MỞ ĐẦU Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao đã và đang được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực y dược, nông nghiệp và đời sống. Một trong những hướng nghiên cứu quan trọng hiện nay được nhiều nhà khoa học nước ta và trên thế giới rất quan tâm là: Từ các hợp chất thiên nhiên ban đầu người ta bán tổng hợp, thay đổi cấu trúc hoá học của chúng để tìm ra các hợp chất mới có hoạt tính và tính chất ưu việt hơn những hợp chất ban đầu. Đó là một trong những con đường khá hiệu quả và kinh tế để tìm ra các loại thuốc mới chữa bệnh cho người, gia súc và cây trồng. Piperazinedion là lớp cấu trúc phổ biến nhất được tìm thấy trong tự nhiên, có nhiều hoạt tính sinh học quý như: Tryprostatins A (1) và B (2) có hoạt tính ức chế khối u [78,79], Cyclotryprostatin A-D (3-6) có hoạt tính ức chế chu kỳ phát triển tế bào động vật có vú [80], Fumitremorgin C (7) là một chất ức chế BCRP/ABCG2 làm kháng trung gian trong hóa trị liệu để điều trị ung thư vú [83], phenylahistin (8) có hoạt tính ức chế trùng hợp tubulin [50,51]... chúng là những hợp chất tiềm năng để phát triển các loại thuốc chống ung thư. Ngoài ra các hợp chất piperazinedion còn có hoạt tính sinh học khác như: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virut... (bicyclomycin (9); roquefortin C (10)...) [1,75]. Tadalafil (11) là một hợp chất tổng hợp quan trọng có khung piperazinedion có khả năng ức chế enzym PDE5, nên được sử dụng làm thuốc trong điều trị rối loạn sinh lý nam giới và còn được sử dụng để điều trị bệnh tăng huyết áp động mạch phổi [42-44]. Đây là thuốc sắp hết hạn quyền bảo hộ nên được nhiều quốc gia trên thế giới quan tâm nghiên cứu tổng hợp, nhằm ứng dụng vào sản xuất thương mại. Bên cạnh đó, khung piperazinedion còn là các synthon quan trọng được sử dụng trong tổng hợp toàn phần và bán tổng hợp nhiều hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học mạnh như saframycin và eteinascindin… [22, 110]. Do có nhiều hoạt tính sinh học lý thú, việc nghiên cứu tổng hợp các hợp chất piperazindione nhằm tìm kiếm các hợp chất mới có hoạt tính sinh học được nhiều nhà khoa học quan tâm. Do đó đề tài Nghiên cứu tổng hợp các hợp chất piperazinedion” rất có ý nghĩa khoa học và thực tiễn.
MỞ ĐẦU Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao sử dụng rộng rãi lĩnh vực y dược, nông nghiệp đời sống Một hướng nghiên cứu quan trọng nhiều nhà khoa học nước ta giới quan tâm là: Từ hợp chất thiên nhiên ban đầu người ta bán tổng hợp, thay đổi cấu trúc hoá học chúng để tìm hợp chất có hoạt tính tính chất ưu việt hợp chất ban đầu Đó đường hiệu kinh tế để tìm loại thuốc chữa bệnh cho người, gia súc trồng Piperazinedion lớp cấu trúc phổ biến tìm thấy tự nhiên, có nhiều hoạt tính sinh học quý như: Tryprostatins A (1) B (2) có hoạt tính ức chế khối u [78,79], Cyclotryprostatin A-D (3-6) có hoạt tính ức chế chu kỳ phát triển tế bào động vật có vú [80], Fumitremorgin C (7) chất ức chế BCRP/ABCG2 làm kháng trung gian hóa trị liệu để điều trị ung thư vú [83], phenylahistin (8) có hoạt tính ức chế trùng hợp tubulin [50,51] chúng hợp chất tiềm để phát triển loại thuốc chống ung thư Ngoài hợp chất piperazinedion có hoạt tính sinh học khác như: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virut (bicyclomycin (9); roquefortin C (10) ) [1,75] Tadalafil (11) hợp chất tổng hợp quan trọng có khung piperazinedion có khả ức chế enzym PDE5, nên sử dụng làm thuốc điều trị rối loạn sinh lý nam giới sử dụng để điều trị bệnh tăng huyết áp động mạch phổi [42-44] Đây thuốc hết hạn quyền bảo hộ nên nhiều quốc gia giới quan tâm nghiên cứu tổng hợp, nhằm ứng dụng vào sản xuất thương mại Bên cạnh đó, khung piperazinedion synthon quan trọng sử dụng tổng hợp toàn phần bán tổng hợp nhiều hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học mạnh saframycin eteinascindin… [22, 110] Do có nhiều hoạt tính sinh học lý thú, việc nghiên cứu tổng hợp hợp chất piperazindione nhằm tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học nhiều nhà khoa học quan tâm Do đề tài Nghiên cứu tổng hợp hợp chất piperazinedion” có ý nghĩa khoa học thực tiễn CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 HỢP CHẤT PIPERAZINEDION 1.1.1 Giới thiệu chung Piperazinedion (diketopiperazin) vòng dipeptit thu cách ngưng tụ hai α-amino axít Các hợp chất có nhiều tự nhiên sản phẩm thoái hóa polypeptit, đặc biệt chế biến thực phẩm đồ uống Các tiểu đơn vị thường tìm thấy riêng rẽ gắn vào cấu trúc lớn hơn, phức tạp loạt hợp chất tự nhiên phân lập từ: nấm, địa y, vi khuẩn, thực vật động vật có vú.[1] Hình 1.1: Hợp chất piperazinedion đơn giản Các hợp chất piperazinedion không lớp cấu trúc phổ biến tự nhiên mà có khả liên kết với phạm vi rộng với thụ thể Nhờ tính chất piperazinedion đối tượng cho việc nghiên cứu phát triển thuốc Cấu trúc piperazinedion đơn giản khung dị vòng cạnh, đưa nhóm vào sáu vị trí khác kiểm soát lập thể lên tới bốn vị trí [1] Các hợp chất tự nhiên có chứa nhiều vòng piperazinedion nghiên cứu nguồn gốc, phân lập tổng hợp từ năm 1975 Cho đến năm 1990, hợp chất hóa học tính chất dược lý vòng piperazinedion xem xét nghiên cứu Đến năm 1993, trình tổng hợp, tính chất vật lý, phản ứng hóa học ứng dụng lớp chất công bố [1] 1.1.2 Cấu trúc cấu hình Các tinh thể cấu trúc phân tử piperazinedion nghiên cứu kỹ lưỡng, phân tử lớp chất đơn giản vòng peptit Chúng chứa liên kết cis-amit, kết có vị trí nhận liên kết H vị trí cho liên kết H quan trọng để liên kết với enzym thụ thể [76] Sự đa dạng phong phú cấu trúc có chứa khung piperazinedion kết sáu vị trí linh động, nhóm thêm vào bốn vị trí mà cấu hình lập thể chúng kiểm soát Các piperazinedion phân tử nửa cứng, chúng có cấu hình dị vòng ràng buộc, chúng linh hoạt mạch vòng sáu cạnh tồn cấu hình phẳng cấu hình thuyền, khác biệt vài kcal/mol lượng hai cấu hình [76] Hình 1.2: Cấu hình số piperazinedion đơn giản Cấu hình vòng piperazinedion không (Gly-Gly) (16, R = H) đối tượng nhiều nghiên cứu Cấu trúc tinh thể vòng (Gly-Gly) lần chứng minh Corey vào năm 1938 chứng minh phẳng trạng thái rắn Bằng phương pháp cộng hưởng từ (NMR) nghiên cứu vòng (Gly-Gly) đưa chi tiết pha lỏng phù hợp với hai cấu trúc phẳng nhanh chóng chuyển thành cấu trúc thuyền Gần đây, phân tích quang phổ dao động tính toán lý thuyết phiếm hàm mật độ (DFT) phù hợp với ý kiến cho vòng (Gly-Gly) có cấu hình phẳng trạng thái lỏng rắn Một nghiên cứu từ chi tiết quang phổ vi sóng vòng (Gly-Gly) thể khí cho thấy phân tử trạng thái tách riêng không cấu trúc phẳng giống kết luận phương pháp X-Ray dáng thuyền Điều chứng minh từ đầu tính toán phổ dao động điện tử vòng (Gly-Gly) pha khí, cấu hình dạng thuyền (15, R = H) xác định cấu trúc có lượng thấp cấu trúc phẳng (16, R = H) tìm thấy trạng thái chuyển tiếp (hình 1.2) Sự khác biệt lượng dạng cấu hình dạng thuyền phẳng tìm thấy nhỏ (khoảng 1,3-1,7 kcal/mol), điều cho thấy lực bên từ môi trường tinh thể lỏng đủ để hình thành cấu trúc phẳng Điều cho cis-piperazinedion hai lần đối xứng Một nghiên cứu hóa học lượng tử hệ thống gần 20 chất số cho thấy cấu trúc lượng thấp dạng thuyền, môi trường không bị hạn chế lực tinh thể Hầu hết cấu trúc tinh thể biết có 2, nhóm Một số nghiên cứu dung dịch trạng thái rắn vòng piperazinedion hợp chất cis- lần cis- lần thường dạng thuyền vặn thuyền, đặc biệt nhóm nhóm arylmetyl (17) Điều xác nhận gần cấu trúc X-ray cho piperazinedion 2, lần vòng (L-MetL-Met), vòng (L-Asp-L-Asp), vòng (L-Glu-L-Glu) vòng (L-Ala-L-Ala)… 1.1.3 Hoạt tính sinh học Có nhiều chất có hoạt tính sinh học chứa khung piperazinedion bắt nguồn từ hợp chất tự nhiên tổng hợp Những phân tử nhỏ, có cấu hình cứng nhắc khung bất đối có chức chất nhận chất cho liên kết H, có nhiều vị trí cho phát sinh cấu trúc nhóm chức đa dạng với lập thể xác định Những đặc điểm cho phép chúng liên kết lực cao với nhiều thụ thể, thể đa dạng hoạt tính sinh học Từ cho phép phát triển tính chất hóa lý cần thiết thuốc, trình tối ưu chất dẫn đường thành thuốc 1.1.3.1 Hoạt tính ức chế ung thƣ Trên giới có nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp tách chiết dẫn xuất piperazinedion nhân tryptophan-prolin piperazinedion công bố như: tryprostatin A B, fumitremorgin C, spirotryprostatin A B, cyclotryprostatin AD, hợp chất ban đầu cho phát triển loại thuốc chống ung thư Năm 1995, Cheng-Bin Cui cộng phân lập tryprostatin A (1) B (2) (hình 1.3) từ chủng nấm biển Aspergillus fumigatus có hoạt tính kháng u mạnh Tryprostatin B chất ức chế chu kỳ tế bào động vật có vú, tryprostatin A chất ức chế protein kháng đa thuốc (BCRP/ABCG2) hóa trị liệu điều trị ung thư vú [77,79] Tryprostatin A B ức chế hoàn toàn chu kỳ phát triển tế bào tsFT210 giai đoạn G2/M nồng độ tương ứng 50µg/ml 12,5µg/ml [77] Hình 1.3: Các hợp chất tryprostatin Cũng năm đó, Osada cộng phân lập thành công Fumetrimorgin C Demetoxyfumetrimorgin C (hình 1.4) từ chủng nấm Aspergillus fumigatus, hợp chất dẫn xuất vòng tryprostatin A (1) chất ức chế protein đa kháng thuốc (BCRP/ABCG2) hóa trị liệu điều trị ung thư vú [83] Hình 1.4: Chất ức chế BCRP fumitremorgin Fumitremorgin C (7) demetoxifumitremorgin C (19) chất ức chế mạnh chọn lọc vận chuyển đa thuốc (BCRP/ABCG2) Nó ức chế hoàn toàn làm đảo ngược đối kháng BCRP nồng độ μM Tuy nhiên, fumitremorgin C chất độc thần kinh, gây co giật chuột loài động vật khác thông qua độc tính với hệ thống thần kinh trung ương, không thử nghiệm in vivo So sánh Fumitremorgin C demetoxi-Fumitremorgin C cho thấy, nhóm 6-metoxi indol cần thiết, demetoxiFumitremorgin C không bão hòa hoạt động dẫn chất có mạch bên bão hòa [83] Năm 1997, Cheng-Bin Cui cộng phân lập hợp chất piperazinedion khác Cyclotryprostatin A-D (3-6) (hình 1.5) từ nấm Aspergillus fumigatus thăm dò hoạt tính sinh học chúng Kết cho thấy, hợp chất có tác dụng ức chế giai đoạn G2/M chu kỳ tế bào động vật có vú [80] Hình 1.5: Cấu trúc cyclotryprostatins A-D Các chất Cyclotryprostatin A-D thể hoạt tính kháng ung thư vú, chúng ức chế phát triển tế bào tsFT210 giai đoạn G2/M với giá trị IC50 tương ứng: 5,6µM (3); 19,5µM (4); 23,4µM (5) 25,3µM (6) Các chất sử dụng tốt hóa trị liệu ung thư cung cấp chứng hữu ích việc làm sáng tỏ chế chu kỳ tế bào [80] Trước vào năm 1996, Cheng-Bin Cui cộng phân lập hợp chất piperazinedion Spirotryprostatin A (20) B (21) (hình 1.6) từ chất chuyển hóa thứ cấp nấm Aspergillus fumigatus, có hoạt tính ức chế chu trình tế bào tác nhân chống khối u Hình 1.6: Cấu trúc spirotryprostatin A B Hoạt tính ức chế chu kì tế bào spirotryprostatin A B thử nghiệm tế bào tsFT210 chuột Spirotryprostatin A ức chế hầu hết phần tế bào tsFT210 pha G2/M với nồng độ 253,2 µM Trong spirotryprostatin B ức chế hoàn toàn tiến triển chu kỳ tế bào tế bào tsFT210 pha G2/M nồng độ 34,4µM [81,82] Cấu trúc phức tạp hoạt tính sinh học thú vị sản phẩm tự nhiên làm cho spirotryprostatin mục tiêu tổng hợp hấp dẫn Năm 2010, Alessia Bertamino cộng nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất Spirotryrostatin A để nhận dẫn xuất 22a-c, 23a-c, 24a-c (hình 1.7) thử hoạt tính sinh học chúng Kết cho thấy hợp chất hợp chất 22a, 23a-c có hoạt tính chống lại tế bào MCF-7 với giá trị IC50 9,1; 14,8; 1,6 2,2 µM [76] Hình 1.7: Cấu trúc dẫn xuất Spirotryprostatin A Một hợp chất có khung piperazinedion khác Phenylahistin (8) (Hình 1.8), phân lập từ Aspergillus ustus có khả gắn kết với microtubule, biểu hoạt tính gây độc tế bào chống lại loạt dòng tế bào khối u ngưỡng nM [50,51] Ngược lại, đồng phân đối quang R biểu hoạt tính gây độc tế bào thấp hợp chất tương tự có nhóm isopropyl (-)-aurantiamine (25) có hoạt tính thấp 40 lần việc chống lại phát triển tế bào P388 [52] Hình 1.8: Tác nhân ức chế trùng hợp Tubulin Một loạt dẫn chất 22 tổng hợp để loại bỏ tính bất đối tối ưu hóa hoạt tính sinh học Trong đó, hợp chất có nhóm tert-butyl plinabulin (NPI2358/KPU-2) (26), chất kháng u mạnh, hoạt tính thể nhiều dòng tế bào khối u [52] Hiện nay, plinabulin giai đoạn II thử nghiệm lâm sàng để điều trị ung thư [54] 1.1.3.2 Hoạt tính ức chế PDE5 Nhóm thuốc uống có tác dụng giãn mạch gồm có sildenafil (27), vardenafil (28) tadalafil (11) (hình 1.9), gọi chung thuốc ức chế PDE-5 (enzym phosphodiestease-5) tạo nên bước tiến chữa trị rối loạn cương dương [94,95] Cơ chế tác dụng nhóm thuốc ức chế enzym PDE-5 có nhiệm vụ phân hủy chất sinh học nitric oxit (NO) guanosin monophosphat vòng (cGMP) Rối loạn cương dương PDE-5 hoạt động mạnh dẫn đến NO cGMP bị phân hủy không giúp giãn mạch cần thiết giúp cho cương Thuốc ức chế PDE-5 giúp bảo vệ trì chất sinh học tạo cương [86-88,89-93] Tadalafil hợp chất piperazinedion tổng hợp toàn phần, dược phẩm thương mại có tên Cialis thuốc sử dụng nhiều nước Nó có ưu điểm thời gian tác dụng dài, có đến 36 Cơ chế tác dụng tadalafil ức chế chọn lọc có hồi phục guanosin monophosphat vòng (cGMP), đặc biệt enzym Phosphodiestease týp (PDE-5) Khi có kích thích tình dục dẫn đến phóng thích Nitric oxit chỗ, ức chế PDE-5 tadalafil làm tăng nồng độ cGMP thể hang dẫn tới làm giãn trơn làm tăng lưu lượng máu vào mô dương vật, từ gây cương dương vật [86-88] Khi kích thích tình dục, tadalafil tác dụng Hình 1.9: Cấu trúc số hợp chất ức chế PDE-5 Ngoài tác dụng chữa rối loạn cương dương, tadalafil tên thương mại Adcirca sử dụng để điều trị tăng huyết áp động mạch phổi từ năm 2009 Tăng huyết áp động mạch phổi nguyên nhân gây bệnh suy tim Ở bệnh nhân tăng huyết áp động mạch phổi, lòng mạch máu phổi có giảm co mạch tái tạo mạch máu, dẫn đến tăng áp lực động mạch phổi Tadalafil có tác dụng giãn mạch động mạch phổi ức chế tái tạo mạch máu, làm giảm áp lực động mạch phổi [75,108,109] 1.1.3.3 Hoạt tính ức chế hócmôn oxytoxin Trong nhiều thập kỷ qua, chất ức chế hócmôn oxytoxin tiêm tĩnh mạch atosiban (Tractocile) đưa vào điều trị cấp tính cho ca dọa sinh non Do đó, có quan tâm đến chất ức chế hócmôn oxytoxin nhà nghiên cứu việc tìm kiếm chất sử dụng đường uống có độ chọn lọc cao [46] Từ trình sàng lọc, nhà nghiên cứu xác định hợp chất piperazinedion hợp chất Retosiban (29), Epelsiban (30) (hình 1.10) chất ức chế hócmôn oxytocin Hợp chất Retosiban sử dụng đường uống tốt có sinh khả dụng cao chuột (≈100%) Retosiban có lực ngưỡng nM (0,65nM) với hócmôn oxytocin đồng thời chọn lọc hócmôn vasopressin người Retosiban có độ tan tốt (>0,22 mg/ml), liên kết với protein thấp ( 100μM) thâm nhập vào thần kinh trung ương Retosiban có hiệu lực ức chế hócmôn oxytocin mạnh so với atosiban 15 lần Nó lựa chọn để điều trị lâm sàng cho ca dọa sinh non [47,48] Hình 1.10: Các chất đối kháng oxytoxin Trong đó, hợp chất Epelsiban có hoạt tính mạnh, sử dụng đường uống sinh khả dụng tốt khỉ đuôi dài Đánh giá in vitro thấy Epelsiban chất ức chế mạnh hócmôn oxytocin người có hoạt tính mạnh Atosiban 100 lần Ngoài ra, chất nghiên cứu với khả điều trị rối loạn chức tình dục, bao gồm xuất tinh sớm; điều trị phòng ngừa tăng sản tuyến tiền liệt lành tính [49] 1.1.3.4 Hoạt tính ức chế hoạt hóa Plasminogen Các 3,6-didehydropiperazinedion (hình 1.11) chứng minh để khử hoạt tính hoạt động chống phân hủy protein (antiproteolytic) tác nhân ức chế hoạt hóa Plasminogen (PAI-1) serpin, mục tiêu điều trị tiềm bệnh ung thư bệnh tim mạch [55] Hình 1.11: Tác nhân ức chế hoạt hóa Plasminogen 3,6-Didehydropiperazinedion (31) phân lập từ trình lên men Streptomyces sp đảo ngược tác dụng ức chế tác nhân ức chế hoạt hóa Plasminogen (PAI-1) chống lại chất hoạt hóa mô plasminogen (tPA) chất hoạt 10 Hình 3.31: Phổ 13C-NMR hợp chất piperazinedion 130i Sau đó, hợp chất 130i axyl hóa nhóm NH nhờ phản ứng với anhidrit axetic có mặt pyridin nhận dẫn xuất axyl hóa 130j Sơ đồ 3.44: Tổng hợp hợp chất piperazinedion 130j Cấu trúc 130j chứng minh phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cấu trúc khẳng định rõ ràng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR với xuất thêm pic cộng hưởng singlet proton nhóm axetyl 2,62 ppm 131 3H, Ac Hình 3.32: Phổ 1H-NMR hợp chất piperazinedion 130j Như vậy, luận án tổng hợp thành công 10 hợp chất piperazinedion 130a-j có khung hexahydropyrazin-[1,2b]-isoquinolin từ nguyên liệu đầu naphthalen-1,4-dion với hiệu suất cao Cấu trúc hợp chất chứng minh phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 3.7 TỔNG HỢP TADALAFIL Tadalafil piperazinedion tổng hợp toàn phần có khả ức chế enzym PDE-5 nên sử dụng làm thuốc điều trị rối loạn sinh lý nam giới sử dụng để điều trị bệnh tăng huyết áp động mạch phổi [42-44] Đây thuốc hết hạn quyền bảo hộ nên nhiều quốc gia giới quan tâm nghiên cứu tổng hợp, nhằm ứng dụng vào sản xuất thương mại Xây dựng qui trình tối ưu cho tổng hợp thuốc tadalafil nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Do đó, luận án nghiên cứu xây dựng qui trình tổng hợp tadalafil với qui mô 100g/mẻ nhằm tìm kiếm qui trình triển khai tổng hợp tadalafil có khả ứng dụng vào sản xuất 3.7.1 Tổng hợp hợp chất (1R,3R)-metyl 1-(3,4-metylendioxiphenyl)-2,3,4,9tetrahiđro-1H-pyrido[3,4-b]indol-3-carboxylat hydroclorua Bước chìa khóa qui trình tổng hợp tadalafil giai đoạn tổng hợp cis 102a thông qua phản ứng Pictet-Spengler từ hai nguyên liệu đầu metyl este Dtryptophan với piperonal (sơ đồ 3.45) Trong luận án đưa kết nghiên cứu điều kiện tối ưu để nhận đồng phân cis 102a với độ chọn lọc lập 132 thể cao hiệu suất tốt nhất, nhằm tìm kiếm điều kiện tốt cho qui trình phản ứng tổng hợp tadalafil qui mô 100g/mẻ Sơ đồ 3.45: Tổng hợp hợp chất 102 Trên sở công bố [108,109], lựa chọn dung môi cho phản ứng Pictet-Spengler dung môi cho độ chọn lọc lập thể cao hiệu suất tốt nhất, dung môi lựa chọn t-BuOH, nitrometan, axetonnitrin THF thời gian phản ứng ban đầu 48h (sơ đồ 3.45) Kết đánh giá dựa hiệu suất phản ứng tỷ lệ động phân cis/trans (102a/102b) thu (bảng 3.3) Bảng 3.3: Dung môi thời gian phản ứng Pictet-Spengler qui mô 5g/mẻ Hiệu suất Tỷ lệ cis / trans STT Dung môi Thời gian Hiệu suất Tỷ lệ cis / trans STT Dung môi Thời gian t-BuOH 48h 80 96/4 Nitrometan 36h 98 99/1 Nitrometan 48h 98 99/1 Axetonitrin 36h 96 98/2 Axetonitrin 48h 97 98/2 Nitrometan 30h 96,5 99/1 THF 48h 56 95/5 10 Axetonitrin 30h 91 98/2 Nitrometan 42h 98 99/1 11 Nitrometan 24h 93 99/1 Axetonitrin 42h 96 98/2 12 Axetonitrin 24h 91 98/2 Từ bảng 3.3 nhận thấy, với dung môi nitrometan axetonitrin có hiệu suất cao nhất, đặc biệt chọn lọc lập thể cao, tỷ lệ đồng phân cis/trans đạt 99/1 dung môi nitrometan 98/2 dung môi axetonitrin, kết phù hợp với tài liệu công bố [108,109] Tỷ lệ đồng phân cis/trans xác định dựa phổ NMR, tín hiệu proton vị trí H-1 hai đồng phân cis 102a trans 102b sở để xác định tỷ lệ Tín hiệu cộng hưởng proton H-1 hai đồng phân phân tách 133 từ trường, H-1 cis 6a (δH-1 = 5,17 ppm) chuyển dịch phía trường cao trans 6b (δH-1=5,29 ppm) (Hình 3.33), tỷ lệ diện tích hai tín hiệu tương ứng với tỷ lệ hai đồng phân cis/trans hỗn hợp Hình 3.33: Phổ 1H-NMR hợp chất piperazinedion 102 Tiếp theo, tiếp tục nghiên cứu tìm thời gian phản ứng Pictet-Spengler tốt với hai dung môi có độ chọn lọc lập thể cao nitrometan axetonitrin Các phản ứng thực tương tự thời gian phản ứng khác 42h, 36h, 30h 24h, kết bảng 3.3 Từ bảng 3.3 nhận thấy thời gian phản ứng không ảnh hưởng nhiều đến tỷ lệ hai đồng phân cis/trans dung môi nitrometan axetonitrin Hiệu suất phản ứng đạt hiệu suất tốt với dung môi nitrometan thời gian phản ứng 36h Như vậy, dung môi nitrometan dung môi tối ưu cho phản ứng Pictet-Spengler cho độ chọn lọc lập thể cao 99/1 hiệu suất phản ứng đạt 98%, thời gian tối ưu để thực phản ứng với qui mô 100g/mẻ 36h 3.7.2 Tổng hợp hợp chất (1R,3R)-metyl 1-(3,4-metylendioxiphenyl)-2-(2cloroaxetyl)-2,3,4,9-tetrahydro-1H-pyrido[3,4-b]indol-3-carboxylat Tiếp theo, hợp chất cis 102a axyl hóa nhờ phản ứng với 1,5 đương lượng cloaxetyl clorua, có mặt tác nhân kiềm nhận dẫn xuất 103 Các điều kiện tối ưu cho phản ứng lựa chọn tác nhân kiềm, dung môi phản ứng nghiên cứu 134 Sơ đồ 3.46: Tổng hợp hợp chất 103 Bảng 3.4: Điều kiện phản ứng tổng hợp chất 103 qui mô 100g/mẻ STT Dung môi Xúc tác Thời gian Hiệu suất EtOAc Et3N 2h 95% CH2Cl2 Et3N 2h 98% CH3CN Et3N 2h 93% EtOAc:H2O=1:1 NaHCO3 24h 98% CH2Cl2:H2O=1:1 NaHCO3 24h 95% 24h 95% CH3CN:H2O NaHCO3 Các công bố trước dung môi cho phản ứng axyl hóa cis 102a chủ yếu sử dụng dung môi diclometan, xúc tác kiềm trietylamin [108,109], công trình thử nghiệm phản ứng nhiều loại dung môi khác với nhiều hệ xúc tác kiềm để lựa chọn điều kiện phản ứng phù hợp cho hiệu cao Kết thực nghiệm bảng 3.4 Từ bảng 3.4 nhận thấy dung môi khác cho hiệu suất cao 90% Các phản ứng thực điều kiện đồng thể với xúc tác kiềm trietylamin pyridin thời gian phản ứng xảy nhanh 2h Phản ứng thực hệ dị thể gồm dung môi hữu nước, xúc tác phản ứng NaHCO3 thời gian phản ứng cần dài lên đến 24h Tuy nhiên, với hệ đồng thể sản phẩm cần phải có thời gian làm lâu kết tinh lại nhiều lần metanol/nước (8/2), để loại bỏ trietylamin pyridin, hệ dị thể dùng nước chiết dung môi etyl axetat diclomethan sau kết tinh lại metanol/nước (8/2) thu sản phẩm 3.7.3 Tổng hợp tadalafil Cuối cùng, dẫn xuất axyl 103 đóng vòng β-cacbolin nhờ phản ứng với đương lượng metylamin thời gian 48h nhận tadalafil (sơ đồ 3.47) 135 Sơ đồ 3.47: Tổng hợp tadalafil Cấu trúc hợp chất tadalafil chứng minh phương pháp phổ IR, MS, 1H-NMR 13C-NMR Trên phổ IR hợp chất tadalafil (11) có đỉnh hấp phụ 3321 cm-1 đặc trưng nhóm amin bậc hai, đỉnh hấp phụ 1674 cm-1 đặc trưng cho nhóm C=O, đỉnh hấp phụ 1040 cm-1 đặc trưng cho C-O-C Ngoài ra, phổ IR xuất đỉnh hấp phụ liên kết C-H bão hòa, C-H C=C nhân thơm Trên phổ ESI-MS cho pic ion phân tử m/z 390,0 [M+H]+ 387,9 [M-H]+ phù hợp với công thức phân tử C22H19N3O4 hợp chất tadalafil Trên phổ 1H-NMR hợp chất 11 xuất đầy đủ tín hiệu cộng hưởng proton có mặt phân tử Tín hiệu cộng hưởng singlet ba proton 2,97 ppm đặc trưng nhóm N-CH3 Tín hiệu cộng hưởng doublet-doublet với số tương tác 12,0 16,0 Hz 3,14 ppm gán cho proton H-12a Tín hiệu cộng hưởng proton H-12b 3,52 ppm với số tương tác 4,5 16,0 Hz Proton vị trí H-3 thể cặp doublet 3,87 ppm 4,17 ppm với số tương tác 17,0 Hz Proton vị trí H-13 tín hiệu doublet-doublet 4,19 ppm với số tương tác 4,0 11,5 Hz Proton vị trí H-6 tín hiệu singlet 6,09 ppm Ngoài ra, vùng trường thấp 1H-NMR hợp chất 11 thể tín hiệu cộng hưởng proton thơm, tín hiệu cộng hưởng nhóm etylen 5,80 ppm Độ dịch chuyển hóa học số tương tác phù hợp với cấu trúc tadalafil công bố tài liệu [108,109] 136 Hình 3.34: Phổ 1H-NMR tadalafil Phổ 13C-NMR thể đầy đủ tín hiệu cộng hưởng 22 nguyên tử cacbon chất 11, có hai tín hiệu nhóm cacbonyl Phân tích phổ cho phép khẳng định cấu trúc hợp chất 11 tadalafil Hình 3.35: Phổ 13C-NMR tadalafil Từ kết kết tổng hợp hợp chất 102a 103, rút quy trình sản xuất tadalafin sơ đồ 3.48: 137 80g D-tryptophan metyl este hidroclorua 47,2g Piperonal 500 ml CH3NO2 Đun hồi lưu 36h Làm lạnh 0oC 0,8 lít hỗn hợp EtOAc:H2O (1:1) 78g NaHCO3 Kết tinh, lọc 1,5 lít CH3NO2 Sản phẩm 102a, 98% 1,5 lít CH3NO2 Khuấy 0-5oC, 24h 30ml ClCOCH2Cl Chiết lần 500ml K2CO3 10% 1,5 lít EtOAc Rửa Làm khan, loại bỏ dm 1,0 lít CH2Cl2 50g Na2SO4 Kết tinh lại Sản phẩm 103, 98% CH3NH2 Khuấy nhiệt độ phòng, 48h (100ml, 40%) Loại bỏ dm, CH3NH2 Hỗn hợp nước/isopropanol (10%) Rửa, kết tinh Tadalafin, 91% Sơ đồ 3.48: Quy trình sản xuất tadalafil 100g/mẻ 138 0,6 lít EtOH Như vậy, từ việc tổng hợp hợp chất piperazinedion chứa khung tetrahidroβ-cacbolin nghiên cứu công bố trước tổng hợp tadalafil Luận án đưa quy trình tối ưu tổng hợp tadalafil quy mô 100g/mẻ với hiệu suất 86,5% từ nguyên liệu D-tryptophan metyl este hidroclorua 3.8 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT PIPERAZINEDION Phương pháp thử khả gây độc tế bào in vitro Viện Ung thư Quốc gia Hoa kỳ (NCI) xác nhận phép thử gây độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát chất có khả kìm hãm phát triển diệt tế bào ung thư điều kiện in vitro [116] Các hợp chất piperazinedion thử nghiệm gây độc tế bào dòng tế bào ung thư người cung cấp từ sưu tập giống chuẩn Hoa Kỳ (American Type Culture Collection – ATCC) gồm: Tế bào ung thư biểu mô KB (Human epidermic carcinoma), ung thư gan Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma), ung thư phổi LU (Human lung carcinoma) ung thư vú MCF-7 (Human breast carcinoma), nhằm tìm kiếm hợp chất có hoạt tính mạnh Kết thử hoat tính gây độc tế bào tóm tắt bảng sau: Bảng 3.5: Kết xác định độc tính dòng tế bào ung thư (Lu, KB, HepG2, MCF7) số hợp chất piperazinedion STT Hợp chất Giá trị IC50 Giá trị IC50 Giá trị IC50 Giá trị IC50 (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) LU KB Hep_G2 MCF-7 119c >128 >128 >128 >128 118f >128 >128 >128 >128 119f >128 >128 >128 >128 119d 107 102.5 >128 116.61 117f >128 >128 >128 >128 117b >128 >128 >128 >128 117c >128 >128 >128 >128 116f >128 >128 >128 >128 117a >128 >128 >128 >128 10 116b >128 >128 >128 >128 139 STT Hợp Giá trị IC50 Giá trị IC50 Giá trị IC50 Giá trị IC50 (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) LU KB Hep_G2 MCF-7 chất 11 116c >128 62.31 >128 >128 12 115a 30.85 24.59 118 >128 13 115b 71.36 88.1 >128 >128 14 114c >128 >128 >128 >128 15 115d >128 >128 >128 >128 16 114a >128 >128 >128 >128 17 114b >128 >128 >128 >128 18 115c >128 117.3 >128 >128 19 114d >128 >128 >128 >128 20 116e >128 >128 >128 >128 21 116d 99.2 4.4 >128 22 117d >128 >128 >128 >128 23 117e >128 >128 >128 >128 24 120f >128 >128 >128 >128 25 121f >128 >128 >128 >128 26 121e >128 >128 >128 >128 27 121d >128 >128 >128 >128 28 121c >128 >128 >128 >128 39 121b >128 >128 >128 >128 30 120b >128 27.5 >128 >128 31 120c >128 29.73 >128 >128 32 120d 23.69 23.71 128 >128 33 120e 27.28 32 >128 >128 34 120a 116.5 17.7 >128 >128 140 STT Hợp Giá trị IC50 Giá trị IC50 Giá trị IC50 Giá trị IC50 (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) LU KB Hep_G2 MCF-7 chất 35 121a 90.28 32 >128 >128 36 114f 128 >128 >128 37 114e 22.96 7.58 32 >128 38 118b >128 32 >128 >128 39 118c >128 27.5 >128 >128 40 118d >128 9.16 38.5 >128 41 115f >128 >128 >128 >128 42 119a 3.59 12.36 >128 Từ bảng 3.5 nhận thấy có 18/42 mẫu có hoạt tính ức chế phát triển tế bào ung thư đáng lưu ý, tập trung vào hai dòng ung thư KB LU Trong mẫu 114e, 114f, 118d, 119a 116d thể hoạt tính với dòng KB tương đối mạnh với giá trị IC50 khoảng 3.59-9.16 µg/ml Mẫu 119a gây độc tế bào tương đối mạnh với hai dòng KB LU, mẫu 116d gây độc tế bào mạnh với hai dòng Hep-G2 KB nằm khoảng IC50 < 10 µg/ml Hình 3.36: Một số hợp chất có hoạt tính mạnh với dòng tế bào KB Kết cho thấy, hợp chất piperazinedion tổng hợp có cấu trúc đơn giản hợp chất piperazinedion thiên nhiên có khung 141 tetrahydro-β-cacbolin, nhiên có hoạt tính gây độc số dòng tế bào Kết khẳng định, nghiên cứu thiết kế tổng hợp hợp chất piperazinedion lược giản mô theo cấu trúc hợp chất piperazinedion thiên nhiên có ý nghĩa khoa học Từ hợp chất 114e, 114f, 116d, 119a 118d có hoạt tính mạnh với dòng tế bào KB (hình 3.36), tiếp tục nghiên cứu cải tiến cấu trúc để có hợp chất có hoạt tính cao Đây kết lý thú cho nghiên cứu sâu hoạt tính lớp chất 142 KẾT LUẬN Đã tổng hợp thành công cặp đồng phân cis/trans chứa khung tetrahidro-βcacbolin từ nguyên liệu đầu L-tryptophan anđehit phản ứng PictetSpengler Từ nguyên liệu trung gian này, nghiên cứu tổng hợp 56 hợp chất piperazinedion chứa khung tetrahidro-β-cacbolin với hiệu suất cao Từ nguyên liệu đầu naphthalen-1,4-dion, etyl 2-(diphenylmetyleneamino) axetat amin, nghiên cứu tổng hợp 10 hợp chất piperazinedion có khung hexahydropyrazin-[1,2b]-isoquinolin qua năm bước phản ứng Cấu trúc sản phẩm chứng minh phổ cộng hưởng từ hạt nhân Đã tổng hợp thành công hợp chất piperazinedion mô theo cấu trúc hợp chất thiên nhiên (-)-phenylahistin Cấu trúc hợp chất xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân Đã nghiên cứu xây dựng quy trình tối ưu tổng hợp tadalafil với quy mô 100g/mẻ với hiệu suất 86,5% Đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào 42 mẫu hợp chất piperazinedion tổng hợp, nhận thấy có 18/42 mẫu thử có hoạt tính ức chế phát triển tế bào ung thư đáng lưu ý, tập trung vào hai dòng ung thư KB LU Đáng ý, mẫu 119a gây độc tế bào tương đối mạnh với hai dòng KB (3,59 μg/ml) LU (8,0 μg/ml), mẫu 116d gây độc tế bào mạnh với hai dòng Hep-G2 (8,0 μg/ml) KB (4,4 μg/ml) 143 ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN Luận án tổng hợp 56 hợp chất piperazinedion chứa khung tetrahidroβ-cacbolin từ nguyên liệu đầu L-tryptophan qua bước Luận án tổng hợp 10 hợp chất piperazinedion có khung hexahydropyrazin-[1,2b]-isoquinolin qua năm bước phản ứng Luận án tổng hợp thành công hợp chất piperazinedion mô theo cấu trúc hợp chất thiên nhiên (-)-phenylahistin Luận án xây dựng quy trình tối ưu tổng hợp tadalafil với quy mô 100g/mẻ với hiệu suất 86,5% Luận án xác định 18 hợp chất piperazinedion chứa khung tetrahidro-βcacbolin có hoạt tính ức chế phát triển tế bào ung thư, tập trung vào hai dòng ung thư KB LU Trong chất piperazinedion 119a gây độc tế bào tương đối mạnh với hai dòng KB (3,59 μg/ml) LU (8,0 μg/ml), chất piperazinedion 116d gây độc tế bào mạnh với hai dòng Hep-G2 (8,0 μg/ml) KB (4,4 μg/ml) 144 CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Vũ Đức Cƣờng, Phạm Thế Chính, Đặng Thị Tuyết Anh, Ngô Quốc Anh, Nguyễn Văn Tuyến, “Tổng hợp số dẫn xuất diketopiperazin” Tạp chí Hóa học 2014, Số 6A, tập 52, 208-211 Nguyen Van Tuyen, Vu Duc Cuong, Ngo Quoc Anh, Pham The Chinh, Dang Thi Tuyet Anh, Hoang Thi Phuong, Pham Thi Tham, Nguyen Thi Bich Thuan, Nguyen Thi Hanh and Vu Thi Thu Ha, Synthesis of several piperazidinedione derivatives, Vietnam Journal of Chemistry 2013, 51(5A), 17-21 Nguyen Van Tuyen, Vu Duc Cuong, Ngo Quoc Anh, Pham The Chinh, Dang Thi Tuyet Anh, Hoang Thi Phuong, Pham Thi Tham, Nguyn Bich Thuan, Nguyen Thi Hanh, Doan Duy Tien, Vu Thi Thu Ha, “Synthesis of piperazinedion derivatives containing naphthalens moiety”, Proceedings of the 2nd VAST-KAST, NXb Khoa học Tự nhiên Công nghệ, ISBN: 978-604-913-143-1, 2013, 170-176 Vu Duc Cuong, Pham The Chinh, Dang Thi Tuyet Anh, Pham Thi Tham, Ngo Quoc Anh, Nguyen Van Tuyen, “Synthesis and evaluation of the activity new piperazinedion derivatives”, Proceedings of the first VAST-BAS, NXb Khoa học Tự nhiên Công nghệ, ISBN: 978-604-913-143-1, 2014, 413-420 Đặng Thị Tuyết Anh, Phạm Thế Chính, Vũ Đức Cƣờng, Hoàng Thị Phương, Nguyễn Hà Thanh, Phạm Thị Thắm, Đoàn Duy Tiên, Nguyễn Văn Tuyến, “Nghiên cứu qui trình tổng hợp tadalafil”, Tạp chí Hóa học, 2015, số 6e1-2, tập 53, 272-276 Phạm Thế Chính, Đặng Thị Tuyết Anh, Vũ Đức Cường, Nguyễn Hà Thanh, Phạm Thị Thắm, Nguyễn Tuấn Anh, Trần Thị Phương, Đoàn Duy Tiên, Nguyễn Văn Tuyến, “Tổng hợp số dẫn xuất tadalafil”, Tạp chí Hóa học, 2015, số 6e1-2, tập 53, 277-281 145 [...]... tâm nghiên cứu tổng hợp, nhằm ứng dụng vào sản xuất thương mại Như vậy, nghiên cứu tổng hợp các hợp chất piperazinedion nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học lý thú và xây dựng qui trình tối ưu cho tổng hợp thuốc tadalafil vẫn đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Từ những lý do được nêu trên, luận án này tập trung nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất mới của piperazinedion và nghiên cứu. .. [73,74] Tóm lại, các hợp chất piperazinedion là lớp chất có rất nhiều hoạt tính sinh học quý như: khả năng gây độc tế bào mạnh với các dòng tế bào ung thư, kháng virut, kháng khuẩn, kháng nấm,… Các hợp chất này biểu hiện đặc tính dược lý và tiềm năng điều trị bệnh, đặc biệt là bệnh ung thư Điều này đã mở ra một hướng nghiên cứu cho các nhà khoa học là nghiên cứu tổng hợp các hợp chất piperazinedion mới... tổng hợp một loạt các hợp chất, bao gồm các chất ức chế metalloproteinase và collagenase-1 [24,25] Dãy của các chất piperazinedion tổng hợp bằng phương pháp này cũng được thử nghiệm liên kết với thụ thể OT và sản xuất các chất đối kháng oxytocin 70a và 70b [26] Phương pháp pha dung dịch (UDC) tương ứng được sử dụng để phát triển các hợp chất có mạch 2’,4’difluorophenyl 70c, hợp chất piperazinedion đầu... Nam Nhằm mục đích tổng hợp các hợp chất piperazinedion mới và tổng hợp tadalafil Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất piperazinedion thực hiện tại phòng Hóa sinh ứng dụng - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam theo phương pháp của Mossman trên bốn dòng tế bào ưng thư người KB, Hep-G2, LU và MCF7 2.1.2 Hóa chất và dung môi Các hóa chất phục vụ cho việc tổng hợp hữu cơ và dung... nhiệt độ nóng chảy Nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp được đo trên máy Gallenkamp của Anh tại phòng thí nghiệm Tổng hợp hữu cơ - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam 2.1.5 Xác nhận cấu trúc Để xác định cấu trúc các chất hữu cơ tổng hợp được, chúng tôi tiến hành các phương pháp sau: - Phổ hồng ngoại (IR): Phổ IR của các chất nghiên cứu được xác định trên máy Spectrum TwoTM... pháp tổng hợp các hợp chất piperazinedion đơn giản, nhóm thế N1 được thế bằng việc sử dụng tác nhân phản ứng là các amin bậc nhất Một minh họa của phương pháp này là axyl hóa - ankyl hóa amin với một haloeste phù hợp Phương pháp này cho phép bổ sung các nhóm thế kiểu liên hợp vào nguyên tử nitơ vòng Ở tổng hợp này, các amin bậc 1 đầu tiên phản ứng với halogen trước khi tạo vòng bằng phản ứng với các. .. piperazinedion và nghiên cứu xây dựng qui trình tổng hợp tadalafil với qui mô 100g/mẻ nhằm tìm kiếm các hợp chất mới có hoạt tính sinh học lý thú đồng thời tìm kiếm qui trình triển khai tổng hợp tadalafil có khả năng ứng dụng vào sản xuất 27 CHƢƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.1 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ 2.1.1 Phƣơng pháp nghiên cứu Thực hiện các phương pháp tổng hợp hữu cơ như: phản ứng este hóa, phản... ứng tạo vòng piperazinedion đạt hiệu suất 63-97% [6-8] Một trong nhiều ví dụ tổng hợp các hợp chất piperazinedion theo cách này là phương pháp tổng hợp chọn lọc toàn phần okaramine N của Baran và cộng sự [9], cho thấy con đường tham gia vào quá trình hình thành hệ thống vòng pyrrolidinoindolin 15 khi hợp chất 52 tiếp xúc với dietylamin dư dẫn đến sự phân cắt nhóm Fmoc và tạo thành vòng piperazinedion. .. 1.19: Tổng hợp tadalafil 25 Trong trường hợp thay thế metylamin bằng các amin bậc 1 khác, ví dụ như 1benzyl-3-aminopyrrolidin thu được hợp chất 104 có hoạt tính mạnh hơn tadalafil Đa dạng hóa hơn nữa từ việc có thể amin hóa khử của nguyên tử nitơ pyrrolidin sau khử nhóm benzyl bảo vệ (sơ đồ 1.20) [42] Sơ đồ 1.20: Tổng hợp các hợp chất tương tự tadalafil thông qua khung β-Cacbolin Những nghiên cứu đã... [62,63] - Chất ức chế virus HSV Một chiến lược tổng hợp được sử dụng để thiết kế và xác định các chất ức chế virus nhiễm trùng máu xuất huyết (HSV), một loại virus rhabdovirus ở cá có tầm quan trọng về kinh tế trong ngành nuôi trồng thủy sản Hai hợp chất có khung piperazinedion trong số này là 35 (IC50 = 51μM) và 36 (IC50 = 86μM) (hình 1.13) được chọn nghiên cứu sâu để hạn chế độc tính của các hợp chất ... thư Điều mở hướng nghiên cứu cho nhà khoa học nghiên cứu tổng hợp hợp chất piperazinedion có nhiều hoạt tính sinh học quý 1.2 TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT PIPERAZINEDION Phân tích vòng piperazinedion nhận... thu hợp chất cis-113f với hiệu suất 95% (78,8mg) Hợp chất trans-113f tổng hợp tương tự hợp chất cis-113f từ hợp chất trans-113f đạt hiệu suất 92% 2.2.4 Tổng hợp hợp chất piperazinedion 2.2.4.1 Tổng. .. học lý thú, việc nghiên cứu tổng hợp hợp chất piperazindione nhằm tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học nhiều nhà khoa học quan tâm Do đề tài Nghiên cứu tổng hợp hợp chất piperazinedion có