Xây dựng quy trình nuôi cấy mô cây cam

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC    BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: Xây dựng quy trình nuôi cấy mô cam Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Phan Hữu Tôn TS Vũ Thị Đào Khoa Công nghệ sinh học Trường ĐHNN HN Sinh viên thực : Đỗ Đức Trọng Lớp : CNSH - K51 “Khóa luận đệ trình Khoa CNSH, Trường ĐH Nông Nghiệp Hà Nội phần yêu cầu trình độ đại học ngành Công nghệ sinh học" HÀ NỘI - 2010 LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .5 DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH .7 TÓM TẮT PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu .3 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung có múi 2.1.1 Tình hình chung có múi 2.1.2 Đặc điểm thực vật : .5 2.1.3 Nhu cầu sinh thái 2.1.4 Sự phân hoá (differentiation) .7 2.1.5 Sự hoa đậu trái 2.1.6 Sự rụng trái non 10 2.1.7 Sự phát triển trái .12 2.2 13 2.2.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ có múi giới 13 2.2.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ có múi Việt Nam 13 2.3 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học chọn tạo giống ăn có múi17 2.3.1 Sơ lược lịch sử chọn tạo giống ăn có múi 17 2.3.2 Ứng dụng công nghệ sinh học chọn tạo giống ăn có múi giới 20 2.3.3 Ứng dụng công nghệ sinh học chọn tạo giống ăn có múi Việt Nam 21 2.3.4 Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào Việt Nam .23 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 Nội dung nghiên cứu 25 3.2 Đối tượng nghiên cứu 25 3.3 Vật liệu 25 3.4 Địa điểm thời gian nghiên cứu 25 3.5 Phương pháp nghiên cứu 25 3.6 Phương pháp tiến hành 27 PHẦN IV: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 4.1 Nội dung nghiên cứu .28 4.2 Vật liệu nghiên cứu 28 4.3 Phương pháp nghiên cứu 28 4.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 33 4.4.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng hóa chất khử trùng hạt giống đến tỷ lệ nhiễm khuẩn 33 4.4.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn vật liệu nuôi cấy tới khả tạo chồi .37 4.4.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng số loại hoocmon bổ sung vào môi trường đến hệ ố nhân chồi 41 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1 Kết luận 46 5.2 Đề nghị .46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A, T, G, C ADN ARN bp CCV CEFAS CHV CNGV CPE CyHV-1 CyHV-2 EDTA ELISA EU FAO IFAT kbp KF-1 KHV KHVD LB MCS NCBI OATA OIE orf PCR SVC TAE TE tk VAC Adenine, Thymine, Guanine, Cytosine Acid deoxyribonucleic Acid Ribonucleic base pair Chanel catfish virus Center for Environment, Fisheries & Aquaculture Science cyprinid herpesvirus carp nephritis and gill necrosis virus Cytopathogenic effect Cyprinid herpesvirus-1 Cyprinid herpesvirus-2 ethylene diamine tetraacetic acid enzyme-linked immunosorbent assay European Union Food and Agriculture Organization Indirect fluoescent antibody test kilo base pair koi fin Koi herpesvirus Koi herpesvirus disease Luria-Bertani multiple cloning site National Center for Biotechnology Information Ornamental Aquatic Trade Association Office International des Epizooties (The World Organisation for Animal Health) open reading frame Polymerase Chain Reaction Spring Viraemia of Carp Tris Acetic EDTA Tris EDTA thyamidine kinase Vườn-Ao-Chuồng DANH MỤC BẢNG Bảng Đo kết nhiễm Cam 14 ngày tuổi 33 Bảng 2: Đo chiều cao Cam Vinh 28 ngày tuổi 34 Bảng 3: Đo nhiễm khuẩn Cam sau ngày cấy .38 Bảng 4: Ảnh hưởng nguồn vật liệu nuôi cấy tới khả tạo chồi Cam Vinh 38 Bảng 5: Nghiên cứu ảnh hưởng số loại hoocmon bổ sung vào môi trường đến hệ ố nhân chồi 41 Bảng 6: Ảnh hưởng BAP IAA đến khả tái sinh chồi Cam Vinh .44 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Hoa số loại có múi: a) Cam Sành; b) Chanh Tàu Hình 2: Hoa Cam Vinh: a) Bông lá; b) có 11 Hình 3: Sự rụng trái non Cam Vinh giai đoạn 20 ngày sau đậu trái 11 Biểu đồ Tỷ lệ nhiễm số hạt reo sau tuần tuổi 34 Biểu đồ Chiều cao trung bình sau 28 ngày tuổi 35 Biểu đồ Tỷ lệ nảy mầm sau 14 ngày theo dõi .35 Hình 4: ảnh hưởng hóa chất khử trùng hạt giống 36 Biểu đồ Ảnh hưởng nguồn vật liệu nuôi cấy tới hệ số nhân chồi sau tuần 39 Hình Ảnh hưởng nguồn vật liệu epicotyl 40 Hình Vật liệu epicoyyl tạo chồi khỏe sinh trưởng tốt 40 Biểu đồ Ảnh hưởng số loại hoocmon bổ sung vào môi trường đến hệ số nhân chồi .42 Hình Ảnh hưởng MT + 3mg/l BAP đến khả hình thành chồi 42 Hình Ảnh hưởng MT + 0,5mg/l BA đến khả hình thành chồi 43 TÓM TẮT PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cam ăn cao cấp có giá trị dinh dưỡng giá trị kinh tế cao Trong thành phần thịt có hứa - 12% đường (chủ yếu đường saccaroza) hàm lượng vitamin từ 40 - 90mg/100g tươi ,các axit hữu từ 0,4 - 1,2 % ,trong có nhiều loại axit có hoạt tính sinh học cao với chất khoáng dầu thơm Quả cam dùng để ăn tươi, làm mứt, nước giải khát chứa bệnh tốt Tinh dầu cất từ vỏ quả, lá, hoa dung công nghiệp thực phẩm chế mỹ phẩm Trồng cam chóng cho thu lãi suất cao nhiều loại ăn khác Ở nước ta,1 cam có thời kỳ khoảng năm tuổi cho suất trung bình 16 tấn/1ha, lãi đạt chừng 10 - 12 triệu đồng/1 năm ,những năm sau suất trung bình tăng ,có thể lên tới 50 - 60 tấn/năm thu 40 - 50 triệu đồng/1 Cây cam sống cho thu hoặch vòng 25-30 năm Nếu điều kiện đất tốt , điều kiện thâm canh cao ,khí hậu thích hợp ,tuổi thọ cam kéo dài 50-100 năm Theo thống kê năm 1990 diện tích trồng cam nước ta ước tính gần 19000 ha, sản lượng 119000 Trong tỉnh phía nam có sản lượng lớn tỉnh phía bắc lại cho chất lượng cao Nước ta nằm trung tâm phát sinh nhiều giống ăn có múi (Võ Văn Chi, 1997; Phạm Hoàng Hộ, 1992) Nhưng tính bình quân lượng tiêu thụ có múi/đầu người đạt khoảng 5,0 kg/năm (Tổng cục thống kê, 2000), số thấp so với tiêu thụ bình quân giới nước EU Mỗi năm nước ta phải nhập lượng lớn cam quýt từ nước Để đạt mức tiêu thụ có múi trung bình giới 10 năm tới, nước ta phải sản xuất thêm khoảng 800.000 đến 900.000 năm, hay phải mở rộng thêm khoảng 40.000 trồng ăn có múi, chủ yếu cam, bưởi, quýt với suất trung bình phải đạt 20 tấn/ha Muốn mở rộng diện tích quy mô trên, sản xuất cần khoảng 20 triệu giống tốt, bệnh Sản xuất ăn có múi nước ta tăng nhanh, gặp nhiều khó khăn dịch bệnh chất lượng giống chưa đáp ứng nhu cầu thị trường ăn tươi chế biến Chọn giống truyền thống có hạn chế giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng kéo dài, thường xảy không tương hợp loài khác loài, tượng đa phôi… Kỹ thuật phổ biến ghép làm giảm giai đoạn cho kết mong muốn Các đặc tính làm cho công tác chọn giống nhân giống truyền thống cam quýt khó, tốn thời gian kéo dài Một hướng quan trọng để tạo nguồn giống bệnh sử dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật vi ghép Cây tái sinh in vitro nguồn vật liệu quan trọng cho tạo giống không hạt vật liệu cho nghiên cứu chuyển gen tương lai Ở nước ta có nhiều giống địa phương có chất lượng cao bưởi Năm Roi, Phú Trạch, Da xanh, Đoan Hùng, Diễn nhiều giống cam quýt khác trồng cam Sành (Hà giang, Tuyên Quang), cam Xã đoài (Nghệ An), cam Vân du (Thanh hoá); quýt vàng vỏ giòn, quýt chum (Hà giang) Tuy nhiên, giống phần lớn có nhiều hạt làm giảm chất lượng khó xuất số thị trường khó tính Mỹ, Nhật Bản Châu Âu, cần thiết phải tìm cách làm cho giống hạt Ngày nay, công nghệ sinh học phát triển mạnh mẽ, đặc biệt công nghệ nuôi cấy mô tế bào trở thành công cụ hữu hiệu đắc lực việc tạo nguồn giống bệnh với số lượng lớn, chất lượng cao Để tạo giống vô phối không hạt sở giống cam quýt đặc sản nước ta cần phải sử dụng công nghệ chuyển gen khâu nhân nhanh in vitro việc quan định thành công chuyển gen hay không nhằm tạo nguồn giống bệnh với hệ số nhân cao Vì tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng quy trình nuôi cấy mô cam” 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích Xác định giống Cam tạo vô phối, tạo tạo hạt không hạt Biểu đồ Tỷ lệ nhiễm số hạt reo sau tuần tuổi Bảng đo chiều cao (cm) Cam 28 ngày tuổi thí nghiệm khử trùng Bảng 2: Đo chiều cao Cam Vinh 28 ngày tuổi Cây CT3 8,9 9,1 8,6 8,6 9,0 9,3 9,9 10,5 10,4 8,6 9,3 10,2 9,7 8,9 9,6 CT4 9,4 11,4 12,3 8,7 11,8 10,5 8,6 8,8 11,6 9,3 9,5 10,4 11,4 10,6 10,7 11,2 Trung 8,4 5,6 9,4 bình (cm) Tỷ lệ nảy mầm 20% 80% 75% (0 : hóa nâu) (Kết đo ngày 14/2/2010) 10,4 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 CT1 8,6 8,7 8,4 7,8 CT2 7,3 7,2 7,2 0* 7,4 6,4 6,6 6,8 6,8 7,0 6,9 6,8 7,2 6,6 7,3 6,9 7,1 34 80% Biểu đồ Chiều cao trung bình sau 28 ngày tuổi Biểu đồ Tỷ lệ nảy mầm sau 14 ngày theo dõi 35 Hình 4: ảnh hưởng hóa chất khử trùng hạt giống Qua bảng ta thấy: Khử trùng Hgcl cho tỷ lệ nhiễm thấp (0%) Trong khử trùng cồn 70 gần nhiễm toàn (80%) Khử trùng Johson nước Javen cho tỷ lệ nhiễm 20% 25% Theo dõi khả nảy mầm hạt sinh trưởng ta thấy: - Khử trùng Hgcl2 không bị nhiễm khả nảy mầm khả sinh trưởng chậm Cụ thể số hạt không nảy mầm mà hóa nâu (do mô bị chết hoại), chiều cao thấp hơn( 5,6 cm) khử trùng chất khác hạt nẩy mầm sinh trưởng tốt Tỷ lệ nảy mầm Hgcl với dung dịch Johson =80% Tỷ lệ nẩy mầm nước Javen 75%, Tỷ lệ nẩy mầm Cồn 700 20% Khả sinh trưởng môi trương khác là:Với Cồn 8,4(cm), Javen 9,4( cm), Johson 10,4( cm) Chất lượng cây: Hgcl2: Thân nhỏ, quăn, nhiều thân vàng Còn Cồn, dung dịch Johson Javen mập, thân xanh, to - Do vậy, dùng Javen Johson cho kết không chênh lệch nhiều khử trùng Johson đơn giản mặt thao tác 36 => Kết luận : Khử trùng dung dịch Johson 10% lắc 15-20 phút cho kết tốt 4.4.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn vật liệu nuôi cấy tới khả tạo chồi Từ vật liệu khởi đầu, gieo môi trường 4,5gMS + 30g/L saccarose + 8g Agar + 500mg Malt ex tract + 0,1g NAA + 10mg BA ( pha lit môi trường ), pH 5.7 Các mô thí nghiệm in vitro đoạn thân, lá, rễ VL1 : Epicotyl (trụ mầm) VL2 : Hypocotyl (trụ mầm) VL3 : Lá thật thứ VL4 : Rễ • Thí nghiệm lấy mẫu ngày 4/2/2010 Thí nghiệm làm ngày 14/4/2010 Thí nghiệm bố trí công thức : CT1: Epicotyl( trụ mầm); CT2: Hypocotyl( Trụ mầm); CT3: Lá thật thứ nhất; CT4: Rễ • Cách lấy mẫu: Tại phần ta cắt đoạn vát đầu có chiều dài 0,8-1cm • Cách bố trí thí nghiệm: công thức ta làm bình, bình cấy mẫu • Cách làm thí nghiệm: trước đưa mẫu cấy vào buồng cấy ta phải khử trùng mẫu cồn 700 Sau ta tiến hành cắt mẫu, tiến hành cấy vào bình 37 Bảng 3: Đo nhiễm khuẩn Cam sau ngày cấy CT CT1 CT2 CT3 CT4 Nhiễm(bình) 0 1 Quan sát: sau tuần cấy mẫu 14/4/2010-28/4-2010 ta thấy mẫu không nhiễm bắt đầu sùi đầu cắt, quan sat thấy rõ CT1( đoạn epicotyl) Sau tuần cấy (06/05/2010): Các mẫu cấy phình to đầu ,và thắt eo (sùi callus) Hai đầu sùi lên có màu vàng xanh , màu xanh, trắng, đoạn thân có màu xanh đậm Sau tuần đầu sủi chuyển màu nâu Đến ngày 28/05/2010 : CT1 CT2 cho chồi (chồi ngủ) Ta có bảng theo dõi tỷ lệ nẩy chồi( Quan sát ngày 30/05/2010) sau: Bảng 4: Ảnh hưởng nguồn vật liệu nuôi cấy tới khả tạo chồi Cam Vinh Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ tạo Tỷ lệ Hệ số nhân chồi sau sống (%) callus chồi/mẫu cấy tuần CT1 100 9/12 0.64 1.72 CT2 100 0/12 0 CT3 100 7/12 0.56 1.58 CT4 100 4/12 0.42 1.32 38 Biểu đồ Ảnh hưởng nguồn vật liệu nuôi cấy tới hệ số nhân chồi sau tuần Sau thí nghiệm tìm vật liệu tối ưu để sử dụng cho thí nghiệm (CT tối ưu 2) Sau thí nghiệm ta tìm vật liệu tối ưu để nuôi cấy là:”Epicotyl-trụ mầm” Vật liệu nuôi cấy tạo chồi nhanh nhất, phát triển tốt nhất, khả kháng nhiễm cao so với vật liệu nuôi cấy khác Và vật liệu có: tỷ lệ nhiễm khuẩn thấp nhất, tỷ lệ nảy mầm cao nhất, tỷ lệ mẫu sống/chết cao nhất, tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao, thời gian tạo callus nhanh nhất, chất lượng callus cao Do mà vật liệu 1(epicotyl) chọn làm vật liệu tối ưu cho thí nghiệm 39 Khả tạo chồi Khả tạo callus Hình Ảnh hưởng nguồn vật liệu epicotyl Hình Vật liệu epicoyyl tạo chồi khỏe sinh trưởng tốt 40 4.4.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng số loại hoocmon bổ sung vào môi trường đến hệ ố nhân chồi Với CT tối ưu đem nuôi cấy môi trường khác nhau: CT1 : Môi trường MT + 3mg/l BAP CT2 : Môi trường MT + 0,5mg/l BA CT3 : Môi trường MT + 500mg/l Mal ex tract + 0,1mg/l NAA + 10mg/l BA Cả môi trường có pH 5.7 - Lấy mẫu cấy gieo ngày 12/04/2010 (mẫu cấy Cam Vinh) : Cây tuần ngày tuổi Mỗi công thức làm bình, bình cấy mẫu - Bảng đo nhiễm khuẩn thí nghiệm thí nghiệm: CT Nhiễm(số bình) CT1 CT2 CT3 Bảng 5: Nghiên cứu ảnh hưởng số loại hoocmon bổ sung vào môi trường đến hệ ố nhân chồi CT1 Tỷ lệ Tỷ lệ mẫu Chiều cao mẫu sống phát sinh chồi (%) chồi (%) (cm) 100 22/36 1.2 Hệ số Chất lượng chồi nhân chồi sau tuần Chồi nhỏ ngắn, 1.25 yếu, nhiều chồi phát triển không CT2 100 36/36 1.4 hoàn chỉnh Chồi xanh mập, 1.83 xanh, phát triển cân đối CT3 100 0/36 41 Biểu đồ Ảnh hưởng số loại hoocmon bổ sung vào môi trường đến hệ số nhân chồi + Sau tuần cấy ta quan sát số chồi sau cấy: - Kết luận: CT3 không tạo chồi, CT1 CT2 tạo chồi nhanh hơn, song CT2 tạo chồi khỏe, to, cao, to bản, có màu xanh, phát triển cân đối Ở CT1 chồi nhỏ ngắn, yếu, nhiều chồi phát triển không cân đối Do CT2 công thức tối ưu cho trình nhân chồi Cam Hình Ảnh hưởng MT + 3mg/l BAP đến khả hình thành chồi 42 Hình Ảnh hưởng MT + 0,5mg/l BA đến khả hình thành chồi Tế bào thực vật có tính toàn năng, có khả phản phân hóa Do từ tế bào chuyên biệt, gặp điều kiện thuận lợi có khả tái tạo thành hoàn chỉnh Những tế bào chuyên hóa khả phản phân hóa khó khăn Qua nhiều báo cáo từ tác giả khác nhau, thống vật liệu dùng cho chuyển gen cho quýt Đường canh đoạn epocotyl Tuy nhiên để nuôi cấy mô thành công vai trò hormon thực vật vô quan trọng việc điều chỉnh trình sinh trưởng, phát triển hoạt động sinh lý chúng Xytokinin có tác dụng kích thích mạnh mẽ phân chia tế bào, phân hóa chồi Auxin có tác dụng sinh lý nhiều lên trình sinh trưởng tế bào, hoạt động tượng tầng Tuy nhiên với tượng sinh trưởng phát triển điều chỉnh cân hai hay nhiều hooc môn định Trong nuôi cấy mô thực vật, tác dụng tương hỗ cytokinin với auxin đóng vai trò đặc biệt việc hình thành phân hóa quan mô nuôi cấy Tỷ lệ nồng độ auxin / cytokinin cao môi trường nuôi cấy cảm ứng sinh rễ, sinh củ mạnh Ngược lại tỷ lệ thấp cảm ứng sinh chồi tăng lên Nhưng nuôi cấy mô đối tượng cam quýt thân gỗ, hai mầm đặc tính sinh lý khác nên khó rễ từ chồi nuôi cấy mô Tỷ lệ thành phần hormon qua nghiên cứu đối tượng cam quýt khác khác 43 Vì đưa công thức khác thành phần liều lương hooc môn để tìm môi trường thích hợp cho nuôi cấy mô sau thực thao tác chuyển gen quýt Đường canh Bảng 6: Ảnh hưởng BAP IAA đến khả tái sinh chồi Cam Vinh CT BAP IAA (mg/l) (mg/l) Thời gian theo dõi Tỷ lệ Tỷ lệ mẫu chồi (%) sống (%) Số chồi/ mẫu (chồi) tuần tuần tuần tuần tuần Ghi ĐC 0 100 8.3 11.1 11.1 - 1 83.3 11.1 16.6 19.5 1.5 + 2 86.11 8.33 16.6 19.5 1.5 + 3 83.3 22.2 30.6 30.6 1.6 +++ 0.2 80.6 11.1 22.2 27.7 1.3 ++ 0.2 89 16.6 30.6 38.9 2.1 +++ 0.2 80.6 8.3 16.6 25.0 1.6 ++ Môi trường sử dụng : MS + g/L agar + 30g/L sucrose, pH 5.7 Chú thích : - : Chồi nhỏ, yếu, mẫu cấy chuyển màu vàng nhạt + : Chồi nhỏ, yếu, mẫu cấy xanh nhạt + + : Chồi sinh trưởng chậm, nhỏ, mẫu cấy xanh + + + : Chồi xanh, sinh trưởng tốt, hình thái bình thường, mẫu cấy xanh Kết bảng cho thấy : Nếu môi trường có ổ sung hormon sinh trưởng cho tỷ lệ sống 80%, mẫu cấy xanh Còn công thức đối chứng không bổ sung hormon sinh trưởng tỷ lệ mẫu sống khoảng 70%, chồi nhỏ yếu, mẫu cấy vàng nhạt Trong môi trường nuôi cấy không bổ sung auxin (IAA), sử dụng nồng độ 44 BAP khác cho tỷ lệ tái sinh chồi khác Khi không bổ sung với lượng nhỏ BA từ – mg/L tỷ lệ mẫu chồi thấp (11.1 - 19.5%) Với nồng độ BAP 3mg/L cho kết chồi tái sinh cao chiếm 30.6%, chồi xanh, sinh trưởng tốt, hình thái bình thường Như BAP có tác dụng kích thích phân hóa chồi nồng thích hợp 3mg/L Khi kết hợp BAP nồng độ khác với nồng độ nhỏ 0.2 mg/L IAA, kết cho thấy tái sinh chồi khác Nồng độ BAP thấp (1mg/L) cao (3mg/L) cho khả tái sinh chồi (27.7 25.0 %) kết hợp với mg/L BAP cho hiệu tái sinh chồi cao nhiều 38.9% Kết hợp hai nồng độ BAP 2mg/L IAA 0.2 mg/L cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao mà số chồi trung bình mẫu (2.1 chồi) lớn nồng độ nghiên cứu khác, cho chồi xanh, sinh trưởng bình thường Mẫu công thức đối chứng không bổ sung hormon công thức mg/L BAP; mg/L BAP; mg/L BAP + 0.2 mg/L IAA cho tỷ lệ chồi thấp mà số chồi trung bình mẫu thấp (1 – 1.5 chồi), chồi nhỏ yếu Như kết hợp 2mg/L BAP 0.2 mg/L IAA môi trường MS cho hiệu tái sinh chồi cao Khi kết hợp BAP nồng độ cao thấp với 0.2 mg/L IAA ức chế hình thành phát triển chồi Vì môi trường tái sinh chọn lọc chuyển gen môi trường MS bổ sung 2mg/L BAP 0.2 mg/L IAA tốt 45 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Cam ăn có giá trị kinh tế cao, phù hợp với điều kiện địa hình nước ta Do việc đầu tư nghiên cứu nuôi cấy mô invitro Cam để chọn lọc giống có chất lượng đem lại lợi nhuận kinh tế to lơn cho nước ta Qua trình nghiên cứu bước đầu tìm số yếu tố ảnh hưởng tới trình sinh trưởng phát triển Cam trình nuôi cấy mô sau: Tìm môi trường khử trùng hạt tốt dung dịch Johson 10%, dung dịch vừa rẻ, lại rễ làm việc khử trùng hạt Tìm vật liệu nuôi cấy ban đầu đoạn epicotyl (trụ mầm) Vật liệu nhanh chóng tạo callus tạo chồi to, khỏe, xanh Đây liệu tốt đồng nuôi cấy môi trương với vật liệu khác Tìm ảnh hưởng hoomon bổ sung vào tới khả nhân chồi, BA 5.2 Đề nghị Do Cam than gỗ cho lên thời gian sinh trưởng kéo dài, với việc nghiên cứu nuôi cấy mô Cam nước ta, để đưa Cam trông công nghiêp nước ta có số kiến nghị sau: Do thời gian thực tập có hạn, đề nghị tiếp tục nghiên cứu đề tài để tìm môi trường thích hợp để nuôi cấy mô invitro Cam Ngoài môi trường mà chung tìm ra, tìm them môi trường phù hợp Cần có đề tài sâu nuôi cấy mô Cam để rút ngắn thời gian sinh trương Cam 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Đỗ Năng Vịnh cộng 2005 “Nghiên cứu chọn tạo giống hạt từ giống cam sành, cam vân du, bưởi phúc trạch, quýt chum” Báo cáo tổng kết khoa học Đỗ Năng Vịnh, 2005 “Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng” NXB Nông nghiệp Hà Nội, 2005 Hoàng Ngọc Thuận, “Kỹ thuật chọn tạo trồng cam quýt phẩm chất tốt, suất cao”, NXB Nông nghiệp Đường Hồng Dật, “Nghề làm vườn – Cây ăn miền”, NXB Văn hóa dân tộc Vũ văn Vụ, Vũ tâm, Hoàng minh tấn, 1998 Sinh lý thực vật Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn, 1998 Sinh lý thực vật Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Văn Hiển CTV (2000), Chọn giống trồng, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội Lê Đình Lương (1995), Thủy canh R& D Hydroponics, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội Minh Sơn (2004), Tưới nước thải- dè chừng, Báo Khoa học Đời sống, Thứ ngày 30/8/2004 Ngô Gia Thành (2000), Nghiên cứu hàm lượng kim loại nặng (Hg, Cd, Pb) có thịt lợn số vùng thuộc đồng Bắc bộ, Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Tài liệu tham khảo tiếng Anh 10.Trigiano, R N Gray D J., Plant tissue culture consepts and laboratory execise CRC Press Florida, America 11 Acciarri, N., F Restaino, G Vitelli, D Perrone, M Zottini, T Pandolfini, A Spena and G.L Rotino 2002 Genetically modified parthenocarpic eggplants: improved 47 fruit productivity under both greenhouse and open field cultivation BMC Biotechnology 2: 12 Anderson C 2000 Scion cultivar development in concordia, Argentina, Proceeding of the International Society of Citriculture, th Congress, Orlando, Florida December – 7, Vol (I), pp 39-41 13 Binh X N., Wakana A., Park S M., Nada Y And Fukudome I 2001 “Pollen tube bihaviors in self-incompatible and self-compatible citrus cultivars” Journal of Faculty of Agriculture, Kyushu University, pp 443 – 457 14 Carmi, N., Y Salts, B Dedicova, S Shabtai, M Pilowsky and R Barg 1997 Transgenic parthenocarpy due to over-sensitization of the ovary to auxin Acta Hort 447: 579-581 15 Dodds J H Roberts L W., 1999 Experiments in plant tissue culture Cambridge University Press 48 [...]...Xác định được kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào in vitro ở cây cam Xây dựng quy trình nuôi cấy mô cây cam làm cơ sở cho tạo nguồn mẫu ban đầu và nhân nhanh mẫu 1.2.2 Yêu cầu Tìm ra môi trường khử trùng hạt giống tối ưu Tìm ra bộ phận nuôi cấy tối ưu trên môi trường rắn Tìm ra môi trường tái sinh cây tối ưu Xác định được ảnh hưởng của một số loại hoocmon tới khả... ra quy trình nuôi cấy mô nhằm bảo quản và tạo nguồn gen cây ăn quả có múi sạch bệnh trong điều kiện in vitro Viện nghiên cứu Cây ăn quả Miền Nam cũng đã thành công khi nghiên cứu nhân giống gốc ghép loài Carrizo Citrange và Volkamer bằng kỹ thuật nuôi cấy mô để phục vụ cho mục đích sản xuất thử một số loại gốc ghép cho cây có múi phục vụ cho nhu cầu sản xuất cũng như làm tiền đề nghiên cứu nuôi cấy mô. .. trong các mục tiêu đối với các nhà chọn tạo giống cây có múi là hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô cây có múi tạo cơ sở cho việc nhân nhanh cây, tạo nguồn vật liệu sạch bệnh, giống tốt để tạo các giống quả không hạt và các giống chuyển gen khác 2.3.3 Ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây ăn quả có múi ở Việt Nam Ở nước ta, công nghệ nuôi cấy mô tế bào đã được đưa vào từ khá lâu, nhưng nó... với cây họ cam quýt là làm sao tạo được quả không hạt bằng cách kích thích tạo tính vô phối mà không cần thụ phấn bổ sung và như thế sẽ không ảnh hưởng đến tỷ lệ đậu quả, kích thước và khối lượng quả 2.3.2 Ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây ăn quả có múi trên thế giới Người ta đã rất thành công trong kỹ thuật nuôi cấy mô cây thân thảo Nuôi cấy mô cây thân gỗ, trong đó có nhóm cây. .. gen vào cây citrus, thành công của đề tài có ý nghĩa trong việc mở ra một hướng nghiên cứu tạo quả không hạt mới cho một số cây ăn quả khác ở Việt Nam 24 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu và tìm ra được các môi trường thích hợp và vật liệu thích hợp với việc nuôi cấy mô: Môi trường khử trùng hạt, Vật liệu nào thích hợp nhất cho viec tái sinh cây, môi trường... nao tai sinh cây tốt nhất Nghiên cứu hoàn thiện quy trình tái sinh cây từ các bộ phận của cây in vitro mọc lên từ vật liệu khởi đầu 3.2 Đối tượng nghiên cứu Giống Cam Vinh đã được thu thập và hiện đang lưu giữ tại bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, và một số giống khác được bộ môn sinh học ứng dụng cất giữ 3.3 Vật liệu Các bộ phận (thân, lá, rễ) của cây in vitro mọc... Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại hoocmon bổ sung vào môi trường đến hệ số nhân chồi: Với CT tối ưu 2 đem nuôi cấy trên 3 môi trường khác nhau: CT1 : Môi trường MT nền + 3mg/l BAP 26 CT2 : Môi trường MT nền + 0,5mg/l BA CT3 : Môi trường MT nền + 500mg/l Mal ex tract + 0,1mg/l NAA + 10mg/l BA Sau thí nghiệm 3 tìm ra môi trường tối ưu để tái sinh cây 3.6 Phương pháp tiến hành - Hạt được rửa sạch bằng... thiện quy trình tái sinh cây từ các bộ phận của cây in vitro 4 tuần tuổi 4.2 Vật liệu nghiên cứu Các thí nghiệm được tiến hành đồng thời trên 5 giống nghiên cứu Các giống tham gia thí nghiệm gồm có: Cam vinh (CV), Cam đường canh (CĐC), QT (Giống Cam trung quốc) , 21 - sông con, Mandarin.5- orange chanh, 8-orange chanh Đây là các giống Cam ngon và có chất lượng cao đã được cộng nhận trên thị trường Môi... cần rửa lại bằng nước cất vô trùng Gieo một hạt vào một ống nghiệm chứa môi trường MS + 30g/L saccarose + agar, pH Để trong tối khoảng 2 tuần Để trong tối 2 tuần giúp cây phát triển nhanh và than vươn dài giúp cho việc nuôi cấy mô được tiến hành nhanh chong ko phải chờ đợi lâu Sau khi cây cao tầm 8-9cm thì chuyển ra phòng nuôi cấy mô khoảng 1 - 2 tuần với chế 28 ... mọc lên từ vật liệu khởi đầu (hạt giống) Hạt tươi của giống Cam Vinh tách từ quả chín được khử trùng và gieo trong điều kiện in vitro trên môi trường rắn MS + 30g/L saccarose + agar Thời gian nuôi cấy khoảng từ 3 đến 4 tuần (2 - 3 tuần tối, 1 tuần sáng) 3.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu - Địa điểm nghiên cứu: Phòng nuôi cấy mô thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng, khoa Công nghệ sinh học, trường ... Xây dựng quy trình nuôi cấy mô cam 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích Xác định giống Cam tạo vô phối, tạo tạo hạt không hạt Xác định kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào in vitro cam Xây dựng quy trình. .. sang môi trường tái sinh chồi Các điều kiện nuôi cấy: + Điều kiện nuôi cấy vô trùng + Vô trùng dụng cụ môi trường Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, thao tác với mẫu cấy tiến hành buồng cấy vô... hạt phấn cho nuôi cấy 31 Phụ thuộc vào mẫu có nuôi cấy thành công hay không? Nếu nuôi cấy mô sẹo hay nuôi cấy phôi thực với số đối tượng phải chuyển sang chọn đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy - Phương