Báo cáo TH CNLM-MT 41460,236 20 4,72 0,673 0- 123docz.net

5 8 24 0,248 40 9,92 0,997 0.0414 6 12 28 0,309 40 12,36 1,092 0.0546 7 16 32 ,300 40 12 1,079 -0.007 8 20 36 0,359 40 14,36 1,157 0.0449

Hình 3.1 Đồ thị theo dõi thông số động học nuôi cấy chìm của Bacilluas

subtilis.

II.2.4 Sản xuất sinh khối bằng phương pháp lên men chìm

- Chuẩn bị môi trường lên men chính ,238 ml/nhóm, cấy 12ml/mẫu.Lắc 150,250 vòng/phút, khoảng 48-72 giờ.

- Khảo sát ảnh hưởng của oxy lên sự tổng hợp sinh khối ( cooper et al, 1944) - Hóa chất:

+Dung dịch thiosulfat 0.1 N (Na2S2O3) đã hiệu chỉnh nồng độ +Dung dịch tinh bột 1%

+Dung dịch iod 0.1 N mới pha chế

+Dung dịch sulfit (Na2SO3) 0.8 N chứa CuSO4 (0.001 M) - Nguyên tắc:

Mức độ thông khí được đánh giá một cách gián tiếp bằng phương pháp sulfit.Phương pháp dựa trên cơ sở của việc xác định tốc độ oxy hóa sulfit thành

Báo cáo TH CNLM-MT

sulfat khi có mặt của chất xúc tác là đồng. Lượng sulfit dư sẽ phản ứng với iod. Lượng iod dư sẽ được chuẩn độ bằng thiosulfat.

Na2SO3 + ½ O2 Na2SO4

4Na2SO3 + I2 3Na2SO4 + 2NaI

I2 + 2Na2S2O3 NaI + 2Na2S4O6

Như vậy oxy hòa tan nhiều thì tương đương thể tích thiosulfat chuẩn độ sẽ lớn. - Tiến hành

Xác định thể tích dung dịch iod cần thiết cho thí nghiệm

- Cho dung dịch iod 0.1N từ burette chảy dần vào bình tam giác 250 ml chứa 5 ml dd Na2SO3 mới pha chế cho đến khi xuất hiện màu nâu sáng,ghi nhận thể tích iod a.

- Thêm 0.5 ml dung dịch tinh bột 1% vào và chuẩn độ bằng thiosulfat cho đến khi mất màu xanh lam(1-3 ml thiosulfat 0.1 N)

- Cho α ml dung dịch I2 0.1N vào bình tam giác 250 ml, chuẩn độ bằng thiosulfat như trên ( chỉ thị tinh bột vào ở giai đoạn cuối ) đến khi mất màu- V thiosulfat khoảng 30-40 ml là được .

Xác định trị số sulfit trước và sau khi thông khí

- 5 ml sulfit cho vào bình tam giác 250 ml chứa sẵn a ml iod. Đậy bình bằng nắp kính để vào chỗ tối 5-10 phút, sau đó dùng nước cất tráng kính đậy, thu hết nước rửa vào bình tam giác trên, chuẩn độ dịch chứa bằng thiosulfat 0.1N. Thể tích thiosulfat chuẩn độ là PN ml.

- Bình tam giác thể tích như bình nuôi cấy, thay môi trường bằng dung dịch sulfit cùng thể tích, được đặt vào máy lắc trong một thời gian xác định ( thời gian chính xác đến hàng phút ).Trước khi dừng máy lắc 15-20 phút, rót α ml dung dịch iod vào bình 250 ml. Lúc dừng máy lắc, lấy 5 ml dung dịch sulfit từ các bình đã lắc cho ngay vào bình chứa sẵn α ml dd I2. Tiếp tục lắc bình nuôi cấy.Trong khi đó, giữ các bình lấy mẫu trong tối và đem

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương trang 28

Báo cáo TH CNLM-MT

chuẩn độ bằng thiosulfat 0.1 N như trên,ghi nhân Px1 là thể tích thiosulfat chuẩn độ.

- Sau 20 phút lắc, lập lại bước lấy mẫu và chuẩn độ như trên, ghi nhận Px2 là thể tích thiosulfat chuẩn độ.

 Độ hòa tan oxy trong dung dịch sulfit tính theo công thức :

mg O2/l/phút = (PX-PN)/T *0.8*  Tính Toán trị số sulfit

Bảng 3.4. Lượng oxy xâp nhật vào dung dịch sulfit

PN = 1 ml; = 35,7 ml

Chế độ lắc

(ml) mg O2/l/phút TB (mg O2/l/phút) (0,05 N) (0,1N) 150 vòng/phút = 7,2 = 3,6 6,93 = 10,3 = 5,15 5,53 250 vòng/phút = 11 = 5,5 9 9,1 = 11,25 = 5,6 9,2

Bảng 3.5. Lượng sinh khối thu được của 2 chế độ lắc

Chế độ lắc OD1 OD OD2 HSPL(lần) OD1 ODhc OD2 ODTB

150 0,335 0,313 60 20,1 18,78 19,44

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương trang 29 a ml I2

5 ml Sulfit

Chuẩn độ Bằng thiosulfat

Báo cáo TH CNLM-MT

Vòng/phút 250

Vòng/phút 0,371 0,370 45 16,695 16,65 16,67

 Số liệu từ hai bảng cho ta thấy rằng ở chế độ lắc 150 vòng/phút với lượng oxy xâm nhập 6,23 mg/l/phút cho lượng sinh khối (ODTB = 22,23) cao hơn chế độ lắc 250 vòng/phút, không có sự thay đổi về độ tuổi của tế bào.

 Vậy chọn chế độ lắc 150 vòng/phút cho quá trình lên men thu sinh khối

Bacilluas subtilis ở dạng lỏng (lên men chìm).

II.2.6 Downstream processing

- Ly tâm 4000 vòng/phút x 15 phút ,rửa sinh khối bằng nước vô trùng 3 lần, hòa bào tử vào nước muối sinh lý vô trùng đến thể tích bằng 1/10 thể tích trước ly tâm.

II.2.7 Tạo chế phẩm

- Sử dụng giấm ăn ( acid acetic ) 20% đưa PH về 3.8 – 4.2 - Bảo quản nhiệt độ thường.

II.2.8 Phân tích chế phẩm

- Pha loãng,trung hòa bằng NaOH 1M,đỗ đĩa trên môi trường kiểm định,phải đạt 109 – 1010 cfu/ml

- Hoạt tính enzyme: trên môi trường đổ đĩa sau khi đếm khuẩn lạc, tráng đĩa bằng dung dịch Lugol, quan sát vòng trắng xung quanh khuẩn lạc, nếu kết quả (+); có khả năng phân hủy tinh bột; ngược lại: không có khả năng.

II.2.9 Ứng dụng của chế phẩm Nguyên tắc:

Chế phẩm lỏng : trung hòa bằng NaOH trước khi sử dụng

Lượng bào tử trong chế phẩm lỏng bằng trong chế phẩm rắn ( lên men bề mặt ) khi cho vào nước thải.

Nước thải đưa về PH=7.0

Báo cáo TH CNLM-MT

Lắc trong cùng một điều kiện 150 vòng/phút. Đo COD ghi bảng 3.6

Bảng 3.6 COD mẫu thí nghiệm ứng dụng

Đối chứng

(không bổ sung bào tử)

TN1

(bổ sung bào tử chế phẩm lỏng)

TN2

(bổ sung bào tử chế phẩm rắn)

II.2.10 Sản phẩm sinh khối bằng phương pháp lên men bề mặt

Bảng 3.7 Thành phần môi trường thu sinh khối bào tử bằng lên men thể rắn(mt len men chính)

Thể tích cấy giống 15 ml

Cám gạo 250 g/bao (độ ẩm 6%) Dung dịch dinh dưỡng

50 ml

Pepton 25 g/kg Cao thịt 10 g/kg KH2PO4 10 g/kg CaO 5 g/kg

Độ ẩm 65% Lượng nước bổ sung

Chuẩn bị 4 bịch nilon môi trường như bảng 3.5. Tính lượng nước bổ sung sao cho độ ẩm môi trường 65%. Hấp 1210C trong 30 phút. Cấy 15 ml giống.Lắc đều. Ủ nhiệt độ phòng hoặc 320C, 48 giờ. Sấy 40-450C.

Lượng nước cần thêm vào để đạt độ ẩm 65% là:

= 0,65  x = 1514 ml nước. Lượng nước thêm vào mỗi bịch là: 1514/4 = 379 ml

Vậy lượng nước cần thêm vào mỗi bịch để đạt độ ẩm 65% là 379 ml nước. Tiến hành phân tích thử nghiệm

Báo cáo TH CNLM-MT

II.3 Kết quả,tính toán

Bảng 3.8 Tóm tắt các thông số động học.

Thông số Đơn vị Giá trị xác định,tính

toán

tlag Phút 120 (8:10h) (0 : 2h nuôi

cấy)

Tlog Phút 120 (10:12h) (2:4h nuôi

cấy)

µmax 1/phút 0.2556

Td Phút 21.56

ODo 2.88

OD Cfu/ml

Ảnh hưởng oxy hòa tan đến sinh khối nuôi cấy chìm

Thống số Lắc 150 vòng/phút Lắc 250 vòng/phút

Oxy mg/l 6.9 (60 phút) 9.1 (80 phút)

ODo 19,44 16,67 OD 24h OD 48h OD 72h Soi kính 24h Soi kính 48h Soi kính 72h Thể tích sản phẩm Nồng độ bào tử Hiệu quả xử lý

Bảng 3.9 Thông số lên men bề mặt

Thống số Đơn vị Giá trị xác định,tính toán Khối lượng mẫu

trước lên men

g Khối lượng mẫu

sau lên men

g B1: 0.660 kg

B2: 0.657 kg B3: 0.655 kg

Báo cáo TH CNLM-MT

B4: 0.656 kg

Mật độ bào tử 6.35.1011

Hoạt tính enzyme Có/không Hiệu quả xử lý

Báo cáo TH CNLM-MT

II.3 Kết luận:

- Trong sản xuất chế phẩm lỏng ở 2 chế độ lắc thì không có sự khác biệt về độ tuổi của tế bào, ở chế độ lắc 150 vòng/phút cho mật độ tế bào (đo bằng OD) cao hơn chế độ lắc 250 vòng/phút.

- Quá trình thực hành do thời gian không đủ nên chỉ tạo được chế phẩm rắn.

• Đặc điểm hình thái của Bacillus subtilis: Tế bào vi khuẩn B.subtilis có hình que, dài, bào tử hình ovan nằm ở xa tâm hay gần tâm có khuynh hướng phình ra ở một đầu, bắt màu tím khi nhuộm Gram  B.subtilis là vi khuẩn Gram dương.

- Quá trình nhuộn bào tử tế bào bắt màu đỏ tế bào bacillus subtilis bắt màu xanh.

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương trang 34

Hình 3.2. hình thái tế bào bacillus Soi kính 24h: tế bào gram âm có màu xanh tím