Xây dựng quy trình nuôi cấy mô cây cam

Tuy nhiên, các giống này phần lớn đều có nhiều hạt đã làm giảm chất lượng quả và khó có thể xuất khẩu ra một số thị trường khó tính như Mỹ, Nhật Bản và Châu Âu, vì thế cần thiết phải tìm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘIKHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- 

 -BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

Xây dựng quy trình nuôi cấy mô cây cam

Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Phan Hữu Tôn

TS Vũ Thị Đào Khoa Công nghệ sinh học Trường ĐHNN HN

Sinh viên thực hiện : Đỗ Đức Trọng Lớp : CNSH - K51

“Khóa luận đệ trình Khoa CNSH, Trường ĐH Nông Nghiệp Hà Nội là một phần yêu cầu của trình độ đại học ngành Công nghệ sinh học".

HÀ NỘI - 2010

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 2

MỤC LỤC 3

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .5

DANH MỤC BẢNG 6

DANH MỤC HÌNH 7

TÓM TẮT 8

PHẦN I: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 3

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Giới thiệu chung về cây có múi 4

2.1.1 Tình hình chung về cây có múi 4

2.1.2 Đặc điểm thực vật : 5

2.1.3 Nhu cầu sinh thái 6

2.1.4 Sự phân hoá (differentiation) 7

2.1.5 Sự ra hoa và đậu trái 8

2.1.6 Sự rụng trái non 10

2.1.7 Sự phát triển trái 12

2.2 13

2.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi trên thế giới 13

2.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi ở Việt Nam 13

2.3 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây ăn quả có múi17 2.3.1 Sơ lược lịch sử chọn tạo giống cây ăn quả có múi 17

2.3.2 Ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây ăn quả có múi trên thế giới 20

2.3.3 Ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây ăn quả có múi ở Việt Nam 21

2.3.4 Ứng dụng của công nghệ nuôi cấy mô tế bào ở Việt Nam 23

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 Nội dung nghiên cứu 25

3.2 Đối tượng nghiên cứu 25

3.3 Vật liệu 25

3.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 25

3.5 Phương pháp nghiên cứu 25

3.6 Phương pháp tiến hành 27

PHẦN IV: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

4.1 Nội dung nghiên cứu 28

4.2 Vật liệu nghiên cứu 28

4.3 Phương pháp nghiên cứu 28

4.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 33

4.4.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng hạt giống đến tỷ lệ nhiễm khuẩn 33

4.4.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn vật liệu nuôi cấy tới khả năng tạo chồi 37

4.4.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại hoocmon bổ sung vào môi trường đến hệ ố nhân chồi 41

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46

5.1 Kết luận 46

5.2 Đề nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

A, T, G, C Adenine, Thymine, Guanine, Cytosine

ADN Acid deoxyribonucleic

ARN Acid Ribonucleic

bp base pair

CCV Chanel catfish virus

CEFAS Center for Environment, Fisheries & Aquaculture Science

CHV cyprinid herpesvirus

CNGV carp nephritis and gill necrosis virus

CPE Cytopathogenic effect

CyHV-1 Cyprinid herpesvirus-1

CyHV-2 Cyprinid herpesvirus-2

EDTA ethylene diamine tetraacetic acid

ELISA enzyme-linked immunosorbent assay

EU European Union

FAO Food and Agriculture Organization

IFAT Indirect fluoescent antibody test

kbp kilo base pair

KF-1 koi fin

KHV Koi herpesvirus

KHVD Koi herpesvirus disease

LB Luria-Bertani

MCS multiple cloning site

NCBI National Center for Biotechnology Information

OATA Ornamental Aquatic Trade Association

OIE Office International des Epizooties (The World Organisation for Animal Health)orf open reading frame

PCR Polymerase Chain Reaction

SVC Spring Viraemia of Carp

TAE Tris Acetic EDTA

tk thyamidine kinase

VAC Vườn-Ao-Chuồng

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Đo kết quả nhiễm ở cây Cam 14 ngày tuổi 33Bảng 2: Đo chiều cao Cam Vinh 28 ngày tuổi 34Bảng 3: Đo nhiễm khuẩn của cây Cam sau 5 ngày cấy 38Bảng 4: Ảnh hưởng của nguồn vật liệu nuôi cấy tới khả năng tạo chồi

ở Cam Vinh 38Bảng 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại hoocmon bổ sung vào môi trường đến hệ ố nhân chồi 41Bảng 6: Ảnh hưởng của BAP và IAA đến khả năng tái sinh chồi ở Cam Vinh .44

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Hoa một số loại cây có múi: a) Cam Sành; b) Chanh Tàu 6

Hình 2: Hoa Cam Vinh: a) Bông không có lá; b) bông có lá 11

Hình 3: Sự rụng trái non trên Cam Vinh giai đoạn 20 ngày sau khi đậu trái 11

Biểu đồ 1 Tỷ lệ nhiễm số hạt reo sau 2 tuần tuổi 34

Biểu đồ 2 Chiều cao cây trung bình sau 28 ngày tuổi 35

Biểu đồ 3 Tỷ lệ nảy mầm của cây sau 14 ngày theo dõi 35

Hình 4: ảnh hưởng của hóa chất khử trùng hạt giống

36

Biểu đồ 4 Ảnh hưởng của nguồn vật liệu nuôi cấy tới hệ số nhân chồi sau 8 tuần 39

Hình 5 Ảnh hưởng của nguồn vật liệu epicotyl 40

Hình 6 Vật liệu epicoyyl tạo chồi khỏe và sinh trưởng tốt 40

Biểu đồ 5 Ảnh hưởng của một số loại hoocmon bổ sung vào môi trường đến hệ số nhân chồi 42

Hình 7 Ảnh hưởng của MT nền + 3mg/l BAP đến khả năng hình thành chồi42 Hình 8 Ảnh hưởng của MT nền + 0,5mg/l BA đến khả năng hình thành chồi .43

TÓM TẮT

PHẦN I: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cam là cây ăn quả cao cấp có giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao Trong thành phần quả thịt có hứa 6 - 12% là đường (chủ yếu là đường saccaroza) và hàm lượng vitamin từ 40 - 90mg/100g tươi ,các axit hữu cơ từ 0,4 - 1,2 % ,trong đó có nhiều loại axit có hoạt tính sinh học cao cùng với các chất khoáng và dầu thơm

Quả cam dùng để ăn tươi, làm mứt, nước giải khát và chứa bệnh rất tốt Tinh dầu cất từ vỏ quả, lá, hoa được dung trong công nghiệp thực phẩm và chế mỹ phẩm Trồng cam chóng cho thu quả và lãi suất cao hơn nhiều loại cây ăn quả khác

Ở nước ta,1 ha cam có thời kỳ khoảng 8 năm tuổi sẽ cho năng suất trung bình là 16 tấn/1ha, lãi thuần đạt được chừng 10 - 12 triệu đồng/1 năm ,những năm về sau năng suất trung bình tăng ,có thể lên tới 50 - 60 tấn/năm thu được 40 - 50 triệu đồng/1 ha

Cây cam có thể sống và cho thu hoặch quả trong vòng 25-30 năm Nếu ở điều kiện đất tốt , điều kiện thâm canh cao ,khí hậu thích hợp ,tuổi thọ của cây cam

có thể kéo dài 50-100 năm Theo thống kê năm 1990 diện tích trồng cam ở nước ta ước tính gần 19000 ha, sản lượng 119000 tấn quả Trong đó các tỉnh phía nam có sản lượng lớn hơn còn các tỉnh phía bắc lại cho chất lượng cao hơn

Nước ta nằm ở trung tâm phát sinh của rất nhiều giống cây ăn quả có múi (Võ Văn Chi, 1997; Phạm Hoàng Hộ, 1992) Nhưng tính bình quân lượng tiêu thụ quả có múi/đầu người mới đạt khoảng 5,0 kg/năm (Tổng cục thống kê, 2000), con

số này quá thấp so với tiêu thụ bình quân trên thế giới và ở các nước EU Mỗi năm nước ta vẫn phải nhập khẩu một lượng lớn cam quýt từ nước ngoài Để đạt mức tiêu thụ quả có múi trung bình trên thế giới trong 10 năm tới, nước ta phải sản xuất thêm khoảng 800.000 đến 900.000 tấn mỗi năm, hay phải mở rộng thêm khoảng 40.000

ha trồng mới cây ăn quả có múi, trong đó chủ yếu là cam, bưởi, quýt với năng suất trung bình phải đạt trên 20 tấn/ha Muốn mở rộng diện tích ở quy mô trên, sản xuất cần khoảng 20 triệu cây giống tốt, sạch bệnh Sản xuất cây ăn quả có múi ở nước ta

tăng nhanh, nhưng còn gặp nhiều khó khăn do dịch bệnh và chất lượng giống và chưa đáp ứng được nhu cầu của thị trường về ăn tươi và chế biến.

Chọn giống truyền thống có những hạn chế như giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng của cây kéo dài, thường xảy ra không tương hợp cùng loài và khác loài, hiện tượng đa phôi… Kỹ thuật phổ biến là ghép làm giảm giai đoạn này nhưng không phải luôn cho kết quả mong muốn Các đặc tính này làm cho công tác chọn giống

và nhân giống truyền thống ở cam quýt khó, tốn kém và thời gian kéo dài Một trong các hướng quan trọng để tạo được nguồn giống sạch bệnh là sử dụng công

nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật và vi ghép Cây tái sinh in vitro là nguồn vật liệu

quan trọng cho tạo giống không hạt và là vật liệu cho nghiên cứu chuyển gen trong tương lai Ở nước ta hiện nay có nhiều giống địa phương có chất lượng cao như bưởi Năm Roi, Phú Trạch, Da xanh, Đoan Hùng, Diễn và nhiều giống cam quýt khác đang trồng như cam Sành (Hà giang, Tuyên Quang), cam Xã đoài (Nghệ An), cam Vân du (Thanh hoá); quýt vàng vỏ giòn, quýt chum (Hà giang) Tuy nhiên, các giống này phần lớn đều có nhiều hạt đã làm giảm chất lượng quả và khó có thể xuất khẩu ra một số thị trường khó tính như Mỹ, Nhật Bản và Châu Âu, vì thế cần thiết phải tìm cách làm cho quả của các giống này không hoặc có ít hạt Ngày nay, công nghệ sinh học phát triển mạnh mẽ, đặc biệt là công nghệ nuôi cấy mô tế bào

đã trở thành công cụ hữu hiệu và đắc lực trong việc tạo ra nguồn giống sạch bệnh với số lượng lớn, chất lượng cao Để tạo được giống vô phối không hạt trên cơ sở các giống cam quýt đặc sản của nước ta thì cần phải sử dụng công nghệ chuyển gen

trong đó khâu nhân nhanh in vitro là một việc hết sức quan trong quyết định thành

công chuyển gen hay không nhằm tạo ra nguồn cây giống sạch bệnh với hệ số nhân

cao Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng quy trình nuôi cấy

mô cây cam”.

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Xác định được giống Cam tạo ra cây vô phối, tạo ra cây tạo quả ít hạt hoặc không hạt

Xác định được kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào in vitro ở cây cam.

Xây dựng quy trình nuôi cấy mô cây cam làm cơ sở cho tạo nguồn mẫu ban đầu và nhân nhanh mẫu

1.2.2 Yêu cầu

Tìm ra môi trường khử trùng hạt giống tối ưu

Tìm ra bộ phận nuôi cấy tối ưu trên môi trường rắn

Tìm ra môi trường tái sinh cây tối ưu

Xác định được ảnh hưởng của một số loại hoocmon tới khả năng tái sinh

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây có múi

2.1.1 Tình hình chung về cây có múi

Cây ăn quả có múi được trồng từ thời cổ xưa nên rất khó xác định được trung tâm phát sinh cụ thể của chúng (Đỗ Năng Vịnh, 2008) Chúng bao gồm rất nhiều loài như cam ngọt, cam chua, chanh, quýt, bưởi và vô số con lai tự nhiên giữa chúng

Nước ta được xem là một trong những trung tâm phát sinh đa dạng sinh học của cây có múi, 11 loài gồm nhiều giống khác nhau đã được sưu tập Ví dụ ở miền

Bắc Việt Nam có: Citrus Sinensis, C limon, C aurantifolia, C aurantium, C

jabihsi, C reticulate, C grandis, C paradise, C medica, C Sinensis × C reticulate, Citrus sp (Đỗ Đình Ca, 1996) Tuy nhiên việc phân loại cây ăn quả có

múi rất phức tạp và còn nhiều tranh cãi Theo Võ Văn Chi (1997) và Phạm Hoàng

Hộ (1992), các loài thuộc chi Citrus ở nước ta có thể phân loại như sau:

Pummelo, Pamplemuosse, Grapefruit

5 Citrus japonica Thunb =

Fortunella japonica

Quất

8 Citrus sarcodactylis Noot Phật thủ

2.1.2 Đặc điểm thực vật :

Hoa cây có múi thuộc loại hoa đơn hay chùm, mọc từ nách lá, thường là hoa lưỡng tính Hầu hết các loại cam quýt đều tự thụ phấn, tuy nhiên cũng có thể có loài thụ phấn chéo như một số loài quýt Sự thụ phấn chéo sẽ làm tăng năng suất nhưng trái sẽ có nhiều hạt

Sự phân hoá và kích thích ra hoa:

Sự kích thích mầm hoa bắt đầu với sự dừng sinh trưởng dinh dưỡng trong thời gian nghỉ đông ở vùng Á nhiệt đới hoặc trong thời gian khô hạn ở vùng nhiệt đới Nói chung, trên cây trưởng thành, sự sinh trưởng của chồi dừng và tỷ lệ sinh trưởng của rễ giảm trong mùa đông ngay khi nhiệt độ xuống chưa đến 12,50C Trong thời gian sinh trưởng này mầm phát triển khả năng ra hoa Do đó, sự kích thích ra hoa bao hàm sự kiện trực tiếp chuyển từ sinh trưởng dinh dưỡng sang ra hoa (Davenport, 1990) Davenport (1990) và Garcia-Luis và ctv (1992) cho rằng sự tượng mầm hoa có thể xảy ra trước sự kích thích nhưng những bằng chứng về vấn

đề nầy còn giới hạn Nhiệt độ thấp và khô hạn là hai yếu tố kích thích đầu tiên, trong đó nhiệt độ thấp là yếu tố đầu tiên ở vùng Á nhiệt đới trong khi khô hạn là yếu

tố kích thích ra hoa cho cam quýt ở vùng nhiệt đới Nhiệt độ dưới 250C trong nhiều tuần lễ là yêu cầu kích thích mầm hoa (Inoue, 1990) Ngưỡng nhiệt độ thấp cảm ứng ra hoa là 190C trong vài tuần và ngưỡng tối thấp là 9,40C Số hoa sản suất tỉ lệ với sự khắc nghiệt của nhiệt độ thấp hoặc khô hạn Nhiệt độ càng thấp hay sự khô hạn càng khắc nghiệt tỉ lệ ra hoa càng cao Ngoài ra, tỉ lệ phát hoa có lá hoặc không

lá có liên quan với sự khắc nghiệt của Stress Điều kiện stress càng khắc nghiệt sẽ tạo ra nhiều bông không mang lá Ở ngoài đồng, sự khô hạn dài hơn 30 ngày kích thích số mầm hoa có ý nghĩa Mầm hoa được kích thích trong điều kiện khô hạn

nhưng chỉ phát triển nhiệt độ ấm lên hoặc ẩm độ đất tăng (không còn “xiết nước”) Thường cây sẽ ra hoa sau khi tưới nước 3 - 4 tuần Thời gian từ khi cảm ứng ra hoa đến khi hoa nở thay đổi từng năm Áp dụng GA3 trong giai đoạn kích thích ra hoa

sẽ ngăn cản sự kích thích và sự ra hoa tiếp theo (Davenport, 1990) Hoa cây có múi thuộc loại hoa đơn hay hoa chùm, mọc từ nách lá, thường là hoa lưỡng tính

Hình 1: Hoa một số loại cây có múi: a) Cam Sành; b) Chanh Tàu

Hầu hết các loại Cam Quýt đều tự thụ, tuy nhiên cũng có thể có loài thụ phấn chéo như một số loài Quýt Sự thụ phấn chéo sẽ làm tăng năng suất nhưng trái sẽ có nhiều hạt

2.1.3 Nhu cầu sinh thái

- Nhiệt độ: Cây có múi (cam, quít, bưởi) có thể sống và phát triển được trong khoảng nhiệt độ 13-380C, thích hợp nhất là 23-290C Dưới 130C cây ngừng sinh trưởng, dưới âm 50C cây sẽ bị chết

- Ánh sáng: Cây có múi không thích hợp với ánh sáng trực tiếp, cường độ ánh sáng thích hợp nhất cho cam quít khoảng 10.000-15.000 lux (tương đương với ánh sáng lúc 8 giờ sáng và 4-5 giờ chiều trong mùa nắng)

- Nước: Cây có múi có nhu cầu về nước rất lớn, nhất là trong thời kỳ cây ra hoa và phát triển trái Mặt khác, cây có múi cũng rất mẫn cảm với điều kiện ngập nước Trong mùa mưa, nếu mực nước ngầm trong đất cao và không thoát nước kịp, cây sẽ bị thối rễ, vàng lá và chết

- Đất đai: Cam, quít, bưởi thích hợp với các loại đất có tầng canh tác dày từ 0,5-1 m, đất thịt pha, màu mỡ, thoát nước tốt, thoáng khí, pH từ 5-7

+ Yêu cầu sinh thái

- Nhiệt độ : Cam quýt có thể song và phát triển ở 13°c-39ºc,thích hợp nhất từ 23-29ºc,ngừng sinh trưởng dưới 13ºc và chết -5ºc.

Nhiệt độ ảnh hưởng đến phẩm chất và phát triển của trái.Ở ĐBSCL do có nhiệt độ cao và ẩm độ thấp nên trái thường chín sớm,vị ngọt,nhưng vỏ có màu sắc không đẹp

- Ánh sáng: Cam quýt không thích ánh sàng trực tiếp và cường độ ánh sáng thích hợp là 10000-15000 lux (tương đương ánh sáng lúc 8 giờ sáng hoặc 4-5 giờ chiều ở Việt Nam)

-Vũ lượng: Cam quýt cần khoảng 1000-2000mm/năm và phân bố đều trong năm

- Đất đai: Đất trồng cam quýt phải có tầng canh tác dày 0,5-1m.Đất thịt

pha,thong thoáng,thoát nước tốt,màu mỡ,độ pH từ 5-7 là thích hợp cho cam quýt

* Một số giống trồng phổ biến:

- Cam mật: Dạng trái tròn,vỏ dày 3-4mm,màu xanh đến xanh vàng,thịt trái

vàng cam,ngọt đậm,khá nhiều nước.Tuy nhiên nhiều hạt (13-20 hạt/trái ),trọng lượng trung bình 20g/trái

- Cam sành: Dạng trái hơi tròn,vỏ trái dày,sần sùi,thịt trái màu cam,khá nhiều nước,ngon ngọt nhiều hạt(15 hạt/trái).Trọng lượng trái trung bình 200-250g/trái

- Quýt Vinh: Dạng trái tròn,dẹp 2 đầu,khá dể bóc vỏ,thịt trái màu cam hoặc vàng cam,khá ráo nước,ngọt có pha vị chua,số hạt trên trái nhiều (12-15 hạt/trái),trọng lượng trái trung bình 140-170g/trái

- Quýt đường: Dạng trái tròn,vỏ mỏng,màu xanh đến xanh vàng,dễ bóc vỏ,thịt trái màu cam ngọt đậm,số hạt trên trái nhiều ( 7-11 hạt/trái ) Trọng lượng trái trung bình 150-200g/trái

2.1.4 Sự phân hoá (differentiation)

Mầm hoa bao gồm sự thay đổi về mô học và hình thái học chuyển mô sinh trưởng dinh dưỡng trở thành một mô phân sinh hoa (Davenport, 1990) Khi mà mầm đài hoa được hình thành thì mầm hoa sẽ không biến đổi lại thành chồi dinh

dưỡng ngay khi xử lý GA3 (Lord và Eckard, 1987) Tình trạng sắp xếp của đỉnh tận cùng quyết định quá trình tiếp theo và sự xếp đặt của mầm chồi bên Nếu đỉnh tận cùng hình thành đài hoa thì mầm chồi bên cũng sẽ hình thành hoa Nếu đỉnh hình thành lá thì mầm bên sẽ hình thành gai.

2.1.5 Sự ra hoa và đậu trái

Hoa hình thành và phát triển trên cành một năm tuổi Trên cành vượt thường

ra bông lá trong khi trên gỗ già thường ra bông không mang lá Cây còn tơ, ra hoa chưa ổn định thường ra hoa không tốt như cây trưởng thành

Hầu hết các loại cam quýt đều tự thụ phấn Một số loài quýt có đặc tính tự bất thụ là quýt Clementine, quýt Orlando, Quýt Minneola, quýt Sunburst Do đó, khi thiết kế vườn cần chú ý nguồn phấn giúp cho các cây nầy đậu trái Cây cho phấn thường được bố trí theo tỉ lệ 3:1 hay 4:2 Côn trùng như ong mật thụ phấn hiệu quả hơn gió Một đàn ong có khả năng thụ phấn cho 0,8 ha diện tích trồng cây có múi Các yếu

tố ảnh hưởng lên sự ra hoa: Các yếu tố quan trọng liên quan đến sự ra hoa trên cây

có múi là: các chất đồng hoá, chất điều hoà sinh trưởng, nhiệt độ, chế độ nước và dinh dưỡng (Davenport, 1990)

Lý thuyết về các sản phẩm đồng hoá dựa trên kết quả của biện pháp khoanh cành hay khấc thân đã làm tăng sự kích thích ra hoa, sự đậu trái và hàm lượng tinh bột trong cành, có lẽ do sự ngăn cản sự vận chuyển các sản phẩm carbohydrate trong mạch libe đến rễ Ngược lại, cũng có những nghiên cứu cho rằng không có sự liên hệ giữa hàm lượng tinh bột trong lá và chồi non với sự ra hoa của cây có múi (Davenport, 1990) Tuy nhiên hàm lượng carbohydrate trong rễ trong một số trường hợp có liên quan đến sự ra hoa trên cây quýt ra trái cách năm Hàm lượng carbohydrate trong rễ thấp do cây mang trái quá nhiều có ảnh hưởng đến sự ra chồi

và ra hoa

Vai trò của các chất điều hoà sinh trưởng lên sự ra hoa của cây có múi cũng được nghiên cứu (Davenport, 1990) Phun gibberelin lên lá trước khi phân hoá mầm hoa có thể ức chế sự ra hoa (Monselise và Halevy, 1964) Do đó, sự hiện diện của gibberellin có thể ảnh hưởng đến sự ra hoa Tuy nhiên, những nghiên cứu sự biến

động của hàm lượng GA3 nội sinh cho thấy không có sự liên quan có ý nghĩa giữa GA3 và kiểu chồi sinh trưởng hay sinh sản (Davenport, 1990).

Tình trạng dinh dưỡng của cây có liên quan trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự ra hoa của cây Hàm lượng đạm cao trong cây còn tơ có thể kích thích sự sinh trưởng quá mạnh và sản xuất chồi sinh trưởng hơn là chồi sinh sản Ngược lại mức độ đạm thấp thúc đẩy ra hoa nhiều mặc dù sự đậu trái và năng suất thấp Sự thiếu đạm nghiêm trọng sẽ sản xuất ít hoa Do đó, duy trì mức đạm trong lá tối hảo từ 2,5-2,7% sẽ cho số lượng hoa trung bình nhưng sẽ có sự đậu trái và năng suất cao nhất Đạm dạng ammonium có thể ảnh hưởng trực tiếp đến sự ra hoa thông qua sự điều chỉnh ammonia và hàm lượng polyamine trong chồi (Lovatt, 1988) Nhiệt độ thấp

và stress do khô hạn làm tăng hàm lượng ammonium trong lá và sự ra hoa Hơn nữa, phun urê cho cam Navel ở California trong mùa đông làm tăng hàm lượng ammonia trong lá và trong mầm và số hoa trên cây Số hoa có tỉ lệ thuận vói thời gian kích thích của nhiệt độ thấp Tương tự, phun urê 1% ở giai doạn 6 - 8 tuần trước khi hoa nở làm tăng số hoa và năng suất cây cam Shamouti 9 năm tuổi (Rade and van de Walt, 1992)

Sự đậu trái bị ảnh hưởng rất mạnh bởi nhiệt độ và sự khô hạn Thông thường phát hoa có lá đậu trái cao hơn so với phát hoa không có lá; chồi có tỉ lệ lá/hoa cao

sẽ có tỉ lệ giữ trái đến khi thu hoạch cao Nhiệt độ cao (>35oC) và sự khô hạn dễ gây ra sự rụng trái non Nhiều tác giả cho rằng sự rụng sinh lý khi trái có kích thước

từ 0,5 - 2,0 cm có liên quan đến chất điều hoà sinh trưởng, nước và các chất carbohydrate

* Hiện tượng ra trái cách năm

Hiện tượng ra trái cách năm xuất hiện trên hầu hết các vùng trồng cây có múi trên thế giới Có thể xuất hiện trên một phần cây, một số cây hoặc cả khu vực Ở Florida: Xuất hiện nhiều trên quýt, nhẹ trên cam, ít xuất hiện trên bưởi

Hiện tượng ra trái cách năm làm giảm năng suất, trái nhỏ Điều khiển cho cây ra trái đều hàng năm tốt hơn năng suất biến động từ năm nầy sang năm khác Nguyên nhân hiện tượng ra trái cách năm có thể do sự bất lợi của môi trường, sự khô hạn hoặc dịch hại sau khi đậu trái

Để khắc phục hiện tượng ra trái cách năm trên cây có múi người ta thường

áp dụng một số biện pháp sau:

* Biện pháp quản lý

Làm giảm sự ra hoa và đậu trái trong mùa thuận

Tỉa bớt trái trong mùa thuận

Tạo sự khô hạn trong thời kỳ trái non làm rụng bớt trái

Giảm lượng phân trong năm cho trái ít nhưng tăng lượng phân trong năm cây cho trái nhiều

Trường hợp cây cho trái quá nhiều có thể làm cho cây chết

* Biện pháp tỉa trái trên cành luân phiên áp dụng trên quýt “Aoshima’ ở Nhật

Khi trái còn non, ngắt bỏ toàn bộ trái trên một số cành, trong những cành khác cho nhiều trái từ 1,5-2 lần

Cành ngắt trái năm trước sẽ cho ra trái ở năm tiếp theo

Phương pháp nầy tạo ra trái có kích thước trung bình nhưng độ Brix caoChú ý: trên một số giống, cành có thể chết nếu mang quá nhiều trái

2.1.6 Sự rụng trái non

Có 5 loại chồi trên cây có múi sau khi kích thích ra hoa: a) Chồi sinh sản chỉ mang hoa trên cành hình thành mùa trước, không có mang lá; b) Chồi hỗn hợp có mang một ít hoa và lá; c) Chồi hỗn hợp có mang nhiều hoa và một ít lá lớn; d) Chồi hỗn hợp có mang ít hoa và nhiều lá; và e) Chồi sinh trưởng chỉ mang lá Chồi có mang lá thường có tỉ lệ đậu trái cao hơn chồi không có lá Thông thường chồi có mang nhiều lá như chồi loại (d) sẽ có tỉ lệ giữ trái đến khi trưởng thành cao nhất Phát hoa mang lá có tỉ lệ đậu trái cao hơn có lẽ do gia tăng sự đồng hoá CO2 và mức độ cung cấp carbohydrate hoặc do sự nối các mạch nhựa được cải thiện để làm trung gian cho trái phát triển bởi các chất điều hoà sinh trưởng từ các lá non mới hình thành hoặc khả năng chưa (sink) lớn hơn của các chồi hỗn hợp

(b)

Hình 2: Hoa Cam Vinh: a) Bông không có lá; b) bông có lá

Hình 3: Sự rụng trái non trên Cam Vinh giai đoạn

20 ngày sau khi đậu trái

Sự nối các mạch nhựa sẽ làm cho chồi có mang lá giảm sự thiếu nước hơn so với chồi chỉ mang hoa

Gibberellin và 2,4-D thường được áp dụng để cải thiện vỏ quả và sự rụng trái non trên cam Navel ở California (Mỹ) (Coggins, 1981) Phun GA3 làm tăng sự đậu trái cho cây có múi có đặc tính trinh quả sinh yếu mặc dù GA3 không có thể cải thiện sự đậu trái đối với tất cả các loại cây có múi Những hoa nở đợt đầu thường đậu trái kém hơn những hoa nở sau GA3 thường được áp dụng để tăng tỉ lệ đậu trái

và năng suất và sản xuất trái không hạt cho thị trường châu Âu

Sự rụng trái non bắt đầu sau khi ra hoa cho đến 3 - 4 tuần sau khi hoa nở Sự rụng trái non xảy ra nghiêm trọng khi nhiệt độ trên bề mặt lá từ 35 – 400C hoặc khi

cây bị khô hạn như ở vùng đất khô cằn ở miền Nam California hoặc ở Nam Phi Nhiệt độ cao và sự khô hạn nghiêm trọng làm cho khí khẫu bị đóng dẫn đến giảm

sự đồng hoá khí CO2 và sự rụng trái non gây ra bởi sự mất cân bằng của carbon

2.1.7 Sự phát triển trái

Sự phát triển trái của cây có múi theo đường cong đơn giản, gồm 3 giai đoạn như các loại trái cây khác :

(1) Giai đoạn phân chia tế bào : 4-6 tuần sau khi ra hoa

(2) Sự phát triển kích thước trái: Đối với Cam là hơn 6 tháng

(3) Giai đoạn trưởng thành : Ngắn hơn 2 tháng

Một số đặc tính của trái (như kích thước, hình dạng trái, cấu trúc và bề dày của con tép) được xác định trong 2 tháng đầu sau khi ra hoa Cây mang nhiều trái ảnh hưởng rất lớn đến tỉ lệ phát triển trái

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên đặc tính của trái:

Một số đặc tính của trái như kích thước, hình dạng, màu sắc, thời gian chín, TSS, TA bị ảnh hưởng rất mạnh bởi yếu tố khí hậu Tỉ lệ sinh trưởng của trái tối hảo trong điều kiện nhiệt độ từ 20-250C, nhiệt độ lớn hơn 300C và thấp hơn 130C ức chế sự sinh trưởng của trái Khí hậu ẩm, lạnh trái sẽ phát triển tốt hơn khí hậu khô, nóng Cấu trúc của con tép mịn trong điều kiện khí hậu ẩm Trong điều kiện Á nhiệt đới màu sắc trái phát triển tốt hơn trong điều kiện nhiệt đới Diệp lục tố bắt đầu bị phá huỷ khi nhiệt độ ban đêm thấp hơn 130C Trị số TSS cao nhất đạt được trong điều kiện nhiệt đới và Á nhiệt đới ẩm, nhiệt độ ban đêm cao làm giảm TSS ở vùng nhiệt đới Hàm lượng acid thấp và giảm nhanh khi nhiệt độ cao, hàm lượng acid cao nhất ở vùng bán sa mạc hoặc vùng sa mạc Á nhiệt đới

2.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi trên thế giới

Trong suốt hai thập kỷ qua, ngành sản xuất cam quýt trên thế giới không ngừng tăng nhanh và mức tiêu thụ quả có múi trên thị trường thế giới cũng ngày

càng cao Theo thống kê của FAO, tổng sản lượng citrus hàng năm đạt trên 105

triệu tấn trong giai đoạn 2000 – 2004 Có khoảng 140 nước trên thế giới sản xuất

quả citrus, tuy nhiên sản lượng tập trung ở những vùng nhất định Khoảng 60% sản

lượng toàn thế giới thuộc về 3 nước sản xuất quả có múi lớn nhất là Braxin, Mỹ, Trung Quốc Khoảng 60% sản lượng quả có múi được tiêu thụ dưới dạng quả tươi, 40% còn lại là dùng cho chế biến Braxin là nước sản xuất quả có múi lớn nhất

chiếm 20% tổng sản lượng citrus của thế giới, tiếp theo là Mỹ chiếm 14%, Trung

Quốc chiếm 12% và Mexico chiếm 6% (FAO, 2004)

Diện tích trồng citrus ở bang Florida (Mỹ) là 342.041 ha, Sao Paulo (Braxin)

là 338.000 ha Nước nhiệt đới trồng nhiều cam quýt là Mexico, riêng bang Veracruz

đã trồng 70.700 ha Mexico nằm ở 10 – 24o vĩ Bắc tương tự Việt Nam và là nước có sản lượng quả có múi xếp thứ 5 trên thế giới (Hà Thị Thúy, 2005)

Sản xuất quả có múi vẫn đang tiếp tục tăng do thu nhập của người dân ở một

số quốc gia tăng nhanh như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nga, các nước Đông Âu, Ấn

Độ, các nước ASEAN Ngoài ra, người tiêu dùng có nhu cầu tăng sử dụng quả có múi do giá trị dinh dưỡng cao và tiện lợi

Nhìn chung, trên thế giới, hàng năm, việc sản xuất và tiêu thụ quả có múi nói chung, trong đó cam quýt nói riêng đều tăng đáng kể, đặc biệt là phục vụ cho nhu cầu ăn tươi Vì vậy, việc đầu tư nghiên cứu để nâng cao năng suất, chất lượng quả phục vụ cho chế biến và ăn tươi là vô cùng cần thiết

2.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi ở Việt Nam

Ở nước ta, trong số các loại cây ăn quả, cây ăn quả có múi đứng thứ 2 sau chuối về tầm quan trọng và ý nghĩa kinh tế Diện tích trồng cây ăn quả có múi ở nước ta tăng nhanh Năm 1990 cả nước có 19.062 ha cam quýt với sản lượng

119.238 tấn (Vũ Công Hậu, 1996) Năm 2005, diện tích trồng đã tăng lên 108.700

ha với sản lượng 775.500 tấn (Tổng cục thống kê, 2005)

Tuy nhiên tăng trưởng về diện tích và sản lượng cây ăn quả có múi chưa bền vững, sản xuất còn manh mún, tự phát, chưa có quy hoạch tổng thể và định hướng lâu dài Sản xuất có chiều hướng bấp bênh do bệnh dịch và cơ cấu giống chưa ổn định Diện tích trồng mới tăng nhanh, nhưng diện tích phá đi hàng năm cũng không nhỏ (Đỗ Năng Vịnh, 2008)

Cây ăn quả có múi là cây ăn quả lâu năm, chu kỳ kinh tế dài, tận dụng được đất đai và cho năng suất khá cao Theo tác giả Ngô Hồng Bình: Cây ăn quả có múi

có giá trị kinh tế cao hơn một số cây ăn quả khác ở nước ta, hiệu quả của cây có múi

ở vùng đồng bằng Sông Cửu Long đối với cam là 59 triệu đồng/ha, quýt là 46 triệu đồng/ha, bưởi là 17 triệu đồng/ha.Diện tích trồng cây có múi ở Đồng bằng Sông Cửu Long có hơn 40000ha, chiếm hơn 60% tổng diện tích trồng cây có múi trong

cả nước và là loại cây ăn trái có diện tích lớn nhất ở ĐBSCL.Mặc dù sản lượng xuất khẩu còn thấp so với các loại cây ăn trái khác vì chất lượng không cao nhưng nhu cầu tiêu thụ cho thị trường nội địa lại rất lớn và ổn định nên mặc dù bị ảnh hưởng nặng lề do bệnh vàng lá gân xanh gây ra trong những năm gần đây nhưng nhà vườn vẫn tiếp tục duy trì và phát triển loại cây ăn trái này

Quả có múi, đặc biệt là cam, quýt, bưởi có giá trị dinh dưỡng cao, hương vị thơm ngon, phù hợp với thị hiếu của người tiêu dùng Thành phần dinh dưỡng trong thịt quả tươi bao gồm đường saccaroza, lipit, protein, axit hữu cơ và đặc biệt rất giàu vitamin C Ngoài giá trị dùng cho ăn tươi, cam quýt còn được dùng để chế biến Người ta có thể chế biến ra nhiều loại sản phẩm như nước ép, nước giải khát,

đồ hộp, mứt, rượu,… từ loại quả này Vỏ quả, lá, hoa, hạt có thể được dùng để tách chiết tinh dầu trong công nghệ thực phẩm và mỹ phẩm Trong đông y, vỏ quả, lá, rễ

có thể dùng làm thuốc trị ho, cảm cúm hoặc làm nguyên liệu trong nhiều bài thuốc dân gian…

Cam, quýt ở Việt Nam chủ yếu sử dụng để ăn tươi và hiện tại sản suất của nước ta vẫn chưa đủ để cung cấp cho thị trường trong nước Một vài năm gần đây

đã có một số công ty như Hoàng Gia, Đông Nam đã bắt đầu những hoạt động như đầu tư sản xuất, áp dụng các biện pháp quản lý chất lượng theo GAP, đăng ký thương hiệu một số giống quả có múi ngon, đặc sản ở nước ta như Năm Roi, Da Xanh, Phúc Trạch vv… với mục đích xuất khẩu ra thị trường nước ngoài.

Các giống cây ăn quả hiện trồng ở nước ta, trong đó có nhiều giống truyền thống như bưởi Năm Roi, Phú Trạch, Da xanh, Đoan Hùng, Diễn và nhiều giống cam quýt khác đang trồng như cam Sành (Hà giang, Tuyên Quang), cam Xã đoài (Nghệ An), cam Vân du (Thanh hoá); quýt vàng vỏ giòn, quýt chum (Hà giang) vv Tuy nhiên, các giống này phần lớn đều có nhiều hạt đã làm giảm chất lượng quả và khó có thể xuất khẩu ra một số thị trường khó tính như Mỹ, Nhật Bản và Châu Âu,

vì thế cần thiết phải tìm cách làm cho quả của các giống này không hoặc có ít hạt

Trong số các giống đang trồng hiện nay có một số giống có tính vô phối không hạt như Satsuma B.S (Mỹ), Cam Navel (Mỹ), giống Persian lime (Mỹ), các giống này nếu trồng cách ly thì hoàn toàn không có hạt, nếu trồng xen với giống khác thì có ít hạt đến không hạt như giống Persian lime, chúng đều có đặc điểm bất dục đực, do hạt bị teo đi hoặc không có khả năng nẩy mầm (Đỗ Năng Vịnh và cộng

sự 2005) Cũng theo nhóm tác giả Đ.N Vịnh còn phát hiện một số giống trong điều kiện trồng cách ly và trồng xen đều có ít hạt như giống cam Hamlin có 2,0 - 2,8 hạt/quả, cam Valencia Olinda (2,0 - 3,2 hạt/quả), cam Đường canh (2,0 – 5,96 hạt/quả) Trong điều kiện trồng xen bưởi Năm Roi có trung bình 0,4 hạt/quả, cam Sông con có 2,5 hạt/quả và quýt Chum có 6,2 hạt/quả Rất tiếc các giống trên đều

có nguồn gốc từ nước ngoài, vào Việt nam chưa thích ứng tốt và cho năng suất thấp

do tỷ lệ đậu quả thấp, nếu được chuyển gen sản sinh auxin hoặc phản ứng auxin đặc thù bầu nhụy vào sẽ có khả năng cho năng suất cao hơn và trong tương lai sẽ được trồng mở rộng ra sản xuất hơn

Nghiên cứu chọn tạo giống cam quýt không hạt ở Việt Nam chủ yếu theo con đường tìm kiếm các đột biến tự nhiên và nhập nội giống từ nước ngoài như đã trình bầy ở trên Gần đây nhất một Việt kiều Úc đã nhập được một số giống cam quýt không hạt, đang trồng thử ở Lâm đồng và cho kết quả khá khả quan Ngô

Xuân Bình trong thời gian học tập tại Nhật bản đã nghiên cứu khá sâu về cơ chế tự

bất hợp ở cây có múi tạo quả không hạt (Bình et al 2001) Công trình này cho

thấy tự bất hợp là do cơ chế ức chế sinh trưởng ống phấn của vòi nhụy được thụ phấn bởi hạt phấn có cùng kiểu alen

Mặc dù đã phát hiện và tuyển chọn trồng một số giống không hạt hoặc có ít hạt ở nước ta nhưng những nghiên cứu về nguyên nhân và tìm cách duy trì hoặc gây t¹o tính không hạt, đồng thời phải tăng năng suất và chất lượng trên các vật liệu vẫn còn khá khiêm tốn hoặc chưa được tiến hành

Viện di truyền Nông nghiệp do PGS.TS Đỗ Năng Vịnh đang chủ trì tiếp tục thực hiện đề tài chọn tạo giống cam chanh quýt bưởi không hạt bằng con đường gây

đa bội rồi từ đó chọn lọc và tạo cây tam bội và đã thu được một số dòng đa bội đang khảo nghiệm, bước đầu cho một số kết quả khá khả quan

Viện nghiên cứu rau hoa quả đã thực hiện đề tài: ‘Nghiên cứu tạo dòng bưởi

diễn và cam xã đoài đa bội bằng xử lý colchicine trong điều kiện in vitro rồi chọn

lọc các dòng đột biến

Trường Đại học Thái nguyên do PGS.TS Ngô Xuân Bình đang thực hiện đề

tài chọn tạo giống cây citrus không hạt bằng gây tạo và chọn lọc các dòng đột biến

bất dục cái, trisomic

Việc nghiên cứu tạo giống cam chanh quýt bưởi bằng chuyển gen sản sinh và phản ứng với auxin nhằm tạo quả không hoặc ít hạt chưa được tiến hành ở Việt

Nam Thực hiện thành công đề tài này trên cây citrus, nhờ sở hữu vector chuyển

gen, sau này có thể mở rộng thí nghiệm chuyển gen ra một số cây ăn quả khác đặc sản của Việt Nam như: na, nhãn, vải, ổi, soài và nhiều cây ăn quả khác Như vậy, tiềm năng ứng dụng của đề tài là rất lớn, có cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn cao

Tóm lại, cây có múi là loại cây ăn quả quan trọng không chỉ về giá trị dinh dưỡng mà cả về hiệu quả kinh tế Việc phát triển trồng cây ăn quả có múi nói chung

và trồng cam quýt nói riêng ở những vùng có điều kiện cũng như bảo tồn và phát triển mở rộng hơn nữa ở các vùng truyền thống là định hướng chiến lược của nhiều địa phương trong cả nước

2.3 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây ăn quả

có múi

2.3.1 Sơ lược lịch sử chọn tạo giống cây ăn quả có múi

Trước thế kỷ 18, chọn giống dựa trên chọn lọc tự nhiên: chọn các con lai và đột biến tự nhiên tốt Nhân giống bằng hạt

Thế kỷ 19, chọn giống vẫn dựa chủ yếu vào điều kiện tự nhiên: chọn các con lai và đột biến tự nhiên tốt Phương pháp ghép mắt và chiết cành trở thành phổ biến trong nhân nhanh các giống tốt

Thế kỷ 20, chọn tạo giống bằng phương pháp lai, đột biến nhân tạo và các kỹ thuật công nghệ sinh học Các phương pháp cơ bản gồm:

Thụ phấn chéo: Cố định các gen quan tâm ở dòng thuần sau nhiều lần tự thụ

- Chọn các đột biến tự nhiên

- Gây tạo đột biến nhân tạo (bằng hóa chất, chiếu xạ, cài gen vào nhiễm sắc thể)

- Các phương pháp công nghệ sinh học như:

+ Dung hợp tế bào trần giữa các kiểu gen khác nhau

+ Chọn giống nhờ sự trợ giúp của dấu chuẩn phân tử

+ Chuyển gen hữu ích

Các nghiên cứu tạo quả không hạt trên thế giới

Hạt là đặc tính khộng mong muốn của nhiều loại quả bởi vì có thể chúng cứng hoặc dai, vị đắng và nhiều hạt còn tích tụ nhiều hợp chất độc hại cho cơ thể con người Hạt và khoảng trống của hạt còn thay thế phần mô quả ăn được Tính không hạt của quả là một đặc tính hấp dẫn ở các loài, cam quýt có số hạt trên quả lớn, xoài có hạt to hoặc như đu đủ và dưa tây có khoảng trống hạt lớn Đối với cà chua thì hạt có ảnh hưởng đến vị quả, hạt nhỏ, cứng khó tiêu hóa cho người và động vật Còn hạt trong quả cây có múi cũng là một đặc tính không mong muốn, làm

giảm chất lượng thương phẩm của quả và tính tiện lợi sử dụng đối với người tiêu dùng và chế biến nước quả Vì thế ngay từ 3000 năm trước công nguyên người Ai

cập và Hy lạp cổ đại đã mong muốn tạo được quả citrus không hoặc có ít hạt

Nghiên cứu tạo cây ăn quả có múi không hạt trên thế giới thường tập trung vào một số hướng chính sau đây:

Chọn lọc các biến dị tự nhiên hoặc gây đột biến bất dục đực, chủ yếu bằng chiếu xạ chồi hay hạt (Deng, 2000) Nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là hầu hết các gen đột biến là lặn, không biểu hiện ra tính trạng ở thế hệ M1 Các gen

này chỉ biểu hiện ở thế hệ M2 mọc từ hạt hoa tự thụ của cây M1 Đối với cây citrus

do giao phấn nên hầu hết các gen đều tồn tại ở trạng thái dị hợp tử do vậy người ta chỉ có thể dễ dàng chọn lọc được các gen trội Vì thế muốn chọn lọc được gen lặn đột biến phải tiến hành tự thụ cây M1 thu lấy hạt, trồng thành đời sau rồi kiểm tra đánh giá các cây về tính trạng mong muốn làm như vậy phải tốn rất nhiều thời gian

và công sức

Một chiến lược tạo giống tam bội bằng dung hợp tế bào trần hoặc lai hữu tính lưỡng bội và tứ bội, tạo giống tam bội không hạt bằng nuôi cấy nội nhũ hạt non (Gmitter và cộng sự, 1990) và dung hợp tế bào trần giữa cây nhị bội với cây đơn bội (Kobayashi và cộng sự, 1997) Thành công của kỹ thuật này phụ thuộc trước hết vào thành công của kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần sau đó là kỹ thuật chọn lọc tế bào dung hợp tam bội có đặc điểm mong muốn

Tạo cây tứ bội bằng xử lý đột biến in vitro bằng colchicine, rồi lai cây nhị

bội với cây tứ bội sau đó cứu phôi có thể tạo cây tam bội Tuy nhiên phương pháp này gặp một số khó khăn do: 1) Thiếu nguồn gen các giống tứ bội có khả năng phối hợp cao để lai với cây nhị bội cho con lai tam bội không hạt, năng suất cao và chất lượng tốt, 2) Các phôi tam bội hình thành sau khi lai thường bị kìm hãm phát triên bởi mối bất hòa giữa nội nhũ và phôi, để phá vỡ mối bất hòa thì cần phải tiến hành

kỹ thuật cứu phôi non tam bội in vitro 3) Cây tam bội thường cho nhiều quả nhỏ,

dễ bị rụng hàng loạt nên thường cho năng suất thấp (Gmitter, 1995)

Như vậy các phương pháp gây và chọn lọc tạo cây cam quýt không hạt khác nhau, mỗi phương pháp do có ưu và nhược điểm riêng xét theo khả năng và thời gian thành công, biểu hiện của tính trạng thu được và giá trị sử dụng của vật liệu chọn giống tạo thành Vì thế cần xây dựng một phương pháp nhằm tạo nhanh các giống cam quýt không hạt trên cơ sở sử dụng các giống vô phối hoặc một phần có tính vô phối, đang trồng phổ biến và thích ứng tốt.

Tuy nhiên sự hình thành hạt là một quá trình cần thiết cho sự phát triển quả:

sự phát triển của hạt thúc đẩy sự giãn nở tế bào theo hướng tổng hợp auxin và các phân tử chưa biết khác Sự tích lũy các chất chuyển hóa với sự phát triển phôi điều khiển tỷ lệ phân chia tế bào trong mô quả, ngoài ra số lượng hạt phụ thuộc kích thước và trọng lượng cuối cùng của quả Như vậy, tính tạo quả không hạt là hình thành quả được mà không làm thay đổi chất lượng của quả

Thời gian gần đây, các phương pháp biến nạp di truyền được ứng dụng rộng rãi trong các chương trình cải tiến di truyền chi citrus và thay thế các phương pháp chọn giống truyền thống Các nhà khoa học đã đưa ra một đề xuất táo bạo, một hướng nghiên cứu mới nhằm tập trung những cố gắng để tạo ra bằng được quả không hạt, không qua quá trình thụ phấn hoặc thụ tinh tạo thành công nhiều giống dưa hấu không hạt, nho khô không hạt, cà và cà chua không hạt bằng công nghệ chuyển gen và đã chứng tỏ được khả năng của thao tác di truyền để hiện thực mong muốn này (Varoquaux và cộng sự, 2000) Vấn đề cơ bản của công nghệ chuyển gen

là phải làm sao tạo được quả không hạt nhưng vẫn duy trì được sự phát triển của quả một cách bình thường để cho năng suất và chất lượng tốt

Quy luật trong tự nhiên đó là thường quá trình phát triển của quả luôn gắn liền với việc tạo hạt, không kết hạt thì quả không phát triển được, làm cho quả bị thui hay bị rụng Quá trình có thể tóm tắt xẩy ra như sau: hoa được thụ phấn, sau đó

là quá trình thụ tinh xẩy ra, tạo nên hợp tử, từ đó hạt được hình thành, hạt sinh ra hấp thụ và kích thích bầu nhuy phát triển thành quả Sơ đồ dưới đây nêu quá trình phát triển của quả hạt bình thường và các hướng chiến lược tạo quả không hạt

Trong tự nhiên có hai quá trình xẩy ra có thể tạo được quả không hạt đó là:

hiện tượng vô phối hay trinh sản (parthenocarpy) là hiện tượng quả phát triển không cần xẩy ra quá trình thụ tinh vì thế quả không có hạt, trường hợp 2 hạt bị thui trong quá trình phát triển sớm của quả và như thế cũng tạo được quả không hạt hoặc hạt

bị lép và teo đi (stenospermocarpy) Đây là trường hợp tạo quả dưa hấu tam bội không hạt là do trong cây quá trình phân bào giảm nhiễm xẩy ra bất bình thường, còn trong trường hợp ở cây nho là do có một số sai sót nào đó xẩy ra trong quá trình phát triển của nội nhũ dẫn đến làm thui hạt

Hiện tượng vô phối được quan sát thấy ở rất nhiều loài cây trồng trong tự nhiên thí dụ như ở giống quýt Satsuma của Nhật bản, đây là một giống có hạt phấn bất dục do đó quả phát triển được nhưng không có hạt Một giống quýt không hạt khác được phát hiện có tên là Clementine, tính không hạt ở giống này là do tính tự bất hợp của hạt phấn gây nên (Talon và cộng sự, 1992) Tuy nhiên, vấn đề chính quan sát thấy ở nhiều giống có tính vô phối tự nhiên thường là có tỷ lệ kết quả thấp

và kích thước quả nhỏ hơn so với bình thường Vì thế đối với kiểu vô phối ở giống Satsuma thì người ta phải khắc phục bằng cách thụ phấn bổ sung, còn đối với giống Clementine thì người ta phải phun thêm một số chất điều tiết sinh trưởng nhóm gibberellin (GA), cytokinin hay auxin Riêng đối với auxin có vai trò làm tăng kích thước và khối lượng quả Vì thế vấn đề đặt ra đối với cây họ cam quýt là làm sao tạo được quả không hạt bằng cách kích thích tạo tính vô phối mà không cần thụ phấn bổ sung và như thế sẽ không ảnh hưởng đến tỷ lệ đậu quả, kích thước và khối lượng quả

2.3.2 Ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây ăn quả có múi trên thế giới

Người ta đã rất thành công trong kỹ thuật nuôi cấy mô cây thân thảo Nuôi cấy mô cây thân gỗ, trong đó có nhóm cây ăn quả có múi tuy có khó khăn hơn nhiều nhưng đã có nhiều công trình nghiên cứu thành công trên nhiều lĩnh vực khác nhau

Xu hướng phát triển cây ăn quả có múi trên thế giới là sử dụng nhiều phương pháp để phát triển các giống mới Phương pháp lai tạo và ứng dụng công nghệ sinh