XÁC ĐỊNH HOẠT LỰC THUỐC KHÁNG SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỬ VI SINH VẬT Hoạt lực kháng sinh thể khả ức chế loại chủng thị đó, điều kiện thích hợp Sự giảm hoạt tính sinh học kháng sinh thể chủng thị, khó phát phương pháp phân tích hố học, phương pháp vi sinh vật thường giữ vai trò quan trọng việc đánh giá khả hoạt lực kháng sinh, loại kháng sinh có cấu trúc phức tạp, thành phần gồm hỗn hợp kháng sinh họ mà mức độ hoạt lực chênh lệch không lớn Phương pháp vi sinh vật xác định hoạt lực kháng sinh cách so sánh tác động ức chế phát triển loại vi sinh vật (được gọi chủng thị) độ pha loãng biết kháng sinh mang thử (chưa biết rõ hoạt lực) với tác động ức chế nồng độ biết kháng sinh đối chiếu (chất chuẩn biết rõ hoạt lực) Thử nghiệm phải dùng phương pháp phân tích thống kê để đánh giá số liệu thu Nếu áp dụng mơ hình đường thẳng song song, hai đường log liều - đáp ứng chất chuẩn chế phẩm thử phải song song với phải tuyến tính khoảng liều dùng Hai phương pháp thường sử dụng kiểm nghiệm phương pháp khuếch tán dùng môi trường thạch phương pháp đo độ đục dùng môi trường lỏng Phương pháp thứ dựa vào khuếch tán kháng sinh từ chỗ chứa qua lớp thạch đặc hộp Petri khay vào khoảng phát triển vi sinh vật tạo vòng ức chế hoàn toàn xung quanh nơi chứa (ống trụ, lỗ thạch) dung dịch kháng sinh Phương pháp ống nghiệm dựa vào độ đục canh khuẩn, biết ức chế phát triển vi khuẩn gây loạt dung dịch kháng sinh môi trường lỏng mơi trường thích hợp phát triển vi sinh vật khơng có kháng sinh Phương tiện dụng cụ Tất dụng cụ phải làm hồn tồn trước sau lần thí nghiệm Những dụng cụ thuỷ tinh đồ đựng khác dùng thí nghiệm phải loại hết vi khuẩn chất ảnh hưởng Các dụng cụ dùng để giữ chuyển chủng thị cần làm cẩn thận tiệt khuẩn sức nóng khơ nước điều kiện thích hợp Điều kiện nhiệt độ: Khi nuôi cấy chủng thị chế tạo nhũ dịch cấy truyền, cần thực môi trường đảm bảo nhiệt độ qui định Đối với phương pháp đo độ đục, cần kiểm tra chặt chẽ buồng điều khiển nhiệt độ cho nhiệt độ quanh ống nghiệm phải đồng phải đạt nhiệt độ cần thiết ống nghiệm Nên dùng điều nhiệt nước ln chuyển tốt điều nhiệt khơng khí Máy đo quang phổ: Được dùng để đo truyền qua hấp thụ khoảng sóng hẹp, cần có máy đo quang thích hợp thay đổi bước sóng dùng dùng kính lọc 650 nm 580 nm để đo nhũ dịch nuôi cấy pha chế dùng kính lọc 530 nm để đo độ hấp thụ ánh sáng phương pháp đo độ đục Dùng canh thang tiến hành mẫu thêm dung dịch formaldehyd để chỉnh máy cho độ hấp thụ điểm “ ” Dụng cụ thí nghiệm: - Phương pháp khuếch tán: Dùng khay đĩa Petri thuỷ tinh plastic, đạt tiêu chuẩn phẳng Đĩa Petri có hai loại, cỡ nhỏ đường kính 100 mm, cỡ lớn đường kính lớn 160 mm Các khay thí nghiệm tiêu chuẩn hố, kính plastic với kích thước 25 x 25 cm (loại vuông) 28,8 x 19,8 cm (loại chữ nhật) Có thể sử dụng chất liệu thích hợp đạt tiêu chuẩn phẳng Ống trụ thép khơng rỉ, thuỷ tinh, sứ, có kích thước sau: Đường kính ngồi 8,0 mm; đường kính 6,0 mm; cao 10,0 mm Vật liệu dùng làm ống trụ phải loại trơ, riêng kháng sinh nhạy cảm với ánh sáng phải dùng vật liệu có pha màu nâu Khi dùng phải làm cẩn thận, loại hết cặn, khử khuẩn Đôi phải rửa acid dung dịch acid nitric 2M, acid sulfocromic Dụng cụ dùng cho phương pháp đo độ đục: Dùng ống nghiệm loại 16 x 125 mm 18 x 150 mm thuỷ tinh có chiều dài, đường kính độ dày, bề mặt phải khơng có vết xước, khơng dây bẩn Khi dùng, ống nghiệm phải hồn tồn, đảm bảo khơng vết kháng sinh vết chất tẩy rửa phải tiệt khuẩn trước dùng Môi trường, dung môi chất pha loãng Phải dùng chất đạt từ mức tinh khiết hố học trở lên để pha chế Mơi trường Dưới công thức môi trường cần thiết dùng cho kiểm nghiệm kháng sinh Các loại môi trường thay mơi trường khơ tương ứng loại môi trường thúc đẩy vi sinh vật phát triển tốt mà cho đường đáp ứng tương tự Pha môi trường cách hồ tan thành phần cơng thức vào phần nước, sau thêm nước vừa đủ lít Dùng dung dịch acid hydrocloric 1N dung dịch natri hydroxyd 1N để điều chỉnh môi trường cho sau tiệt khuẩn 121oC 15 phút có pH ghi công thức Thời gian cần cho việc tiệt khuẩn kéo dài tới 30 phút mơi trường tích lớn 500 ml Môi trường số Pepton khô 6,0 g Casein pancreatic 4,0 g Cao men bia 3,0 g Dextrose monohydrat 1,0 g Thạch 20,0 g Nước cất 1000 ml pH: 6,0 đến 7,0 Môi trường số 2: Pepton khô 6,0 g Cao men bia 3,0 g Cao thịt 1,5 g Thạch 20,0 g Nước cất 1000 ml pH: 6,0 đến 7,0 Môi trường số 3: Pepton khô 5,0 g Cao men bia 1,5 g Cao thịt 1,5 g Dextrose monohydrat 1,0 g Dikali 3,58 g hydrophosphat (K2HPO4) 1.32 g Kali dihydrophosphat 3,5 g (KH2PO4) 1000 ml Natri clorid Nước cất pH: 6,0 đến 7,0 Môi trường số 4: Giống mơi trường số có pH 7,0 đến 8,0 Môi trường số 5: Giống môi trường số 1, có pH 7,8 đến 8,0 Mơi trường số 6: Casein pancreatic 17,0 g Bột đậu tương papaic 3,0 g Natri clorid 5,0 g Dextrose monohydrat 2,5 g Dikali hydrophosphat (K2HPO4) 2,5 g Thạch 15,0 g Polysorbat 80 10,0 ml Nước cất 1000 ml pH : 7,0 đến 7,3 Chú ý: Polysorbat 80 thêm vào lượng dung dịch nóng thành phần khác trước thêm nước vừa đủ dung tích cần thiết Mơi trường số 7: Pepton khô 9,4 g Cao men bia 4,7 g Cao thịt 2,4 g Dextrose monohydrat 10,0 g Natri clorid 10,0 g Thạch 20,0 g Nước cất 1000 ml pH: 6,0 0,2 Dung mơi chất pha lỗng Dung mơi chất pha lỗng dùng thí nghiệm phải không ảnh hưởng đến phát triển vi sinh vật Chúng dùng để pha dung dịch theo yêu cầu thí nghiệm Các loại dung môi nước vô khuẩn, acid hydrocloric, ethanol, dimethylformamid dung dịch đệm có dải pH khác loại khác tuỳ thuộc vào kháng sinh riêng biệt (bảng 2) Các dung dịch đệm phosphat chế tạo cách hoà tan lượng dikali hydrophosphat kali dihydrophosphat (theo bảng 1) vào nước vừa đủ để 1000 ml Sau điều chỉnh với acid phosphoric 18 N natri hydroxyd 18 N đến pH cần thiết Giá trị pH bảng pH dung dịch sau tiệt khuẩn Bảng Số Dikali Kali pH dung hydrophospha dihydrophospha điều chỉnh dịch t K2HPO4 (g) t KH2PO4 (g) đến đệm 2,0 8,0 6,0 0,1 16,73 0,523 8,0 0,1 13,61 4,5 0,1 20,0 80,0 35,0 13,6 4,0 6,0 0,1 10,5 0,1 7,0 0,2 Chất đối chiếu đơn vị Chất đối chiếu dùng thử nghiệm chất có hoạt lực xác định xác so với chuẩn quốc tế chất đối chiếu quốc tế tương ứng Hoạt lực kháng sinh thể đơn vị quốc tế Một đơn vị quốc tế hoạt lực đặc biệt chứa lượng (tính theo cân nặng) chuẩn sinh học quốc tế tương ứng chế phẩm đối chiếu sinh học quốc tế Từng thời kỳ, Hội đồng chuẩn sinh học Tổ chức y tế giới có dẫn qui định xác cho chuẩn quốc tế Trong vài trường hợp, định nghĩa số đơn vị quốc tế bao gồm tổng lượng vài ngun liệu thực tế khó cân lượng nhỏ dù xác chất chuẩn sinh học quốc tế chất đối chiếu sinh học quốc tế Hoạt lực vài chất kháng sinh biểu thị g g hoạt lực không thiết tương ứng với khối lượng chất kháng sinh khơng thể bao hàm tồn thực thể hoá học tinh khiết riêng kháng sinh Chủng thị dịch cấy truyền Các chủng thị dùng phải nhạy cảm, phù hợp với kháng sinh, theo qui định bảng Có thể dùng chủng thị khác với chủng thị giới thiệu chuyên luận chủng phải nhạy cảm với kháng sinh cần định lượng Chế tạo dịch cấy truyền Chế tạo nhũ dịch vi khuẩn nha bào Escherichia coli Klebsiella pneumoniae (khơng tạo vỏ ) Micrococcus luteus Saccharomyces cerevisiae Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus faecium Dùng chủng thị phát triển thạch nghiêng sau 24 giờ, cấy truyền lại lên mặt ống thạch nghiêng khác bề mặt thạch rộng (như bình Roux) mơi trường số (Saccharomyces cerevicae dùng môi trường số 8; Streptococcus faecium dùng môi trường số 3) ủ 32 - 350C 24 (riêng với Klebsiella pneumoniae Streptococcus faecium ủ 370C) với Saccharomyces cerevisiae ủ 300C Thu vi khuẩn phát triển bề mặt môi trường nước muối sinh lý, hồ lỗng với chất hồ lỗng tới độ đục thích hợp để đáp ứng thích hợp phương pháp đo độ đục, để tạo vùng ức chế rõ ràng, sắc nét thuận lợi đo phương pháp khuếch tán Thí dụ: Pha loãng hỗn dịch vi khuẩn tới nồng độ cho đo bước sóng 650 nm, cốc đo dày 1cm, độ truyền qua T = 50%, bước sóng 580 nm T = 25%, hay cho vòng vo khuẩn rõ, sắc net có đường kính 13 mm Nhũ dịch vi khuẩn chế tạo đem bảo quản nhiệt độ 40C sử dụng tuần Chế tạo nhũ dịch nha bào Bacillus cereus Bacillus pumilus Bacillus subtilis Cho chủng vi khuẩn mọc qua đêm ống thạch nghiêng môi trường số 370C (riêng với Bacillus cereus nuôi 300C) Thu vi khuẩn phát triển mặt thạch nước muối sinh lý, chuyển sang bề mặt thạch rộng (như bình Roux) mơi trường số 1, môi trường thêm vào dung dịch 0,001% (kl/tt) mangan sulfat (MnSO4) để giúp thúc đẩy hình thành nha bào Nhũ dịch vi sinh vật trải cho phủ kín bề mặt mơi trường cách cho vào bề mặt thạch vài viên bi thuỷ tinh vô khuẩn Đem ủ 370C (riêng với Bacillus cereus ủ 300C) ngày Dùng nước cất vô khuẩn rửa vi khuẩn mọc (chủ yếu nha bào) đem hồ lỗng tới nồng độ thích hợp, thí dụ khoảng 10 - 108 nha bào 1ml, đun cách thủy nhũ dịch nha bào nhiệt độ 70oC 30 phút Dùng test phiến kính để kiểm tra khả sống nha bào Xác định lượng nhũ dịch nha bào vào 100 ml mơi trường định lượng tạo vùng ức chế rõ ràng, sắc nét Nhũ dịch nha bào giữ lâu nhiệt độ 40C Các loại thử nghiệm Thử nghiệm hai liều ba liều Phương pháp khuếch tán Pha dung dịch chuẩn dung dịch thử: Dung dịch chuẩn nồng độ biết dung dịch thử coi xấp xỉ nồng độ dung dịch chuẩn Các dung dịch chuẩn thử ban đầu pha vào dung mơi thích hợp để dung dịch gốc Sau pha lỗng dung dịch gốc dung môi dung dịch đệm vô khuẩn đến nồng độ thích hợp, có pH thích hợp cho loại kháng sinh ( xem bảng 2) Để xác định hiệu lực kháng sinh, dùng ba liều khác chuẩn (S1, S2, S3) mang so sánh với ba liều khác thử (U1, U2, U3) có hoạt lực coi dung dịch chuẩn Nồng độ pha theo cấp số nhân, thí dụ pha loạt độ pha loãng theo tỷ lệ : : Nếu quan hệ logarit nồng độ kháng sinh đường kính vùng ức chế gần thẳng với hệ số dùng dùng định lượng thường xuyên cách dùng hai nồng độ chuẩn (S1, S2) hai nồng độ thử (U1, U2) - Thử nghiệm hai liều Trong trường hợp có tranh chấp bắt buộc phải sử dụng định lượng ba liều Chuẩn bị cấy truyền Các thử nghiệm tiến hành đĩa Petri khay phẳng Đổ vào hộp Petri khay môi trường thích hợp cấy truyền chủng thị thích hợp cho kháng sinh Lớp môi trường thường có độ dày - mm (riêng với amphotericin B nystatin độ dày - mm, bleomycin, mithramycin độ dày - mm) Thạch dinh dưỡng đổ thành lớp hai lớp (gồm lớp khơng có vi khuẩn lớp gieo cấy), nên chọn nồng độ nhũ dịch cấy vào môi trường cho tạo vùng ức chế sắc nét tương ứng với liều lượng kháng sinh Dùng nhũ dịch chủng thị chế tạo phần trên, thường cấy vào môi trường với nồng độ ml chủng cho 100 ml môi trường thích hợp Khi nhũ dịch chủng loại khơng có nha bào, thường phải cấy vào mơi trường thạch đun chảy hoàn toàn để nguội đến 45 - 500C Trường hợp nhũ dịch chủng nha bào, nhiệt độ cho phép cấy tối đa 65 - 700C Dùng lượng thích hợp mơi trường cấy chủng thị, rót cách vơ khuẩn vào đĩa petri khay kính (trên đĩa thạch khay có thạch khơng tuỳ theo u cầu) để lớp mơi trường có độ dày thích hợp, dàn trải nhanh đậy nắp Trong đợi thạch đơng đặc, đặt khay kính hộp petri kính để tạo mặt phẳng giúp cho mơi trường khay hộp có độ dày đồng Những môi trường chuẩn bị để khơ nhiệt độ phòng 30 phút trước sử dụng (riêng colistin colistin sulfomethat natri, đĩa petri khay kính cấy truyền phải để tủ lạnh 40C vài giờ) Tiến hành thử: Đối với thử nghiệm liều, dùng ống trụ vô khuẩn đặt lên mặt thạch cấy truyền hộp petri (với thử nghiệm liều dùng ống trụ cho hộp) Có thể thay ống trụ cách dùng dụng cụ đục lỗ tiệt khuẩn, đục vào môi trường thạch để tạo lỗ thạch đường kính - mm (hoặc thay khoanh giấy tẩm kháng sinh) Phân phối dung dịch thử nghiệm chuẩn mẫu thử hộp Petri hay khay vuông cho phù hợp với kiểu bố trí thí nghiệm chọn (xem phụ lục 13.10) Việc bố trí ống trụ, lỗ khoan, khoanh giấy mặt thạch phải cho vùng ức chế không bị trùm lên Dùng pipet nhỏ vào ống trụ, lỗ thạch lượng dung dịch kháng sinh Nếu dùng khoanh giấy phải tiêu chuẩn hố trước thể tích xác chất lỏng cho khoanh giấy Giữ hộp petri khay nhiệt độ phòng khoảng - tuỳ theo đặc tính kháng sinh Đối với kháng sinh nhạy cảm với nhiệt độ, phải giữ nhiệt độ 40C để khuếch tán kháng sinh vào môi trường xẩy chậm làm giảm đến mức tối thiểu hiệu biến đổi theo thời gian dung dịch khác Đối với colistin colistin sulfomethat natri nên để - nhiệt độ phòng trước ủ Các hộp Petri khay sau thời gian để khuếch tán, mang ủ nhiệt độ thích hợp cho kháng sinh riêng (bảng 2) Nhiệt độ ủ phải kiểm tra để khoảng nhiệt độ chênh lệch so với quy định khoảng 0,50C Thời gian ủ thường kéo dài 16 - 18 Dùng dụng cụ đo có độ xác tối thiểu 0,1mm, đo đường kính vùng ức chế tạo nồng độ khác chuẩn thử Kiểm tra tính có giá trị định lượng, tính hoạt lực giới hạn tin cậy hoạt lực kháng sinh theo phụ lục 13.10 Phương pháp đo độ đục Pha dung dịch thử nghiệm chuẩn mẫu thử Dung dịch dịch thử nghiệm chuẩn mẫu thử pha dung mơi thích hợp pha lỗng dung dịch đệm phosphat có pH thích hợp cho kháng sinh theo dẫn bảng Để đảm bảo giá trị hiệu lực phép thử, làm thử nghiệm liều thích hợp Pha song song độ hồ loãng gồm liều chuẩn (S1, S2, S3) liều thử (U1, U2, U3) Chế tạo canh thang để cấy truyền Để có độ đục thích hợp dùng dịch cấy truyền, pha dịch cấy truyền mô tả phần chế tạo nhũ dịch cấy truyền dùng Chủng thị điều kiện thử nghiệm kháng sinh sử dụng phương pháp ghi bảng Tiến hành Các ống nghiệm xếp thành nhóm, nhóm - ống, thêm vào ống ml dung dịch độ pha loãng dung dịch chuẩn mẫu thử Đặt ống nghiệm vào giá ống nghiệm theo quy tắc ngẫu nhiên theo khối theo hình vng latinh Trong giá có ống dùng kiểm tra không thêm kháng sinh, ống chứa ml dịch pha lỗng, ống chứa ml dịch pha loãng 0,5 ml dung dịch formaldehyd 12% (tt/tt) Thêm vào ống ml canh thang cấy truyền Đặt giá chuẩn bị xong vào tủ ấm cách thuỷ, giữ nhiệt độ thích hợp, khống chế nhiệt độ mức sai số 0,50C so với nhiệt độ cần ủ (theo bảng 2) - Sau ủ, làm ngừng phát triển vi khuẩn cách thêm vào ống 0,5 ml dung dịch formaldehyd 12% (tt/tt) trừ ống kiểm tra thêm formaldehyd 12% trước nhúng giá có ống nghiệm ủ vào nước sôi Lấy giá ống nghiệm khỏi nơi ủ, xác định độ truyền qua độ hấp thụ dung dịch máy đo quang 530 nm Kiểm tra tính có giá trị định lượng, tính hoạt lực giới hạn tin cậy hoạt lực kháng sinh theo phụ lục 13.10 Phương pháp đường chuẩn Hồ tan lượng cân xác chất đối chiếu chất chuẩn sinh học kháng sinh cho dung mơi thích hợp, phải làm khơ trước Pha lỗng với dung mơi qui định để dãy chuẩn có nồng độ Tỷ lệ tăng nông độ nên 1: 1,25 (xem hướng dẫn bảng 2) Tiến hành Khi tiến hành xây dựng đường chuẩn, khảo sát 12 hộp Petri Khi xác định hàm lượng kháng sinh dùng hộp Petri Đổ vào hộp Petri 21 ml môi trường đun chảy, đợi thạch đơng cứng lại tạo thành lớp có độ dày đồng bề mặt phẳng để làm (Riêng với amphotericin B, nystatin khơng dùng lớp nền) Đối với bleomycin, cycloserin, mithramycin mytomycin dùng 10 ml làm lớp Lớp nuôi cấy dùng ml cho hộp, đổ láng sau lớp đông cứng, đặt lên mặt thạch đĩa ống trụ thép không rỉ ống chất liệu khác quy định phần dụng cụ Các ống trụ tạo thành hình lục giác cách tâm khoảng 2,8 cm Chia 12 hộp Petri để xây dựng đường chuẩn thành nhóm, nhóm hộp Dung dịch có nồng độ trung gian lấy làm nồng độ kiểm tra dùng hiệu chỉnh giá trị đo nhóm Đổ đầy dung dịch kiểm tra vào ống trụ, bố trí xen kẽ hộp Petri Các ống trụ lại đổ đầy dung dịch có nồng độ nhóm Sau ủ hộp nhiệt độ thích hợp 32 - 350C (theo dẫn bảng 2) khoảng 16 - 18 đo giá trị đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ kiểm tra theo nhóm Tổng số nhóm đo 36 giá trị đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ kiểm tra Độ xác kết đo 0,1 mm Cách tính Giá trị trung bình đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ a, b, d, e; giá trị trung bình đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ kiểm tra nhóm hộp (9 kết quả) Ca, Cb, Cd, Ce giá trị trung bình đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ kiểm tra tất 12 hộp (ký hiệu C), gồm 36 kết So sánh giá trị trung bình đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ kiểm tra nhóm với giá trị trung bình đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ kiểm tra 12 hộp(C) Hiệu chúng (C - Ca; v v ) số hiệu chỉnh dùng để điều chỉnh giá trị trung bình đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ nhóm Cộng đại số giá trị hiệu chỉnh đạt vào giá trị trung bình đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ nhóm ta giá trị trung bình đường kính vòng vơ khuẩn hiệu chỉnh nồng độ a, b, d, e Thí dụ: Giá trị trung bình đường kính 36 vòng vơ khuẩn nồng độ kiểm tra tính 19,2 mm; giá trị trung bình đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ kiểm tra nhóm nồng độ a Ca = 19,0 mm Số hiệu chỉnh 19,2 - 19,0 = 0,2 mm Giá trị trung bình đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ nhóm 17,9 mm Vậy giá trị trung bình đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ nhóm sau hiệu chỉnh a = 17,9 + 0,2 = 18,1 mm Trên hai chu kỳ giấy bán logarit vẽ đường chuẩn qua điểm giá trị trung bình hiệu chỉnh Trên trục tung (chia theo thang logarit) lấy nồng độ kháng sinh àg đơn vị hoạt lực ml Trên trục hoành (chia theo thang số học) lấy giá trị đường kính vòng ức chế Như đường chuẩn vẽ qua điểm tương ứng với giá trị đường kính vòng ức chế cao thấp tính phương trình sau: 3a + 2b + C e L = 3e + 2d + C a H = L: Đường kính vòng vơ khuẩn tính cho nồng độ thấp đường chuẩn H: Đường kính vòng vơ khuẩn tính cho nồng độ cao đường chuẩn C: Đường kính trung bình 36 kết nồng độ kiểm tra a, b, d, e: Những giá trị đường kính trung bình hiệu chỉnh cho dung dịch lại xếp theo thứ tự từ nồng độ thấp tới nồng độ cao Ba hộp Petri dùng cho mẫu thử nghiệm tiến hành đồng thời xây dựng đường chuẩn Trong ba hộp nhỏ xen kẽ nồng độ trung gian dung dịch chuẩn với nồng độ mẫu thử pha loãng với dung dịch đệm thích hợp để có nồng độ giả định tương đương nồng độ trung gian chuẩn Sau đo đường kính vòng vơ khuẩn mẫu thử, tính trung bình hiệu chỉnh theo giá trị đường kính nồng độ trung gian đường kính chế phẩm thử Trên trục hồnh ứng với giá trị đường kính vừa tìm mẫu thử, kẻ đường vng góc với trục hoành cắt đường đường chuẩn vừa vẽ điểm từ điểm đường chuẩn hạ vng góc với trục tung tìm giá trị nồng độ ứng với đường kính mẫu thử Hoạt lực chế phẩm tính phần trăm so với chuẩn theo cơng thức sau: Hoạt lực tìm thấy chế phẩm 100 R% = Hoạt lực tìm thấy nồng độ trung gian