2. TỔNG QUAN VỀ SINH HỌC CỦA KHÁNG THỂ
2.3. Kháng thể đa dòng
2.3.2. Tạo kháng thể đa dòng theo lý thuyết và thực tế
Muốn thực hiện tạo kháng huyết thanh đa dòng, ta cần phải làm rõ một số điểm:
Œ Gây mẫn cảm: Lần đầu tiên KN được đưa vào cơ thể động vật có mục đích là giao KN cho các tế bào mang chức năng trình diện KN tiếp nhận. Các tế bào này có mặt ở những vùng dưới da để giám sát khuẩn thường xâm nhập vào cơ thể;
từ đó khi có nhiễm, chúng nhận biết, báo động và xử lý khuẩn. Để báo động,
chúng tiết ra những tín hiệu để chuẩn bị đáp ứng của các tế bào bạch huyết T và B trú ngự ở các hạch bạch huyết ngoại vi ở gần vị trí nhiễm.
• Các cytokines: Các tín hiệu (như trên vừa đề cập) đó là các cytokines, để tạo phản ứng viêm ở vị trí nhiễm và để máu chuyển các cytokines tín hiệu đến các tế bào bạch huyết. Vấn đề là nhiều KN không có khả năng hoạt hóa các tế bào trình diện kháng nguyên để chúng tiết ra các cytokines cần thiết đó. Đặc biệt, khi muốn tạo đáp ứng dịch thể sản xuất kháng huyết thanh, các cytokines cần thiết đã được xác định là IL-2, IL-4, INF-g , như nêu trên Hình 2.18. Hình 2.19 minh họa sơ đồ một tế bào thuộc loại đại thực bào hay tế bào tua (macrophages, dendritic cells), nhận biết khuẩn lao.
Hình 2.19: APC (tế bào trình diện kháng nguyên) nhận biết MTB (vi khuẩn lao) Ž Các thụ quan cảm nhận trên các tế bào trình diện kháng nguyên.
Trên bề mặt của các loại tế bào trình diện kháng nguyên này (APCs, Antigen presenting cells), có những loại thụ quan (TLRs, toll like receptors) để cảm nhận sự hiện diện của vi sinh gây bệnh, Hình 2.19 cho thấy vi khuẩn lao (MTB, Mycobacterium tuberculosis); khi có liên kết giữa một TLR với khuẩn, TLR truyền tín hiệu nhiễm tới cho một phân tử tiếp nhận gọi là ‘myeloid differention factor 88’ (MyD88), phân tử này là cần thiết cho các đáp ứng miễn qua trung gian tế bào Th1 (xem Hình 2.17). Các tế bào APCs cũng có thể gây đáp ứng một cách độc lập đối với phân tử tiếp nhận MyD88, qua trung gian của các tế bào Th2.
Chuột đã bị loại gen biểu hiện phân tử MyD88 (chuột MyD88-/-) đã được sử dụng để chứng minh những điều đó. Trên các APCs, gần đây nhiều loại thụ quan cảm nhận TLRs đã được phát hiện, với tính đặc hiệu cho những loại phân tử khác nhau của vi sinh.
Hình 2.20 (A) cho biết về sự biểu hiện của chín loại TLR trên năm loại tế bào miễn nhiễm, điều nhận ra là các tế bào T biểu hiện ít nhất và các bạch cầu đơn nhân nhiều nhất. Các TLRs có mặt trên nhiều loại tế bào khác trong cơ thể cũng đã được phát hiện. Các protein nhận dạng vi sinh này đã được phát hiện trước từ lâu trên côn trùng (Drosophila melanogaster – Ruồi giấm) và đã được gọi là Toll. Các gen biểu hiện các protein thụ quan này ở người cũng đã được xác định, và nhận thấy chúng được bảo tồn khá tốt từ con ruồi đến con người, do đó chúng được gọi là Toll Like Receptor ở động vật hữu nhũ.
Hình 2.20 nêu lên các cấu trúc nhận biết của các TLRs ở động vật hữu nhũ.
Các TLRs trên bề mặt tế bào nhận biết vật liệu phổ biến bên ngoài, trên vỏ các vi sinh gây bệnh, thường nhiễm ngoại bào. Còn thêm các TLRs gắn ở màng của các bọng nội bào (endosome) lại nhận biết vật liệu di truyền của các vi sinh nhiễm nội bào, đặc biệt các virút ký sinh trong tế bào. TLR9 (nay cũng được gọi là CD 289) cảm nhận sự có mặt của trình tự dinucletide CpG không methy hóa, phổ biến hơn ở vi sinh vật, rất ít khi tìm thấy trên động vật.
Những điều vừa trình bày cho thấy vai trò tiếp quản thiết yếu của các tế bào có chức năng trình diện kháng nguyên cho các tế bào bạch huyết trong đáp ứng miễn nhiễm, cần lưu ý để thành công tạo tính miễn bảo vệ hay để tạo kháng thể cho các mục đích mong muốn (điều trị gây miễn nhiễm thụ động, làm thuốc thử…).
Hình A: Bảy loại TLR trên một số loại bạch cầu
(aDữ liệu từ tài liệu tham khảo số 219 [15]; b Tất cả các mức độ trong vòng một loại tế bào liên quan đến mức độ cao nhất của sự hiện diện TLR cho từng loại tế bào đặc trưng. Trong số các loại tế bào được liệt kê, tế bào T được biểu hiện thấp nhất và monocyte thì cao nhất.)
Hình B: Các TLRs trên bề mặt tế bào nhận dạng khuẩn nhiễm ngoại bào; ở trong tế cũng có những TLRs để phát hiện sự nhiễm nội bào, chúng nhận dạng cấu trúc của axít nhân, đặc biệt cấu trúc của CpG không mang nhóm methyl
Hình 2.20: Các TLR và phối tử của chúng
• Thực nghiệm và kinh nghiệm
Đã từ lâu trước khi những cơ sở sinh học vừa nêu được phát hiện, rất nhiều qui trình gây miễn theo thói quen của thực nghiệm đã được thực hành cách phổ biến,
(A)
(B)
dùng nhiều súc vật thí nghiệm để chọn những con có đáp ứng cao, rồi loại bỏ các con có đáp ứng kém hay không có đáp ứng, cách phung phí và….
Một phương pháp gây miễn có uy tín là phương pháp đã sử dụng Mycobacterium tuberculosis làm một tá chất, luôn đem lại thành công ít nhiều trong việc tạo đáp ứng miễn nhiễm. Điều đã được các chuyên gia miễn nhiễm học công nhận là không có tá chất nào có hoạt động tá chất cao hơn tá chất Freund toàn phần, trong đó có vi khuẩn lao. Các chuyên gia này cũng khuyến cáo phải kiên nhẫn nếu muốn thành công, tuy chưa khi nào nghe đề cập về sự trưởng thành ái lực và sự chọn dòng tế bào của kháng nguyên.
Một vi khuẩn gây bệnh khác là Bordetella pertussis, vi khuẩn gram âm, cũng đã được nhận thấy có khả năng mẫn cảm mạnh đại thực bào qua trung gian của TLR4, làm tiết ra nhiều TNF-a (tumour necrosis factor alpha), cytokine này có hoạt tính làm phát triển nhanh đại thực bào, các bạch huyết bào T và B, có hoạt tính gây viêm cao, tạo thuận tiện cho sự di chuyển các tế bào tham gia trong đáp ứng chống nhiễm ở giai đoạn mẫn cảm.
Trình bày những điều trên để làm rõ cơ sở sinh học cần dựa vào trong các bước thực hành tạo kháng huyết thanh.
Một điều trong thực hành mang tính kinh tế cần nói rõ ngay là phải bảo đảm thành công việc gây mẫn cảm các tế bào trình diện kháng nguyên, nếu không hoạt hóa được các tế bào APCs, không nên tiếp tục sử dụng con vật, làm trì trệ công việc, tổn phí thời gian và phương tiện. Nếu các tế bào APCs không được hoạt hóa, các tế bào bạch huyết đặc hiệu với kháng nguyên không bao giờ nhân dòng và phát triển thể. Cụ thể, sau lần tiêm tăng cường (sẽ đề cập ngay sau đây) thứ nhất 12 ngày, nếu không phát hiện được kháng thể đặc hiệu ở nồng độ đáng kể, không nên tiếp tục; vào thời điểm đó chỉ 40 ngày sau gây mẫn cảm, so với đến lần đầu tiên thu hoạch kháng huyết thanh, phải nuôi con vật đến bốn tháng trở lên. Không nên chờ đến lúc đó mới loại bỏ con vật do nó không cho kháng huyết thanh như yêu cầu.
Trên súc vật thí nghiệm, để đạt kết quả tốt nhất, cần thực hiện đúng, tôn trọng một số điểm.
* Giai đoạn gây mẫn cảm (priming): do tế bào T không bao giờ trực tiếp giao tiếp với kháng nguyên, nhưng các tế bào bạch huyết đặc hiệu chỉ được hoạt hóa do kháng nguyên ở dạng biểu vị, do các tế bào APCs của cùng cơ thể xử lý và chọn lựa để trình diện; trong thực hành tế bào cần lưu tâm khi đưa kháng nguyên vào cơ thể con vật là các tế bào giám sát ở ngoại vi.
Liều kháng nguyên : 20 - 100mg kháng nguyên protein /1kg thỏ. Tùy theo khả năng sinh đáp ứng miễn của kháng nguyên. Với kháng nguyên ở dạng tinh chế, 100mg/kg động vật là đầy đủ, không nên vượt quá liều (loại khả năng gây dung nạp).
Kháng nguyên được hòa tan trong nước muối sinh lý hoặc đệm 10 mM phosphate pH 7,2 vô trùng. Liều kháng nguyên được hòa trong 1mL dịch là phù hợp.
Tá chất Freund toàn phần, cùng một khối với dịch kháng nguyên, trộn thành huyền dịch “nước trong dầu”. Để tạo huyền dịch, hai ống bơm chứa dung dịch kháng nguyên và dịch dầu tá chất được đâu chắc chắn vào nhau qua một ống nối (Hình 2.21); hai dung dịch được trộn với nhau bằng cách bơm qua bơm lại nhiều lần; do phải chảy qua một ống nhỏ nên hai dịch được trộn thành huyền dịch; khi đạt được huyền dịch cần thiết, bơm trở nên khó, đẩy mạnh mà dịch không qua nhanh được.
Hình 2.21: Dụng cụ tạo huyền dịch
Tiêm: Do tá chất Fruend toàn phần có M. tuberculosis, để tránh tạo granuloma hay áp xe tại chỗ làm loét da, phải giới hạn khối lượng tiêm ở mỗi vị trí, <50mL cho mỗi mũi tiêm, thành nhiều mũi (>40 mũi nếu khối phải tiêm là 2mL) gần các hạch ngoại vi, tức theo hai, ba hàng trên lưng dọc hai bên cột sống và phía trong các đùi gần háng. Tiêm một liều khoảng 108 xác B. Pertussis (đã bất hoạt) ở phía trong háng của một trong hai chân sau; liều khuẩn gram âm này cộng hưởng với lực tá chất của vi khuẩn lao.
* Gây tăng cường: Sau khi đã hoạt hóa các tế bào APCs, các tế bào này chỉ cần khoảng 4 – 5 ngày sau, đã thực hiện xong việc hoạt hóa các tế bào bạch huyết T và B đặc hiệu với các biểu vị trình diện. Các tế bào bạch huyết biệt hóa nhân dòng làm tăng lên dân số, phát triển và đi vào hoạt động. Gây tăng cường không cần đến các vi khuẩn tá chất như ở lần đầu. Gây tăng cường cũng còn được gọi là gây nhắc lại, có nghĩa là đưa kháng nguyên vào một lần nữa cho các tế bào APCs để chúng trình diện cho các tế bào T và B; nhưng lần này các tế bào B cũng có thể trực tiếp nhận dạng kháng nguyên. Điều cần lưu tâm ở giai đoạn này là: có nên hoạt hóa toàn bộ các dòng tế bào T và B đặc hiệu đã phát triển không ? Trong giai đoạn phát triển thể của các tế bào bạch huyết, điều tích cực là sự hình thành các tế bào có cận vị có tính đặc hiệu và ái lực trở nên tốt hơn đối với biểu vị của chúng.
Trong góc nhìn thực hành, phải tác động để hoạt hóa làm nhân dòng tiếp các dòng tế bào bạch huyết có ái lực tốt này và tránh hoạt hóa các dòng tế bào có ái lực kém, không để các tế bào có ái lực kém có cơ hội được biểu vị của chúng hoạt hóa tiếp. Biện pháp thực hành có thể thực hiện là giảm liều kháng nguyên xuống tối thiểu. Do đó vào lần tiêm tăng cường thứ ba trở đi, nên giảm bớt liều kháng nguyên xuống 1/2 và tiếp theo 1/4 và giữ ở liều lượng này mỗi lần tiêm tăng cường.