Các thí nghiệm được tiến hành đồng thời trên 5 giống nghiên cứu. Các giống tham gia thí nghiệm gồm có: Cam vinh (CV), Cam đường canh (CĐC), QT (Giống Cam trung quốc) , 21 - sông con, Mandarin.5- orange chanh, 8-orange chanh. Đây là các giống Cam ngon và có chất lượng cao đã được cộng nhận trên thị trường.
Môi trường nuôi cấy gồm có: 4,5gMS+ 30g/L saccarose+ 8g Agar+ 500mg Malt ex tract+ 0,1g NAA + 10mg BA ( pha trong 1 lit môi trường ), pH 5.7, môi trường MT, BA, BAP, NAA.
4.3. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp gieo hạt
Hạt được tách từ quả chín, rửa sạch, cho vào dung dịch 0.75% NaOCl rồi lắc trong 15 phút, sau đó rửa bằng nước sạch trong 30 phút đặt trên giấy thấm, để khô tự nhiên trong không khí khoảng 15 - 20h. Cho hạt đóng gói trong túi polyetylen rồi bảo quản lạnh ở nhiệt độ 0 – 30C.
Trước khi tiến hành thí nghiệm, hạt được đưa ra và để ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút, bóc bỏ lớp vỏ bên ngoài sau đó khử trùng bề mặt hạt với dung dịch 0.75% NaOCl + 0.1%Tween 20 trong 10 phút sau đó rửa 5 lần trong nước cất vô trùng hoặc khử trùng bằng dung dịch tạo từ viên sủi khử trùng y tế Johson pha với nông độ dung dịch là 10% thì không cần rửa lại bằng nước cất vô trùng. Gieo một hạt vào một ống nghiệm chứa môi trường MS + 30g/L saccarose + agar, pH. Để trong tối khoảng 2 tuần. Để trong tối 2 tuần giúp cây phát triển nhanh và than vươn dài giúp cho việc nuôi cấy mô được tiến hành nhanh chong ko phải chờ đợi lâu. Sau
độ sáng 16h, nhiệt độ 20 – 260C, ẩm độ 60 – 70 %. Khi chuyển ra phòng nuôi cấy tránh cây tiêp xúc với ánh măt trời mạnh, tránh nhiệt độ quá cao, vì lúc này cây rất yếu và rễ bị tổn thương,
- Phương pháp chuẩn bị mẫu cấy
Lấy đoạn thân epicotyl 1cm làm vật liệu cho biến nạp. Cắt vát 2 đầu và dùng dao khứa tạo lỗ trên mẫu.
- Môi trường đồng nuôi cấy: Mẫu sau khi cho nhiễm khuẩn được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy MS + 30g/L saccarose + 8g agar + 1mg/L BAP, pH 5.7 trong thời gian 3 ngày trong điều kiện tối, rồi chuyển sang môi trường tái sinh chồi.
Các điều kiện nuôi cấy: + Điều kiện nuôi cấy vô trùng + Vô trùng dụng cụ và môi trường
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, các thao tác với mẫu cấy được tiến hành trong buồng cấy vô trùng. Thiết bị này sẽ loại trừ một cách có hiệu quả nguồn vi sinh vật lây nhiễm theo không khí và tạo điều kiện thoải mái cho người sử dụng. Không khí từ bên ngoài khi đi vào buồng cấy sẽ được dẫn qua các màng lọc có kích thước lỗ siêu nhỏ, giúp ngăn chặn hoàn toàn các vi khuẩn và nấm. Vì vậy trước mỗi lần dùng, buồng cấy cần có đèn tử ngoại giúp loại bỏ các nguồn bệnh lây nhiễm trong không khí và trên bề mặt các dụng cụ, thiết bị nuôi cấy. Để vô trùng các dụng cụ và môi trường nuôi cấy, có thể sử dụng một trong các phương pháp sau:
• Khử trùng khô
Phương pháp này chỉ dùng cho các dụng cụ bằng kim loại, thủy tinh và những dụng cụ khác có tính chịu nhiệt (không bị cháy, nóng chảy…). Các dụng cụ trước khi đem sấy phải được gói kín bằng giấy nhôm và chỉ được mở trong tủ cấy vô trùng. Thiết bị dùng để khử trùng khô là lò sấy.
Thời gian khử trùng khô với hầu hết các dụng cụ như sau (Willett, 1998): Thời gian khởi động khoản 60 phút, để cho tất cả các dụng cụ đều đạt được
nhiệt 1800C (3560F).
Thời gian duy trì ít nhất 120 phút mới có thể loại bỏ hết các loại bào tử.
Thời gian giảm dần nhiệt độ, đặc biệt với các dụng cụ thủy tinh, tránh làm giảm nhiệt độ quá đột ngột gây vỡ bình.
• Khử trùng ướt
Là phương pháp hiệu quả và phổ biến trong vô trùng môi trường và các dụng cụ nuôi cấy. Thiết bị được sử dụng là nồi hấp vô trùng, nhiệt độ thường dùng ở 1210C (2500F).
Khử trùng ướt cần lưu ý:
Không khử trùng môi trường nuôi cất với thời gian quá dài, một số thành phần của môi trường sẽ bị phân hủy. Theo Hagel và cộng sự (1991), có khoảng 5% đường saccaroza của môi trường lỏng bị phá hủy khi khử trùng.
Sau khi khử trùng phải giảm áp suất từ từ, giảm nhanh sẽ làm cho chất lỏng trong bình trào lên miệng bình.
• Màng lọc
Dùng để loại bỏ tác nhân gây nhiễm có kích thước 0,025-10µm khỏi môi trường nuôi cấy (môi trường lỏng), nước cất … Đây là phương pháp phù hợp đối với những môi trường mà thành phần của chúng bị phân hủy bởi nhiệt độ cao. Những môi trường đó được lọc vô trùng ở nhiệt độ phòng thí nghiệm qua các màng có lỗ siêu nhỏ.
Có 2 màng lọc phổ biến:
Màng lọc băng thép không gỉ: màng Swinney.
Màng lọc bằng polipropylen: màng Swinnex, đây là loại màng chỉ dùng một lần rồi bỏ.
+ Vô trùng mẫu cấy + Lựa chọn mẫu cấy
Mẫu dùng cho nuôi cấy mô – tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan hay bộ phận của cây: Chồi ngọn, chồi bên, phiến lá,cuống lá… các cấu trúc của
phôi (lá, mầm, trụ lá mầm…); các cơ quan dự trữ (củ, căn hành…). Tùy theo sự tiếp xúc với môi trường mà các mẫu thực vật có ít hay nhiều mầm bệnh (vi khuẩn, nấm).các cấu trúc thực vật được bao kín (lá mầm, phôi, mô thịt trong quả. . . .)thường không chứa hoặc có ít vi sinh vật. Ngược lại, các mô và cơ quan thực vật tiếp xúc với nước, đất như rễ, củ, thân ngầm thường có lượng vi sinh vạt rất cao và rất khó loại bỏ hoàn toàn chúng khỏi nguồn mẫu. Thường phải lấy mẫu ở thời điểm mà cây sinh trưởng và phát triển mạnh nhất: mùa xuân hay đầu mùa hè. Các mùa khác cây mâu sinh trưởng kém hơn, đồng thời mang rất nhiều mầm bệnh.
Tuy mang cùng một lượng thông tin di truyền như nhau nhưng các cấu trúc mô khác nhau trên một cây có thể cho các kết quả phát sinh hình thái khác nhau, với khả năng tạo chồi, rễ hay mô sẹo. . . Vì vậy để chọn mẫu cấy phù hợp, phải căn cứ vào: Trạng thái sinh lý hay tuổi của mẫu, mẫu non trẻ có sự phản ứng với các điều kiện và môi trường nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc biệt là trong nuôi cấy mô sẹo, phôi. Ngoài ra mô non trẻ mới được hình thành, sinh trưởng mạnh, mức độ nhiễm mẫu bệnh ít hơn.
Đối với mẫu cấy từ cây mía (Saccharum oficinarum L.), các nghiên cứu đã cho thấy lá non còn bọc trong bẹ và đòng non là những loại cây phù hợp nhất cho việc tạo mô sẹo và tái sinh cây hoàn chỉnh.
Kích thước và vị trí của mẫu cấy: Kích thước của mẫu ảnh hưởng trực tiếp đến phản ứng của mô với môi trường nuôi cấy. Nhìn chung, mẫu có kích thước càng nhỏ càng khó nuôi cấy. Thường trên cây mẫu có vị trí cao sẽ có ít mầm bệnh hơn.
Chất lượng cây cho mẫu: Lấy mẫu từ cây có nhiều đặc điểm ưu việt mà ta quan tâm: sinh trưởng và phát triển mạnh, chống chịu tốt với các điều kiện bất thuận (hanh, lạnh, mặn) hoặc sâu bệnh, cho sản phẩm và chất lượng ngon của quả hạt. . . S
Mục đích và khả năng nuôi cấy: Để phục vụ cho nhân giống vô tính, thường chọn chồi ngọn, chồi bên (chồi muộn). Nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy phôi: có thể sử dụng lá mầm, trụ lá mầm, thân, lá, phôi. . . Để thu cây đơn bội phục vụ cho lại tạo giống: dùng bao phấn và hạt phấn cho nuôi cấy.
Phụ thuộc vào mẫu có nuôi cấy thành công hay không? Nếu nuôi cấy mô sẹo hay nuôi cấy phôi không thể thực hiện được với một số đối tượng nào đó thì phải chuyển sang chọn đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy.
- Phương pháp vô trùng mẫu cấy
Phương pháp phổ biến trong vô trùng mẫu cấy hiện nay lá sử dụng hóa chất có khẳ năng tiêu diệt vi sinh vật. Hiệu quả diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian, nông độ sử lý và khẳ năng xâm nhập của chúng vaò các ngõ ngách trên bề mặt mẫu cấy. Để tăng tính linh động của các hóa chất diệt khuẩn, Người ta thường sử dụng các chất làm giảm sức căng bề mặt như tween 20, tween 80 , fotoflo, teepol. . . hoặc mẫu cấy có thể sử lý phối hợp
Với cồn 70%. Một hóa chất được chọn trong quá trình vô trùng phải đảm bảo hai thuộc tính: Có khẳ năng diệt vi sinh vật tốt và không hoặc có mức độ độc thấp đối với mẫu thực vật. Trong các loại hóa chất trên, NaOCl2 và Ca(OCl)2 hay được dùng hơn cả vì chúng có mức độ độc tính thấp đối với mẫu, không có biểu hiện ức chế sinh trưởng. Dung dịch NaOCl thương mại chứa 5% NaOCl hoạt tính. Khi sử dụng ở hàm lượng 10 – 20% sẽ có 0,5 – 1,0% NaOCl. Ca(OCl)2 thường ở dạng bột, pha xong cần phải lọc trước khi sử dụng.
Dung dịch NaOCl và Ca(OCl)2 cần chứa trong những bình có nút thật kín. Theo thời gian, các dung dịch đó sẽ tách ra khí Cl2 dẫn đến làm giảm hoạt tính của chúng.
Ngoài những hóa chất nói trên, có thể dùng thêm chất kháng sinh cho vô trùng mẫu cấy. Hai chất kháng sinh hay được sử dụng là gentamixin và ampixilin (50 – 100mg/l). Sau khi xử lý với các hóa chất, mẫu thực vật được ngâm vào các dung dịch có chứa kháng sinh trong khoảng 30 phút sẽ tăng đáng kể hiệu quả của quá trình vô trùng mẫu cấy.
Trong thời gian xử lý, mẫu cấy phải ngập hoàn toàn trong hóa chất diệt nấm, khuẩn. Đối với những mẫu quá bẩn, cần rửa kỹ mẫu dưới vòi nước chảy, sau đó có thể rửa lại bằng nước cất. Trước khi đưa mẫu vào môi trường nuôi cấy cần loại bỏ những phần mẫu bị giập, hỏng do quá trình thao tác gây ra.