Sú Sử dụng làm thuốc giảm đau Cóc trắng Chắn bão bảo vệ bờ biển Bảo vệ bờ biển; vỏ chứa nhiều tanin dùng thuộc da Bần chua Bần myanma, Vẹt dù Đước Mắm biển, Mắm ổi, Mắm đen Chắn bão bảo vệ bờ biển Vỏ có chứa nhiều tanin, tác dụng khử mùi Bảo vệ bờ biển Qủa ăn được; hoa làm thức ăn cho ong mật; số phận sử dụng làm thuốc 343 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2013, 35(3): 342-347 dương ổn định tất đĩa lần lặp lại thí nghiệm Đối chứng âm DMSO hồn tồn khơng có vòng ức chế vi sinh vật xuất Các dịch chiết thể hoạt tính ức chế khác lồi vi sinh vật sử dụng thí nghiệm Với hàm lượng cặn chiết thấp (50 µL dịch chiết nồng độ 10 mg/ml 50 mg/ml), mẫu thực vật khơng thể hoạt tính ức chế với vi khuẩn Gram âm Escherichia coli ATCC®25922™*, trừ lồi Lumnitzera racemosa hoạt tính yếu (bảng 2) Tuy nhiên, tăng hàm lượng tới mg lượng cặn chiết (50 µL dịch chiết thử nồng độ 100 mg/ml), tất mẫu dịch chiết thể hoạt tính ức chế vi sinh vật từ thấp đến cao Trong số đó, dịch chiết hai lồi Sonneratia caseolaris lồi Avicennia marina cho hoạt tính cao nhất, xấp xỉ 25% so với đối chứng dương kháng sinh ức chế vi khuẩn đặc hiệu KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Đánh giá hoạt tính ức chế vi khuẩn kiểm định dịch chiết từ thực vật Các phận mặt đất (cành, lá) loài thực vật thí nghiệm thu thập sấy khơ để phục vụ thí nghiệm Mẫu khơ (0,3 kg/mẫu) nghiền nhỏ chiết methanol thiết bị quy mơ phòng thí nghiệm Kết thu 20-40 gram cặn chiết methanol tổng từ mẫu thí nghiệm Cặn chiết sử dụng để pha thành dịch chiết thử với nồng độ 10, 50 100 mg/ml DMSO Trong nghiên cứu đây, hoạt tính ức chế vi khuẩn đánh giá thơng qua vòng ức chế vi sinh vật tạo xung quanh giếng đĩa thạch có bổ sung dịch chiết thử Quan sát đĩa thạch thí nghiệm, chúng tơi nhận thấy, hoạt động chất làm đối chứng Bảng Kết đánh giá hoạt tính ức chế loài vi khuẩn S TT E coli Tên khoa học Kandelia obovata Pluchea pteropoda Aegiceras corniculatum Lumnitzera racemosa Sonneratia caseolaris Sonneratia apetala Bruguiera gymnorrhiza Rhizophora stylosa Avicennia marina Đối chứng dương Đối chứng âm (DMSO) Vi sinh vật thử hoạt tính S aureus P mirabilis Nồng độ dịch chiết thử (mg/ml) 10 50 100 10 50 100 10 - 50 - 100 1 - - - - - - - 2 - - - - - - - - - - - - 20 22 22 - - - P vulgaris 10 - 50 - 100 - - - - - 10 - - - - - - - - - - - 10 11 11 11 12 12 13 12 13 - - - - - - - - - Giá trị biểu cột: Bán kính vùng ức chế (BK) ( - ): khơng có biểu ức chế, vi khuẩn phát triển bình thường Đối chứng dương: Ampicilin 0,1 mg/ml với E coli P mirabillis; Kanamycin mg/ml với S aureus P vulgaris Các giá trị bán kính vùng ức chế sinh trưởng vi sinh vật tính trung bình ba lần thí nghiệm lặp lại 344 Tran My Linh et al Đối với vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus ATCC®25923™, dịch chiết ba lồi Sonneratia caseolaris, Avicennia marina Lumnitzera racemosa có hoạt tính ức chế cao, với bán kính vùng ức chế 1/2 so với đối chứng dương (bảng 2) Đặc biệt, dịch chiết từ lồi Lumnitzera racemosa biểu hoạt tính ức chế vi khuẩn S aureus rõ rệt nồng độ thấp kiểm tra thí nghiệm (10 mg/ml) Kết đánh giá hoạt tính với vi khuẩn Proteus mirabilis ATCC®29245™ Proteus vulgaris ATCC®33420™* cho thấy, ba loài Lumnitzera racemosa, Sonneratia caseolari Sonneratia apetala thể hoạt tính ức chế mạnh Hai lồi Pluchea pteropoda Rhizophora stylosa cho hoạt tính ức chế yếu vi khuẩn P mirabilis Các dịch chiết lồi thực vật lại khơng quan sát thấy hoạt tính ức chế hai lồi vi khuẩn P mirabilis P vulgaris Nhiều nghiên cứu sử dụng thực vật ngập mặn làm nguồn nguyên liệu để tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học công bố Pradeep & Rathod (2010) [6] cho rằng, dịch chiết n-hexane dịch chiết chloroform từ Acanthus ilicifolius (Ơ rơ) thu thập từ rừng ngập mặn khu vực biển Karwar-Karnataka, Ấn Độ biểu tính ức chế mạnh vi khuẩn Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, ức chế trung bình vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Proteus vulgaris Gần đây, tác giả Saad et al (2011) [7] Hicks et al (2011) [4] nghiên cứu hoạt tính ức chế vi sinh vật lồi Lumnitzera littorea (Cóc đỏ) Rhizophora mangle L (Đước đỏ) cho kết khả quan Nghiên cứu đánh giá hoạt tính ức chế vi sinh vật thành phần hóa học hai lồi thực vật ngập mặn Aegiceras corniculatum (Sú) Bruguiera cylindrica (Vẹt khang), Geepi et al (2011) [2] quan sát thấy hai lồi có hoạt tính ức chế mạnh với vi sinh vật phân lập từ mẫu bệnh phẩm viêm đường tiết niệu (Escherichia coli, Kebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginos, Proteus mirabilis Staphylococcus aureus) Tương tự với kết nghiên cứu Saad et al (2011) [7] Geepi et al (2011) [2], loài Lumnitzera racemosa (Cóc trắng) Aegiceras corniculatum (Sú) thuộc nhóm lồi có hoạt tính ức chế vi khuẩn cao nghiên cứu Trên sở kết đánh giá hoạt tính ức chế vi sinh vật dịch chiết từ loài thực vật nghiên cứu, chúng tơi chia thành ba nhóm Nhóm I (Cóc trắng, Bần chua Bần myanma) cho hoạt tính ức chế mạnh lồi vi khuẩn Nhóm có tiềm để nghiên cứu sàng lọc hợp chất ức chế khuẩn có giá trị Nhóm II (Sú Mắm biển) có hoạt tính ức chế trung bình với vi khuẩn E coli S aureus (liên quan tới bệnh tiêu hóa tiết niệu) khơng có hoạt tính ức chế hai vi khuẩn P mirabilis P vulgaris (thường gây bệnh tiết niệu) Nhóm III gồm lồi thực vật lại (Trang, Nam sài hồ, Đước Vẹt dù) có hoạt tính trung bình-yếu lồi vi khuẩn kiểm tra Đáng ý, sử dụng số thuốc dân gian địa phương, dịch chiết cành Nam sài hồ biểu hoạt tính yếu khơng có hoạt tính ức chế với lồi vi sinh vật sử dụng nghiên cứu Sự khác biệt hoạt tính sinh học ức chế lồi vi sinh vật thực vật ảnh hưởng nhiều yếu tố Một số khác biệt thành phần hợp chất hóa học loài thực vật hợp chất khác lại có hoạt tính đặc hiệu với lồi vi sinh vật gây bệnh Chính vậy, nghiên cứu sâu thành phần hợp chất hóa học lồi thực vật có tiềm nhằm đánh giá xác khả ức chế vi sinh vật tìm hiểu chế tác động loài vi sinh vật cần thiết KẾT LUẬN Chín loài thực vật ngập mặn VQG Xuân Thủy thu thập, tạo dịch chiết methanol đánh giá hoạt tính ức chế lồi vi khuẩn kiểm định gây bệnh phổ biến người (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis Proteus vulgaris) sử dụng phương pháp khuếch tán đĩa thạch Dịch chiết methanol từ cành lồi Cóc trắng, Bần chua Bần myanma thể hoạt tính ức chế vi khuẩn cao nhất, hứa hẹn tiềm ứng dụng việc tìm kiếm 345 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2013, 35(3): 342-347 hợp chất có hoạt tính kháng sinh; dịch chiết lồi Sú Mắm biển có hoạt tính trung bình dịch chiết lồi Trang, Nam sài hồ, Đước Vẹt dù có hoạt tính yếu TÀI LIỆU THAM KHẢO Châu Ngọc Điệp, Nguyễn Hoài Nam, Lê Đức Đạt, Vũ Anh Tú, Ninh Thị Ngọc, Nguyễn Phương Thảo, Phan Thị Thanh Hương, Nguyễn Xuân Cường, Ninh Khắc Bản, Phan Văn Kiệm, Châu Văn Minh, 2012 Các hợp chất Tritecpen Tritecpen glycosit phân lập từ Cóc trắng Lumnitzera racemosa Tạp chí Hóa học, 50(5A): 219-223 Geegi P., Samy A., Raj S., 2011 Invitro antibacterial activity of aegiceras Corniculatum and Bruguiera cylindrical against isolated bacterial urinary tract infections International Jour Of Pharmaceutical Research and Development, 3(11): 120-125 Hadacek F., Greger H., 2000 Testing of antifungal natural products: methodologies, comparability of results and assay choice Phytochem Anal., 11: 137-147 Hicks M., Bailey M., Thiagarajan T., Troyer T., Huggins L., 2011 Antibacterial and Cytotoxic Effects of Red Mangrove (Rhizophora Mangle L.Rhizophoraceae) Fruit Extract European Journal of Scientific Research, 63(3): 439-446 Trần Thị Minh, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Vũ Đào Thắng, Trần Văn Sung, 2007, Andrograholid lupenyleste từ Ngọc nữ biển Việt Nam (Clerodendrum inerme Gaernt.) Tạp chí Hóa học, 45(6A): 166170 Pradeep V., Rathod J., 2010 Antimicrobial activity of extracts of Acanthus ilicifolius extracted from the mangroves of Karwar coast Karnataka Pharmacology Recent Research in Science and Technology, 2(6): 98-99 Saad S., Taher M., Susanti D., Qaralleh H., Rahim N., 2011 Antimicrobial activity of mangrove plant (Lumnitzera littorea) Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 4(7): 523-525 Tian M., Dai H., Li X., Wang B., 2009 Chemical constituents of marine medicinal mangrove plant Sonneratia caseolaris Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 27(2): 288-296 Zhu F., Chen X., Yuan Y., Huang M., Sun H., Xiang W., 2009 The Chemical Investigations of the Mangrove Plant Avicennia marina and its Endophytes The Open Natural Products Journal, 2: 24-32 ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF SOME MANGROVE SPECIES IN XUAN THUY NATIONAL PARK, NAM DINH, VIETNAM Tran My Linh1, Vu Huong Giang1, Le Quynh Lien1, Nguyen Tuong Van2, Ninh Khac Ban1, Chau Van Minh1 Institute of Marine Biochemistry, VAST Institute of Biotechnology, VAST SUMMARY Possessing more than 3,000 km coastal lines, Vietnam has several mangrove forests which are potential sources of natural products with pharmaceutical properties In order to investigate the applications of mangrove forests in Vietnam, nine mangrove plants including Kandelia obovata, Pluchea pteropoda Hemsl., Aegiceras corniculatum (L.) Blanco, Lumnitzera racemosa Wild., Sonneratia caseolaris (L.) Engl., 346 Tran My Linh et al Sonneratia apetala Buch Ham, Bruguiera gymnorrhiza (L.) Lam, Rhizophora stylosa Griff and Avicennia marina (Forsk.) Vierh were collected in Xuan Thuy National Park, Nam Dinh province, Vietnam Methanol extracts from barks and leaves of these species were used to evaluate antibacterial activity against control bacteria Escherichia coli ATCC®25922™*; Staphylococcus aureus ATCC®25923™; Proteus mirabilis ATCC®29245™ and Proteus vulgaris ATCC®33420™ via the agar well diffusion method All of methanol extracts from nine mangrove plant species collected in Xuan Thuy National Park inhibited the growth of tested pathogenic bacterial strains Lumnitzera racemosa Wild., Sonneratia caseolaris (L.) Engl and Sonneratia apetala Buch Ham expressed the highest antibacterial activity Aegiceras corniculatum (L.) Blanco and Avicennia marina (Forsk.) Vierh showed medium activity Kandelia obovata, Pluchea pteropoda Hemsl., Rhizophora stylosa Griff and Bruguiera gymnorrhiza (L.) Lam showed the lowest activity Keywords: Aegiceras, Avicennia, Bruguiera, Kandelia, Lumnitzera, Pluchea, Rhizophora, Sonneratia, antibacterial activity, Xuan Thuy National Park Ngày nhận bài: 1-4-2013 347 ... thể hoạt tính ức chế mạnh Hai loài Pluchea pteropoda Rhizophora stylosa cho hoạt tính ức chế yếu vi khuẩn P mirabilis Các dịch chiết lồi thực vật lại khơng quan sát thấy hoạt tính ức chế hai loài. .. dụng số thuốc dân gian địa phương, dịch chiết cành Nam sài hồ biểu hoạt tính yếu khơng có hoạt tính ức chế với loài vi sinh vật sử dụng nghiên cứu Sự khác biệt hoạt tính sinh học ức chế loài vi. .. Aegiceras corniculatum (Sú) thuộc nhóm lồi có hoạt tính ức chế vi khuẩn cao nghiên cứu Trên sở kết đánh giá hoạt tính ức chế vi sinh vật dịch chiết từ loài thực vật nghiên cứu, chúng tơi chia thành ba