TẠO và TINH SẠCH KHÁNG THỂ THỎ ĐẶC HIỆU FcγNGƯỜI CỘNG HỢP FITC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN & NGUYỄN THỊ HUYỀN NGỌC TẠO TINH SẠCH KHÁNG THỂ THỎ ĐẶC HIỆU FcγNGƯỜI CỘNG HỢP FITC Chuyên ngành: Sinh Học Thực Nghiệm (hướng Hóa Sinh) Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.Nguyễn Lê Trang THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2010 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, nhận nhiều giúp đỡ, động viên thầy cô, gia đình, bạn bè Đầu tiên, Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Nguyễn Lê Trang, thầy hết lòng hướng dẫn, bảo, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình thực đề tài Thầy người dạy cho cách nhìn sống, học tập, nghiên cứu; động viên lúc khó khăn sống Tôi cảm thấy may mắn hạnh phúc thầy hướng dẫn, dạy Tôi xin chân thành cảm ơn GS Phạm Hoàng Phiệt, thầy tạo điều kiện thuận lợi, để thực hoàn thành đề tài phòng Y Sinh Học trường ĐH Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Tôi xin cảm ơn tới thầy cô phòng Y Sinh Học, khoa Miễn Dịch Sinh Lý Bệnh, đặc biệt em cảm ơn Cô An, Chị Thanh, Chị Chi Lan, Chị Tuyết người động viên em trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn chị ThS DS Nguyễn Thị Nguyệt Thu toàn thể phòng Miễn dịch học, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh Các chị tạo điều kiện thuận lợi để thực đề tài Tôi xin cảm ơn bạn lớp cao học K15, cảm ơn Châm, Hải, Quỳnh Hương, chị Tuyết Hương, Chiêu người động viên giúp đỡ tôi gặp khó khăn Cám ơn bạn Trần Thanh Phong, Mai Quốc Khánh giúp đỡ, động viên Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình nguồn động viên lớn Con xin cảm ơn Ba, Mẹ, người mong muốn có kết tốt học tập sống Mục lục MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN VỀ SINH HỌC CỦA KHÁNG THỂ 2.1 Lịch sử phát kháng thể 2.1.1 “Viên đạn thần” miễn nhiễm dịch thể 2.1.2 Kỹ thuật điện di cho biết kháng thể protein globulin γ 2.1.3 Xác định cấu trúc phân tử kháng thể 2.1.3.1 Cấu trúc ba chiều tổ chức thành vùng phân tử IgG 10 2.1.3.2 Cấu trúc không gian biểu vị 15 2.1.3.3 Tính đặc hiệu lực cận vị biểu vị 16 2.1.3.4 Các loại KT thể 19 2.2 Sự phát triển tế bào bạch huyết B 20 2.2.1 Các tế bào bạch huyết B 21 2.2.2 Các vật liệu di truyền KT hoạt động chúng 22 2.2.2.1 Các gen chuỗi nặng chuỗi nhẹ 22 2.2.2.2 Cơ chế tổ chức, xếp gen chuỗi nặng chuỗi nhẹ 24 2.2.3 KN đặc hiệu hoạt hóa nhân dòng 29 2.2.4 Tế bào B có hoạt động thực bào hỗ trợ tế bào T 34 2.3 Kháng thể đa dòng 38 2.3.1 Ái lực KT KN số cân 39 2.3.2 Tạo kháng thể đa dòng theo lý thuyết thực tế 40 2.3.3 Kháng thể đa dòng nghiên cứu sinh học ứng dụng chẩn đoán 47 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 49 3.1 Vật liệu 49 3.1.1 Động vật thí nghiệm huyết 49 3.1.2 Hóa chất 49 3.1.3 Trang thiết bị 55 Mục lục 3.2 Phương pháp 56 3.2.1 Tinh IgGngười từ huyết 56 3.2.2 Tạo kháng nguyên Fcγ người 57 3.2.3 Tạo kháng huyết thỏ 60 3.2.4 Tạo cột sắc ký lực gắn IgG người Fcγ người 64 3.2.5 Tinh chế kháng thể thỏ đặc hiệu Fcγngười 65 3.2.6 Cộng hợp kháng thể thỏ với FITC 66 3.2.7 Phương pháp xét nghiệm kháng thể kháng nhân – ANA (antinuclear antibody) 68 KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 72 4.1 Nguyên liệu 72 4.1.1 Thu hồi IgGngười từ huyết 72 4.1.2 Tinh Fcγngười 74 4.2 Tạo kháng huyết thỏ 77 4.2.1 Kiểm tra đáp ứng mẫn cảm 77 4.2.2 Thu kháng huyết thỏ 79 4.3 Sắc ký lực để tinh chế IgG thỏ đặc hiệu với Fcγngười 79 4.3.1 Sắc ký lực Sepharose–Fcγngười 79 4.3.2 Sắc ký lực Sepharose – IgGngười 80 4.3.3 Điện di kiểm tra độ tinh KT thỏ sau qua hai cột SKAL 81 4.4 Cộng hợp IgGthỏ đặc hiệu với Fcγngười với FITC 82 4.4.1 Tỉ lệ cộng hợp FITC vào IgGthỏ 82 khángFcg 4.4.2 Kết sử dụng FITC– IgGtho khả chẩn đoán 84 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 85 5.1 Kết luận 86 5.2 Đề nghị 86 PHỤ LỤC i PHỤ LỤC 1: THÔNG TIN BỆNH NHÂN i Mục lục PHỤ LỤC 2: SẮC KÝ ĐỒ SKAL ii PHỤ LỤC 3: CỘNG HỢP FITC v Danh mục Bảng biểu – Hình ảnh DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1: Thành phần gel SDS−PAGE 52 Bảng 3.2: Tương tác phân tử Ig người (thỏ) protein A 58 Bảng 3.3: Quy trình gây miễn nhiễm thỏ 62 Bảng 4.1: Thu hồi IgG từ huyết người lành 72 Bảng 4.2: Kết thu hồi protein sau qua SKL Sephacryl S200 HR 73 Bảng 4.3: Lượng Fcγ người thu hồi 75 Bảng 4.4: Hàm lượng protein thu sau cột sắc ký Sepharose – Fcγngười 79 Bảng 4.5: Hàm lượng protein thu sau cột sắc ký Sepharose – IgGngười 80 Bảng 4.6: Sản phẩm cộng hợp FITC 83 Bảng 4.7: Kết xét nghiệm ANA thuốc thử DAKO 84 Bảng 4.8: Kết xét nghiệm ANA “KT công trình nghiên cứu” 85 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1: Hình Paul Ehrlich & Hata Sahachiro Hình 2.2: Miêu tả thuyết “các nhóm hóa chất” Erhlich Hình 2.3: Hình ảnh điện di huyết người bình thường bệnh nhân u Hình 2.4: “Viên đạn thần” công nghệ nano ứng dụng ngành dược Hình 2.5: Cấu trúc IgG thỏ cho thấy xếp phức tạp liên kết −S−S− chuỗi nặng chuỗi nhẹ 10 Hình 2.6 : Cấu trúc bậc bốn phân tử immunoglobulin 12 Hình 2.7: Vùng siêu biến động (HRVs) chuỗi nặng chuỗi nhẹ 13 Hình 2.8: Các loại lực liên kết KT – KN 15 Danh mục Bảng biểu – Hình ảnh Hình 2.9: Những công trình dùng tia X để xác định cấu trúc chi tiết tinh thể phức hợp cận vị - biểu vị KT kháng lysozyme 17 Hình 2.10: Tổ chức gen lambda kappa người 23 Hình 2.11: Tái xếp, phiên mã, chế biến lại RNA, dịch mã gen kappa 25 Hình 2.12: Minh họa tổ chức gen chuỗi nặng 25 Hình 2.13: Mô hình miêu tả trình tái xếp DNA, trình phiên mã chuỗi H 28 Hình 2.14: Phiên mã chuỗi nặng H 29 Hình 2.15: Hình thái tế bào B 30 Hình 2.16: Siêu biến đổi thể tế bào B hạch ngoại vi 33 Hình 2.17: Tế bào T hỗ trợ hoạt hóa tế bào B 35 Hình 2.18: Tế bào APC trình diện KN cho tế bào T giúp phát triển miễn nhiễm để thích nghi 37 Hình 2.19: APC (tế bào trình diện kháng nguyên) nhận biết MTB (vi khuẩn lao) 41 Hình 2.20: Các TLR phối tử chúng 43 Hình 2.21: Dụng cụ tạo huyền dịch 46 Hình 3.1: Phản ứng hóa học protein thạch CNBr hoạt hóa 64 Hình 3.2: Cấu trúc phân tử FITC 67 Hình 3.3: Nguyên lý miễn dịch huỳnh quang 69 Hình 3.4: Tấm kính sử dụng cho hóa mô miễn dịch 70 Hình 4.1: Sắc ký đồ Sephacryl S200 HR 73 Hình 4.2: Kết điện di SDS-PAGE 12% IgGngười 74 Hình 4.3: Kết điện di tinh chế Fcγ người gel SDS – PAGE 12% 76 Danh mục Bảng biểu – Hình ảnh Hình 4.4 : Đáp ứng với KN Fcγ người HT thỏ sau mẫn cảm 78 Hình 4.5: Kiểm tra hiệu giá huyết thỏ Fcγ người sau đáp ứng mẫn cảm 78 Hình 4.6: Điện di KTthỏ (qua SKAL) 82 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ANA :Kháng thể kháng nhân (Antinuclear antibody) APC :Tế bào trình diện KN (Antigen Presenting Cell) APS :Ammonium persulfate CDR :Đoạn bổ sung định (Complementarity-determining regions) Chuỗi H :Chuỗi nặng (heavy chain) Chuỗi L :Chuỗi nhẹ (light chain) Da :Dalton Dd :Dung dịch ddH2O :Nước cất hai lần (double distilled water) DNA :Deoxyribonucleic acid Đoạn J :Đoạn nối (Join) Đoạn L :Đoạn dẫn đầu (Leader) DTT :Dithiothreitol EDTA :Ethylene Diamine TetraAcetic Acid Fab :Fragment antigen binding (phân mảnh gắn KN) Fc :Fragment crystallisable (phân mảnh kết tinh) FITC :Fluorescein isothiocyante HVR :Vùng siêu biến động (Hypervariable regions) Ig :Immunoglobin (globulin miễn) KDa :Kilo Dalton KN :Kháng nguyên KT :Kháng thể MDHQGT :Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp MN :MN NST :Nhiễm sắc thể RNA :Ribonucleic acid S A.S :Dung dịch ammonium sulfate bão hòa (Saturated Ammonium Sulfate – Ammonium sulfate 100%S) SDS :Sodium Dodecyl Sulfate SDS – PAGE :Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Electrophoresis -SH :Sulfhydryl TEMED :N, N, N’, N’– tetramethylenediamine Tris :Tris (hydroxymethyl) aminomethane Vùng C :Vùng ổn định (Constant) Vùng V :Vùng biến động (Variable) β-MeSH :β-mercaptoethanol Gel Kết - Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học A280 = 0,660; A495 = 0,358 - Từ công thức [CT2.1] [CT2.2], ta tính tỉ lệ phân tử FITC/IgG, nồng độ IgG sau: F/P = 2,77 ´ 0,358 = 1,85 0,660 - (0,35 ´ 0,358) Nồng độ IgG (mg/mL) = (0,660 ´ 20) - (0,35 ´ 0,358 ´ 20) = 7,64 1,4 khángFcg Chúng ta 700µl dung dịch cộng hợp FITC– IgGtho có nồng độ protein = 7,6mg/mL, tỉ lệ F/P = 1,85 Tóm lại, trình cộng hợp, sản phẩm thu Bảng 4.6 Bảng 4.6: Sản phẩm cộng hợp FITC Thể tích Nồng độ (µl) (mg/mL) khángFcg IgGtho trước cộng hợp 700 8,8 6,16 khángFcg IgGtho sau cộng hợp 700 7,64 5,38 83 Lượng (mg) Kết - Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học Nhận xét Trước sau cộng hợp có thay đổi nồng độ protein, trình cộng hợp có tủa nên gây phần protein khángFcg 4.4.2 Kết sử dụng FITC– IgGtho khả chẩn đoán Chúng tiến hành làm xét nghiệm bệnh nhân ANA (+), với hai loại “kháng thể DAKO” “công trình này” Đối với “kháng thể DAKO”, nồng độ protein = 3mg/mL, kết xét nghiệm sau: Bảng 4.7: Kết xét nghiệm ANA thuốc thử DAKO HT DAKO DAKO DAKO DAKO DAKO BN (+) 1/20 1/40 1/60 1/80 1/160 1/10 (++++) (++++) (+++) (+) (-) 1/50 (++++) (+++) (+) (-) (-) BN: bệnh nhân dương tính với ANA ++++ : dương tính mạnh +++ : dương tính mạnh ++ : dương tính +/- : không xác định (có vài chỗ ít) - : âm tính Chúng ta thấy, hệ số pha loãng thuốc thử 1/40 phát bệnh (tương đương nồng độ protein = 0,075mg/mL) 84 Kết - Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học Với “kháng thể công trình nghiên cứu”, kết xét nghiệm sau: Bảng 4.8: Kết xét nghiệm ANA “KT công trình nghiên cứu” HT SP SP SP SP BN (+) 1/100 1/120 1/160 1/180 1/10 (++++) (++++) (+++) (++) 1/50 (++++) (+++) (++) (+) SP: kháng thể công trình nghiên cứu (sản phẩm) Với kết này, hệ số pha loãng 1/120 cho phát tốt với bệnh nhân (nồng độ protein = 0,063mg/mL) Sự so sánh sử dụng hai sinh phẩm chứng minh sinh phẩm từ nội lực có khả thay hàng nhập Điều cần thời gian thêm để chứng minh bền bền vững sinh phẩm điều kiện bảo quản sinh phẩm Một nghiên đánh giá giá trị lâm sàng số lớn bệnh phẩm cần tổ chức trước tiếp tục sản xuất sinh phẩm KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ Với mục tiêu, tạo kháng thể thỏ kháng Fcγ người ứng dụng sản phẩm để làm xét nghiệm cho bệnh viện, thực xong đề tài kết khả 85 Kết luận – Đề nghị Luận văn Thạc sĩ Sinh học kháng - Fcg quan Hiện nay, FITC- IgGtho sử dụng bệnh viện Đai học Y Dược song song với thuốc thử ngoại nhập Tổng lượng kháng thể thỏ toàn phần sản xuất 2,8g Trong lượng IgG thỏ này, theo hai kết tinh qua sắc ký lực, lượng kháng thể thỏ đặc hiệu với Fcγngười lên đến 0,78g (> 27,8 %) Tạo sinh phẩm kháng thể thỏ đặc hiệu Fcγngười sử dụng kháng thể toàn phần kháng thể 100% đặc hiệu, tùy theo mục đích kỹ thuật sử dụng cuối So với lượng cần thiết cho chẩn đoán bệnh phẩm, hai lượng kháng thể nêu lớn Điều cho thấy rõ ý nghĩa công nghệ sinh học với đáp ứng nhu cầu để phục vụ cho ngành Y tế 5.1 Kết luận - Từ 100mL hỗn hợp huyết người lành lượng IgG người thu 435mg - Từ IgG người, phần Fcγ tách tỉ lệ thu hồi chiếm 1/3 lượng IgG ban đầu - Fcγngười IgGngười sử dụng tạo giá sắc ký lực để tinh chế IgG thỏ đặc hiệu - Ba thỏ sử dụng để tạo kháng huyết thanh; Fcγngười sử dụng làm KN Ba thỏ đáp ứng tổng lượng kháng huyết thỏ thu nhận 500mL IgG thỏ tách 2,8g - Tỉ lệ IgG thỏ đặc hiệu xác định Lượng IgG thỏ đặc hiệu với Fcγngười sản xuất ước tính 700-900mg - IgG thỏ đặc hiệu dùng chế tạo cộng hợp IgG-FITC, đạt tỉ lệ F/P=1,8 - Sinh phẩm huỳnh quang sử dụng phát KT tự miễn bệnh nhân 5.2 Đề nghị 86 Tài liệu tham khảo Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tài liệu tham khảo Tiếng Việt [1] Vũ Triều An, Jean Claude Homberg, Miễn dịch học, NXB Y học, Hà Nội, 2001 [2] Hứa Thị Ngọc Hà , Huỳnh Ngọc Linh, Ứng dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch chẩn đoán giải phẫu bệnh, tạp chí Y học, 1997 [3] Đỗ Ngọc Liên, Thực hành hóa sinh miễn dịch, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, 2004 [4] Nguyễn Ngọc Lanh, Văn Đình Hoa, Sinh lý bệnh Miễn dịch (phần miễn dịch học), NXB Y học, Hà Nội, 2007 [5] Phạm Hoàng Phiệt, Nguyễn Lê Trang, Tạo KT thỏ kháng Fcg người – Báo cáo nghiệm thu –Sở Khoa học Công nghệ, thành phố Hồ Chí Minh, 2010 [6] Nguyễn Lê Trang, Miễn nhiễm học – giáo trình biên soạn cho lớp cao học, 2009 Tiếng Anh [7] Amersham Biosciences , Affinity Chromatography – Principles and Methods., 2002 [8] Charles A.Janeway JR, Paul Travers, Mark Walpork, Mark J.Shlomchick, Immunobiology 5th, Garland Publishing, NY, 2001 [9] Christof M Niemeyer, Bioconjugation Protocol Strategie and Methods (Methods in molecular Biology Volume 283), Humana Press, Totowa, NJ., 2004 [10] Current protocols in Immunologly (1999), chapter 1, chapter Tài liệu tham khảo Luận văn Thạc sĩ Sinh học [11] D M Weir MD, L A Herzenberg, Caroline Blackwell, Leonore A Herzenberg, Immunochemistry 4th Edition, Blackwell scientific publication, 1986 Chapter 12, pp1-41 [12] Davide J Holme & Hazel Peck, Analytical Biochemistry, 3rd, Prentice Hall, 1997 [13] E W Silverton, Manuel A Navia, and David R Davies.(1997), Threedimensional structure of an intact human Ig, Vol 74, No 11, pp 5140-5144, P.N.A.S US, 74:5140 [14] Ed M Manson, Immunochemical Protocol (methods in molecular biology, Vol 10), Humana Press, 1992 [15] Edwin S Van Amersfoort, Theo J C Van Berkel, and Johan Kuiper., Receptors, Mediators, and Mechanisms Involved in Bacterial Sepsis and Septic Shock Clinical Microbiology Reviews, p379-414, Vol 16, No.3, July 2003 [16] Gabriel Virella, Medical Immunology, 5th, Marcel Dekker, Inc., NY, 2001 [17] J Kindt, Barbara A Osborne, Rhichard A Goldsby, Kuby Immunology 4th , W.H Freeman, 2000 [18] J Koolman and K H Roehm, Color Atlas of Biochemistry, 2nd, Thieme, 2005 [19] J W Pralhl and R R Portert, Allotype-Related Sequence Variation of the Heavy Chain of Rabbit Immunoglobulin G, Biochem J., 107, 1968 [20] Jeremy M Berg, John L Tymoczko, Lubert Stryer, Biochemistry 5th, W H Freeman, 2001 [21] Kiyoshi Takeda and Shizuo Akira, Toll-like receptors in innate immunity, International Immunology, pp – 14, Vol 17, No 1, 2005 [22] Köhler, G., and Milstein, C Continuous cultures of fused cells Secreting antibodies of predefined specificity, Nature, 256; 495, 1975 Tài liệu tham khảo Luận văn Thạc sĩ Sinh học [23] Lorette C Javois, Immunocytochemical Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology)1st, Humana Press, Totowa, NJ., 1994 [24] Lorraine C Prefferkorn, Jan G J Van de Winkel, and Sharon L Swink, A novel role for IgG – Fc Transductional potentiation for human high affinity Fcγ receptor (FcγRI) signaling, The journal of biological chemistry., Vol 270, 14, 1995 [25] M A Hayat, Microscopy Immunohistochemistry and Antigen Retrieval Method (For light an Electron Microscopy), Kluwer academic publisher, 2002 [26] Nisonoff, A., Wissler, F.C., Lipman, L.N & Woernley, D.L (1960) Arch Biochem Biophys 89, 230-244 [27] Porter R.R, Structural studies of Immunoglobulins, Nobel lecture, Dec 12, 1972 [28] Porter R.R., Nobel lecture, Biochem J.73, 119, 1959 [29] R Suenaga & N I Abdou, Cationic and high affinity serum IgG anti-dsDNA antibodies in active lupus nephritis, Clin Exp Immunol, 94, 1993 [30] Sidonia Mihai, Cassian Sitaru, Immunopathology and molecular diagnosis of autoimmune bullous diseases, J Cell Mol Med., Vol 11, 3, 2007 [31] Somatic Generation of Immune Diversity, Nobel Lecture, December 8, 1987 [32] Wu T.T and Kabat E.A., An analysisof the sequences of the variable regions of Bence-Jones proteins and myeloma light chains and their implications for antibody complementarity J exp Med , 1970, 132, 211 Tài liệu tham khảo Tài liệu từ Internet [33] http://www.bio.davidson.edu/ [34] http://www.nature.com [35] http://pathmicro.med.sc.edu [36] http://pathmicro.med.sc.edu/mayer/gen [37] http://www.pathologyoutlines.com/ [38] http://www.pdb.org [39] http://ro.uow.edu.au/theses/757/ [40] http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages [41] http://www.wikipedia.com Luận văn Thạc sĩ Sinh học Kết luận – Đề nghị Luận văn Thạc sĩ Sinh học - Vì thời gian thực đề tài hạn chế, sinh phẩm đạt yêu cầu cần đánh giá hiệu ứng dụng qua nghiên cứu lâm sàng cụ thể - Vì ứng dụng kháng thể kháng Fcγ người rộng rãi nên việc sử dụng để tạo nhiều dạng sinh phẩm cộng hợp khác ví dụ cộng hợp enzym, avidin, để có xét nghiệm xác áp dụng rộng rãi 87 Phụ lục Luận văn Thạc sĩ Sinh học PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: THÔNG TIN BỆNH NHÂN STT Mã BN Tuổi Giới tính 2.1042 53 2.1044 46 2.1046 23 2.1049 36 2.1050 38 2.1052 41 2.1054 54 2.1057 42 2.1058 32 10 2.1059 48 11 2.1060 46 12 2.1061 43 13 4.996 52 14 4.1010 36 15 4.1017 50 16 4.1024 54 17 4.940 51 18 4.952 65 19 4.855 37 20 4.891 48 21 4.898 53 22 4.912 38 23 6.807 48 STT Mã BN Tuổi Giới tính Phụ lục Luận văn Thạc sĩ Sinh học 24 6.825 48 25 6.834 37 26 6.727 19 27 6.736 36 28 6.744 40 29 6.754 46 30 6.591 57 31 6.607 54 32 6.624 51 33 6.656 68 34 2.530 70 35 2.599 52 36 2.586 38 37 2.480 55 38 2.495 72 39 2.496 59 40 2.374 34 41 2.434 26 42 2.436 46 Ghi chú: – thứ hai – thứ – thứ 1– Nữ 0– Nam PHỤ LỤC 2: SẮC KÝ ĐỒ SKAL Sắc ký lực Agarose - protein A A280 Phân đoạn Phân đoạn Phụ lục Luận văn Thạc sĩ Sinh học 14 12 10 0 10 15 20 25 30 35 40 -2 Sắc ký lực cột Sepharose – Fcγ người A280 14 Phân đoạn Phân đoạn 12 10 Rửa giải -2 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Ống/1mL Phụ lục Luận văn Thạc sĩ Sinh học Sắc ký lực cột Sepharose – IgGngười A280 12 Phân đoạn 10 Phân đoạn Rửa giải -2 10 20 30 40 50 60 70 Ống/1mL Phụ lục Luận văn Thạc sĩ Sinh học PHỤ LỤC 3: CỘNG HỢP FITC khángFcg Phổ hấp thu bước sóng (250-600) dung dịch FITC- IgGtho Asb 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 250 300 350 400 450 500 550 khángFcg Hình: Phổ hấp thu bước sóng (250-600) dung dịch FITC- IgGtho 600 nm Phụ lục Luận văn Thạc sĩ Sinh học Hình ảnh xét nghiệm ANA Thuốc thử DAKO (pha loãng 1/40) (ANA +) khángFcg Thuốc thử IgGtho PTN sản xuất (pha loãng 1/120) (ANA+) [...]... huyết thanh đặc hiệu với IgGngười làm thuốc thử để thay thế hàng ngoại nhập Khi có kháng huyết thanh thỏ, IgG thỏ được tinh chế và tạo cộng hợp IgG – FITC (flourecein isothicyanate) làm thuốc thử huỳnh quang đặc hiệu với KT người 1 Tổng quan tài liệu Luận văn Thạc sĩ Sinh học 2 TỔNG QUAN VỀ SINH HỌC CỦA KHÁNG THỂ 2.1 Lịch sử về sự phát hiện ra kháng thể 2.1.1 “Viên đạn thần” và miễn nhiễm dịch thể ♦ Tác... trình dùng tia X để xác định cấu trúc chi tiết tinh thể phúc hợp cận vị và biểu vị của KT kháng lysozyme 5 Trích từ: Protein Data Bank (1FYA và 1FYB) Hình 2.9: Những công trình dùng tia X để xác định cấu trúc chi tiết tinh thể phức hợp cận vị - biểu vị của KT kháng lysozyme 17 Tổng quan tài liệu Luận văn Thạc sĩ Sinh học Câu chuyện tìm hiểu về tính đặc hiệu và ái lực trở nên hấp dẫn khi nghiên cứu cho... trong cơ thể hoạt động của các KT và TCR “cùng loại” có đồng hiệu lực Tầm nhìn đó của thuyết mạng lưới miễn nhiễm hoạt động theo tính đặc hiệu với KN nhiễm từ ngoài vào cơ thể đã là một động cơ đã thúc đẩy công trình tạo KT đơn dòng, và những công trình hiện nay về các KT đặc hiệu với cận vị Nói rõ hơn, KT tạo nên với (mang) cận vị làm KN: động vật được tiêm một vật liệu mà chính nó đã sản xuất KT kháng. .. Tính đặc hiệu và ái lực giữa cận vị và biểu vị [1][7][16][17][38] Tuy những liên kết tham gia trong phức hợp KN ≈ KT là yếu nhưng con số của những lực liên kết với bản chất khác nhau không phải là ít Từ sau 1970 đến đầu thế kỷ này, R.J Poljak et al và một số nhóm khác sử dụng phương pháp nhiễu xạ tia X để tìm cách xác định cấu trúc chi tiết trong liên kết giữa KT và KN, ở dạng tinh thể của cộng hợp. .. đó? Từ kháng thể (antibody) sử dụng ngày nay có nội dung kháng là chống lại (anti) và thể có nghĩa là do chính cơ thể (body) sinh ra, tương tự như từ “antitoxin” nêu trên Từ kháng nguyên (antigen) trong đó kháng có nghĩa là KT, nguyên có nghĩa là nguyên nhân làm sinh ra (genere) KT 2.1.2 Kỹ thuật điện di cho biết kháng thể là protein globulin γ [7][7][16][17][22] Gần 40 năm sau khi hóa trị liệu và ý... phân tử KT lại chỉ bắt một KN? Cơ sở của tính đặc hiệu cần được xác minh Và vì sao cơ thể lại có khả năng tạo nên nhiều tính đặc hiệu đến thế? 12 Tổng quan tài liệu Luận văn Thạc sĩ Sinh học Để tìm hiểu những điều đó, Wu và Kabat [32] đã xác định trình tự vùng biến động trên chuỗi nhẹ của khoảng mười hai KT “đơn dòng” người với tính đặc hiệu khác nhau và đã phát hiện, cách tương đối đơn giản sự có... nhà khoa học này tạo nên đã được gọi là chất kháng độc tố” (antitoxin) Erhlich đã nhận thấy các huyết thanh tạo nên ở động vật chỉ trung hòa riêng biệt tác nhân đã sử dụng để tạo được tính miễn nhiễm, đặc tính mà sau này được gọi là tính đặc hiệu của huyết thanh; đặc tính phản ứng đó của huyết thanh được Erhlich quan niệm là tương đương với đặc tính thấy ở các phản ứng của các hóa chất và các màu nhuộm... cách chi tiết hơn và đặc biệt ở dạng nguyên, phải cần đến các phương pháp hóa lý Vào những năm sau 1970, những kỹ thuật dùng tia X để xác định cấu trúc tinh thể trong thế liên kết giữa KT với những đoạn peptide giới hạn đã được thực hiện; tiếp theo đó và còn tiếp tục hiện nay hai kỹ thuật khác cũng đã tham gia là kỹ thuật cộng hưởng từ hạt nhân (NMR, nuclear magnetic resonance) và cộng hưởng spin điện... gắn liền cách đặc hiệu KT với KN Ô 5 nêu lên vùng đặc biệt của lysozyme trứng gà đã gây nên sự đáp ứng của hệ miễn nhiễm tạo ra KT đặc hiệu (KT D1.3, đã sử dụng ở các hình trên); điều chi tiết quan trọng trong hình này nêu lên là nhóm glutamine 121 lồi ra trên bề mặt của biểu vị, nhóm gln này nằm xen kẽ giũa hai vùng biến động VH và VL của hai chuỗi nặng và nhẹ thấy ở bốn ô trên Phức hợp giữa Fab KT...Đặt vấn đề Luận văn Thạc sĩ Sinh học 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Phương pháp tạo nên kháng thể (KT) đặc hiệu với một cấu trúc mong muốn ngày càng trở nên phổ biến để có thuốc cho các xét nghiệm hoặc điều trị Tại phòng xét nghiệm tại Bệnh viện Đại học Y Dược tp HCM, đòi hỏi phải có KT súc vật đặc hiệu với KT người (IgGngười) để xác định sự có mặt của KT kháng nhân (antinuclear antibody - ANA) ở huyết thanh bệnh nhân ... người 64 3.2.5 Tinh chế kháng thể thỏ đặc hiệu Fcγngười 65 3.2.6 Cộng hợp kháng thể thỏ với FITC 66 3.2.7 Phương pháp xét nghiệm kháng thể kháng nhân – ANA (antinuclear antibody)... chế tạo Fcγngười sử dụng KN, dùng để gây miễn dịch cho thỏ để có kháng huyết đặc hiệu với IgGngười làm thuốc thử để thay hàng ngoại nhập Khi có kháng huyết thỏ, IgG thỏ tinh chế tạo cộng hợp. .. qua hai cột SKAL 81 4.4 Cộng hợp IgGthỏ đặc hiệu với Fcγngười với FITC 82 4.4.1 Tỉ lệ cộng hợp FITC vào IgGthỏ 82 khángFcg 4.4.2 Kết sử dụng FITC IgGtho khả chẩn đoán 84 KẾT LUẬN